Поиск Кабинет

Использование пуповинной крови при проведении аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у детей (опыт работы Московского банка стволовых клеток)

Гены & Клетки: Том V, №2, 2010 год, стр.: 29-35

 

Авторы

Шаманская Т.В., Астрелина Т.А., Подколзина ЭА, Карпова Е.Э., Лебедева ЛЛ., Скоробогатова Е.В., Паина О.В., Яковлева М.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В статье представлены данные по трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСЮ единиц пуповинной крови (ПК), заготовленных в Государственном Учреждении Здравоохранения «Банк стволовых клеток департамента здравоохранения г. Москва». За период с августа 2006 г. по август 2009 г. было выполнено 1В трансплантаций детям с онкогематологическими и неонкологическими заболеваниями. Медиана числа ядросодержащих клеток на кг веса реципиента составила 6,0x107 (разброс 0,2—21,5), CD34-положительных клеток — 7,7х105 (разброс 0,5—40). Приживление трансплантанта было зарегистрировано у 9 пациентов (56,25%). Медиана времени до приживления нейтрофилов составила 24 дня (разброс 15—36 дней). Острая реакция трансплантат против хозяина (РТПХ1 I— II степени развилась у 7 (43,75%) пациентов, случаев развития тяжелой РТПХ отмечено не было. Проявления хронической РТПХ выявлены у 1 (6,25%) пациента. Смертность к 100 дню после трансплантации составила 28,5%. Общая выживаемость составила 56, 2%, с медианой наблюдения 116 дней. Результаты настоящего исследования показывают, что ГСК ПК является альтернативным источником стволовых клеток (СЮ для проведения трансплантации у больных с онкологической и неонкологической патологией.

Пуповинная кровь (ПК), представленная для использования некоммерческими государственными и коммерческими криобанками, в настоящее время является альтернативным источником гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), применяемых для трансплантации у детей и взрослых при ряде злокачественных заболеваний, синдромах недостаточности костного мозга, гемоглобинопатиях и некоторых генетических метаболических расстройствах[1, 2]. За прошедшее десятилетие во всем мире увеличилась роль криоконсервации ПК и ее применения для трансплантации. Мировая ассоциация доноров костного мозга (World Marrow Donor Association — WMDA) собирает информацию о числе заготовленных единиц пуповинной крови банками ПК (ВПК) по всему миру начиная с 1999 г. На 2008 г. WMDA сообщает о деятельности 112 банков ПК, которыми заготовлено более 450 тыс. единиц ПК. По данным этой организации в 2006 г. 20% аллоген-ных неродственных трансплантаций было выполнено только за счет ГСК ПК[3]. На настоящий момент в мире выполнено более 10 ООО трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) с использованием ПК[4]. Это говорит о том, что ПК является ценным клеточным ресурсом особенно для тех пациентов, которым не был найден совместимый донор костного мозга (КМ).

Наряду с закладкой и хранением неродственных образцов пуповинной крови, ряд трансплантационных центров выступают с предложением адресного хранения, когда старший ребенок в семье, возможно, будет нуждаться в будущем в ТГСК.

Проведение государственной программы по развитию банков ПК в России привело к созданию ряда государственных учреждений по криозаготовке ПК и ее дальнейшему применению при неродственной ТГСК. Первые банки ПК в России появились в 2003 г.

Существующие в России некоммерческие банки имеют пока только государственное финансирование на уровне субъектов Федерации. Основным документом, регламентирующим деятельность банков ПК в РФ, является Приказ Минздрава № 325 от 25.07.2003 г. «О развитии клеточных технологий в Российской Федерации», содержащий ряд требований и норм для работы банков ПК.

В 2005 г. в Росси была выполнена первая успешная трансплантация образца ПК, сохраненного в Гемабанке (Москва). Ребенку 5 лет с диагнозом: нейробластома забрюшинного пространства IV стадия с поражением костного мозга и лимфатических узлов забрюшинного пространства, средостения, над- и подключичной области слева — последовательно проведена трансплантация ГСК ПК и периферических стволовых клеток от родственного частично- совместимого донора. Образец ПК от сиблинга содержал 0,44x108 ядросодержащих клеток (ЯСК)/кг веса реципиента и 0,16х108/кг CD 34+ клеток, отмечалось полное совпадение по II классу. (И.С. Долгополов, Н.Н. Субботина, В.К. Бояршинов и др.).

К настоящему времени в России действуют три публичных донорских банка: Государственное учреждение здравоохранения «Банк стволовых клеток департамента здравоохранения г. Москвы» (ГУЗ «БСК ДЗМ»), Поволжский банк гемопоэтических клеток (г. Самара), Банк стволовых клеток (г. Казань).

По распоряжению правительства Москвы с 2005 г. в городе начало свою работу Государственное учреж- дение здравоохранения «Банк стволовых клеток департамента здравоохранения г. Москвы» (ГУЗ «БСК ДЗМ») по заготовке единиц ПК и их дальнейшему использованию в клинической практике. Учреждение соответствует всем требованиям по техническому оснащению и использует в своей работе современные технологии обработки и криоконсервации ПК. В своей работе ГУЗ «БСК ДЗМ» опирается на требования, изложенные в «Международных стандартах сбора, обработки, тестирования, хранения, отбора и выдачи ПК», разработанных и учрежденных сетью некоммерческих общественных банков пуповинной крови NetCord и FACT (Accreditation of Cellular Therapy).

Сбор пуповинной крови

Сбор ПК для ГУЗ «БСК ДЗМ» осуществляются в 5 родильных домах г. Москвы, имеющих письменное соглашение с ВПК, разрешение со стороны органов здравоохранения и с участием только обученного персонала. ВПК также предоставляет наборы для сбора пуповинной крови врачам, работающим в других медицинских учреждениях, так как нашим банком поддерживается программа сбора и персонифицированного хранения пуповинной крови от сибса, родившегося в семье, где есть потенциальный реципиент ГСК.

Пуповинную кровь получали при физиологических и оперативных родах доношенных новорожденных (37^ 41 нед. гестации) с учетом наличия информированного согласия матери и отсутствия стандартных противопоказаний. После пережатия и пересечения пуповины, производили пункцию сосудов пуповины специальной системой для забора ПК, содержащей 35,5 мл антикоагулянта CPDA-1. Сбор крови осуществляли в течение 2—15 мин. после родов. В случае сбора крови после отделения плаценты, плацента помещалась в специальную стерильную стойку и проводилась аналогичная процедура сбора ПК. Полученный материал хранили в темном месте при комнатной температуре и подвергали анализу не позднее 18 ч после процедуры сбора ПК.

Перед сбором ПК у женщины собирали анамнез на предмет раннее перенесенных трансмиссивных инфекций (вирусные гепатиты, ВИЧ, сифилис и т.д.) и отсутствие в семье генетических заболеваний, отсутствие тяжелых соматических заболеваний и акушерской патологии. Обычно все женщины перед поступление в роддом были уже обследованы на HBsAg, сифилис и ВИЧ-инфекцию.

Противопоказаниями для сбора ПК считали:

1) наличие носительства и установленных инфекционных заболеваний, в том числе ВИЧ-инфекция, гепатиты, сифилис и заболевания, передающиеся половым и гемотрансмиссивным путем;

2) генетические заболевания;

3) наследственные и врожденные патологии, в т.ч. патологии кроветворной и иммунной систем;

4) психические заболевания;

5) онкологические заболевания, в том числе в стадии ремиссии;

6) применение цитостатических и тератогенных средств во время беременности;

7) наркомания и токсикомания;

8) переливание крови и ее компонентов в течение последних 12 мес.;

9) лечение иглоукалыванием, выполнение пирсинга и татуировок в последние 12 мес. перед родами;

10) постоянное отстранение от донорства;

11) отказ матери.

Процесс перевозки ПК от родильного дома до ВПК был организован таким образом, чтобы сохранить пуповинную кровь неповрежденной, а также обеспечить необходимую безопасность для персонала. Транспортировка происходит в термоконтейнере, который позволяет обеспечить стабильную температуру ПК на уровне от +16 до +24°С на протяжении более 3 ч.

При поступлении в банк ПК проводилась регистрация, первичный осмотр и отбраковка образцов до начала их обработки, основным критерием являлся «чистый» вес ПК не менее 65 г. Образцы с весом более 125 г делились на 2 мешка в условиях ламинарных шкафов и обрабатывались как индивидуальные образцы (в дальнейшем они будут указаны как деленные образцы).

Процессинг, тестирование, регистрация

Мешки с цельной пуповинной кровью поступали в регистратуру с обязательным наличием сопроводительных документов: сопроводительный лист, информированное согласие на забор пуповинной крови и лист анамнеза матери. В регистратуре каждый из них взвешивался, рассчитывался его «чистый» вес (без тары и без антикоагулянта), производился внешний осмотр на герметичность, наличие свертков, гемолиза и др., по результатам которого определяется возможность обработки данного образца. Каждому образцу, подлежащему обработке, присваивается индивидуальный порядковый номер и штрих-код. Вместе с рабочим листом образец передавался в «чистое» помещение, где переносился в ламинарный шкаф, в котором производилась вся дальнейшая работа с образцом.

Обработка ПК, начатая не позднее 24 ч от момента забора, производилась методом двойного центрифугирования и/или в закрытой системе на аппарате «Sepax S100», Biosafe, Switzerland в «чистом» помещении под ламинарным потоком воздуха для уменьшения до стандартного объема 21 мл.

Перед замораживанием единиц ПК брались пробы на определение общего количества ЯСК, CD34+ клеток, колониеобразующей активности, группы крови и резус-принадлежности. В обязательном порядке проводилось тестирование на наличие бактериальной контаминации (включая аэробы и анаэробы). Для образцов, сохраняемых в банке для внутрисемейного пользования, при наличии положительных бактериальных тестов, определялась в обязательном порядке чувствительность к антибиотикам.

Каждый образец ПК также проходил исследование на наличие вируса иммунодефицита человека, гепатитов В и С, сифилиса, CMV-инфекции и др.

Конечный продукт подвергался заморозке в криопакете в условиях программного замораживателя «BioArchive®», ThermoGenesis, USA. Автоматизированная система позволяет минимизировать температурные изменения и включает электронную идентификацию замороженных образцов.

Вся информация об образце ПК после проведения исследований была сопоставлена и оценена, и только после этого проводилось HLA-типирование по I и II классу.

После проведения обработки и получения всех результатов тестирования полученная информация просматривалась медработником для оценки пригодности единицы ПК для хранения в банке.

На конечный продукт ПК заводился паспортный лист, с указанием идентификационного номера, штрих-кода образца, количества ЯСК, CD34+ и колониеобразующих единиц, с пометками об отрицательных результатах микробиологического и вирусологического тестирования образца и наличия HLA-типирования. Все документы на образцы ПК, хранятся в архиве (на бумажных и электронных носителях).

С 2005 г. по октябрь 2009 г. в ГУЗ «БСК ДЗМ» было обработано 3950 единиц ПК, заложено на хранение 2655 единиц.

Трансплантация ПК ТГСК ПК, выданных ГУЗ «БСК ДЗМ», проводились в двух центрах: в отделении трансплантации ФГУ ФНКЦ ДГОИ Росздрава и в Институте детской гематологии и трансплантологии им. P.M. Горбачевой (ИДГТ) Санкт-Петербургского Государственного медицинского университета М3 и СР РФ им. акад. И.П. Павлова.

Подбор образца ПК для ТГСК осуществляется после получения запроса из трансплантационного центра с указанием истории болезни реципиента, результатов HLA-типирования. Единая форма запроса на поиск донора ПК, была разработана и принята к использованию в ГУЗ «БСК ДЗМ».

При подборе образца пуповинной крови обращалось внимание на совпадение по антигенам системы HLA и количество ЯСК в единице ПК.

Отбор и выдача образцов ПК четко регламентированы в соответствующих документах, подготовленных в ГУЗ «БСК ДЗМ». Протокол каждого поиска в соответствии с пришедшими запросами и результаты подбора доноров ПК хранятся в банке, для чего разработаны и используются готовые электронные системы, способные осуществить поиск по заданным характеристикам.

Выдача образца ПК осуществляется при наличии письменного запроса из трансплантационного центра за подписью лечащего врача и руководителя учреждения.

К образцу ПК, выданному для трансплантации, прилагаются:

— информация об общем числе ЯСК в конечном продукте;

— общее число С034-позитивных клеток и(или) общее количество гемопоэтических колониеобразующих единиц в конечном клеточном продукте;

— данные анамнеза семьи донора (для выявления риска передачи генетических заболеваний);

— группа крови по системе АВО и резус-фактор;

— результаты исследования крови матери и единицы ПК на вирус иммунодефицита человека, HBsAg, HCV, и др.;

— результаты бактериологического исследования ПК;

— предоставляется вся информация о любых отклонениях, возникших при заборе, обработке, хранении единицы ПК;

— протокол изъятия концентрата стволовых клеток ПК из криохранения в связи с передачей в трансплантационный центр, где содержится следующая информация — номер и штрих-код образца ПК, название трансплантационного центра, дата закладки и дата изъятия образца из криохранилища, личность курьера.

Транспортировка замороженного образца жестко регламентируется. Она должна осуществляться в максимально сжатые сроки при температуре не выше -135°С. Транспортировка осуществляется с соблюдением норм пересылки контейнеров, содержащих жидкий азот, а контейнеры должны обеспечивать сохранение температуры в течение не менее 48 ч свыше ожидаемого времени прибытия образца крови в трансплантационный центр.

При условии использования образца ПК для родственной или неродственной трансплантации в БСК предоставляется информация о клинических особенностях процедуры (наличие нежелательных проявлений, связанных с инфузией ПК, если они были), данные о приживлении трансплантата, сроках восстановления уровня нейтрофилов и тромбоцитов, показателях хи-меризма и наличия/отсутствия реакции трансплантат против хозяина (РТПХ). Полученные данные хранятся как на бумажных носителях, так и заносятся в электронную базу. Данные актуализируются по мере необходимости, но не реже 1 раза в год. Характеристика пациентов

За период с августа 2006 г. по август 2009 г. для проведения трансплантации было выдано 29 единицы ПК. ТГСК ПК была выполнена 16 пациентам: 10 (62,5%) трансплантаций проведено в отделении трансплантации ФГУ ФНКЦ ДГОИ Росздрава, 6 (37,5%) — в ИДГТ г. Санкт-Петербурга.

Распределение по полу пациентов выглядело следующим образом: 14 мальчиков и 2 девочки. Соотношение М:Д равно 7:1. Медиана возраста на момент проведения ТГСК составила 2,5 года (разброс от 4 мес. до 20 лет).

В 10 (62,5%) случаях ТГСК проводилась по поводу злокачественного, в 6 (37,5%) — по поводу незлокачественного заболевания.

Характеристика пациентов, исходы ТГСК ПК представлены в таблице. Перед проведением трансплантации ПК использовались различные режимы кондиционирования. Выбор режима кондиционирования определялся диагнозом пациента, статусом по основному заболеванию (ремиссия/ отсутствие ремиссии) на момент проведения ТГСК и протоколами, принятыми в трансплантационном центре.

6 (37,5%) пациентов получили по одному образцу ПК, 3 (18,75%) больных — по два образца ПК от одного донора (деленный образец), 4 (25%) — по два образца ПК от разных доноров, и 3 (18,75%) — по три образца ПК (два от одного донора (деленный образец) и третий от другого).

ТГСК ПК от родственного НLA-идентичного донора выполнены у 2 (12,5%) пациентов. Один из пациентов с диагнозом мукополисахаридоз I типа, у которого было констатировано приживление ГСК ПК, жив. Второй умер от прогрессии основного заболевания (ювенильный миеломоноцитарный лейкоз, ЮММЛ), при исследовании химеризма на 46 день 90% клеток имели собственное происхождение.

У 1 (6,25%) больного с ранним изолированным тестикулярным рецидивом острого лимфолейкоза (ОЛЛ) выполнена ТГСК двух образцов ПК от родственного и неродственного донора (совпадения по HLA 8/10 в обоих образцах). При исследовании химеризма гемопоэтических клеток на 15-е сут. 60% клеток имели донорское происхождение (родственный образец ПК), больной умер от рецидива заболевания через 40 сут. с момента проведения трансплантации.

В 13 (81,25%) случаях была проведена неродственная ТГСК ПК.

У 10 пациентов, которым была проведена ТГСК одной единицы ПК (или 2 единиц ПК от одного донора — деленный образец), оценено количество несовпадений по системе HLA. Полное совпадение по HLA антигенам (10/10) было только у 4 (40%) пациентов, в остальных 6 (60%) случаях отмечалось несовпадение по 1 или 2 антигенам.

2 (12,5%) больным была выполнена гаплоидентич-ная трансплантация с котрансплантацией ГСК ПК.

2 (12,5%) пациентам с мукополисахаридозом I типа и миелодиспластическим синдромом (МДС) была выполнена ТГСК ПК с введением мезенхимальных стволовых клеток. В обоих случаях на 31.08.2009 г. пациенты были живы.

Медиана числа ядросодержащих клеток и CD34+ клеток на килограмм массы тела реципиента составила 6,0x1О7 (разброс 0,2^21,5) и 7,7x10s (разброс 0,5^40) соответственно.

Результаты

Приживление трансплантата было зарегистрировано у 10 (62,5%) пациентов. Медиана времени до приживления нейтрофилов составила 24 дня (разброс 15^ 36 дней).

Частичное приживление отмечено у двух (12,5%) пациентов, неприживление — у 4 (25,0%) больных.

Из группы пациентов, у которых отмечено полное приживление, на момент 31.08.2009 г. 7 больных живы, что составило 43,75% от всех больных, получивших трансплантацию ПК. Полное совпадение по HLA-системе (6/6 или 10/10) из этой группы пациентов отмечено у 3(42,85%), в одном случае имела место трансплантация ПК от сибса. Остальные больные получили по несколько образцов ПК от разных доноров со степенью несовпадения по HLA-системе 8/10 и 9/10.

Из 10 больных, у которых было отмечено приживление нейтрофилов, 2 умерло от рецидива (прогрессии основного заболевания), один погиб от инфекционных осложнений.

Из двух случаев частичного приживления оба пациента умерли (рецидив заболевания, отторжение трансплантата), совпадение по системе HLA было в 1—2 локусах.

Из 4 пациентов с первичным неприживлением трансплантата 2 умерли (прогрессия основного заболевания, сепсис).

Общая смертность к 100 дню после трансплантации составила 28,5%. Общая выживаемость была равна 56,2%, с медианой наблюдения 116 дней.

Острая РТПХ I—II степени развилась у 7 (43,75%) пациентов, случаев развития тяжелой РТПХ отмечено не было. Проявления хронической РТПХ выявлены у 1 (6,25%) пациента (распространенная форма с поражением кожи и легких).

Обсуждение

После появления первых публикаций об успешном проведении ТГСК ПК в конце 80-х гг. XX в., начали свое развитие первые ВПК[5]. Первым государственным банком был ВПК при Нью-Йоркском центре крови (New York Blood Center, NYBC), организованный в 1988 г. под руководством П. Рубиншейна (P. Rubinstein)[6]. После учреждения большого количества ВПК во всем мире возникла необходимость в обмене информацией. Это привело к созданию в 1998 г. системы, объединяющей некоммерческие общественные банки ПК, находящиеся на территории США, Европы, Израиля, Японии, Австралии (NETCORD). Целью ее создания было формирование интернационального регистра для обмена информации между банками ПК, а также разработка нормативных требований к аспектам деятельности ВПК (стандарты сбора, обработки, тестирования, хранения, отбора и выдачи единиц ПК)[7].

В настоящее время в Европе 18 банков пуповинной крови получили аккредитацию в NetCord-FACT и еще 40 находятся на стадии регистрации[8]. Также существуют два крупных международных регистра доноров ПК. Это, прежде всего, NetCord, который содержит информацию только о донорах ПК, и международный регистр доноров КМ (Bone Marrow Donors Woldwide, BMDW), содержащий информацию и о донорах костного мозга, и о донорах ПК.

Центры трансплантации начинают поиск пуповинной крови таким же образом, как при подборе доноров КМ, и, как только получают положительную информацию о подборе, связываются непосредственно с Банком пуповинной крови.

За период с августа 2006 г. по август 2009 г. для проведения трансплантации ГУЗ «БСК ДЗМ» было выдано 29 единицы пуповинной крови, что составило 1,1 % от всех образцов находящихся на хранении в БСК. Этот показатель ниже, чем сообщается в других исследованиях. Для сравнения, публичный банк пуповинной крови Мексиканского института социального обеспечения (Mexican Institute of Social Security Cord Blood Bank, IMSS-CBB) выдал для трансплантации 5% единиц пуповинной крови от всех заготовленных[9], 3,6% было выдано в банке пуповинной крови Гуаньджоу, Китай[10]. Одной из причин столь низкого процента выданных банком (ГУЗ «БСК ДЗМ») образцов пуповинной крови является низкая трансплантационная активность в России, что связано как с недостаточным количеством специализированных клиник, так и низким числом ежегодно производимых трансплантаций.

Одним из главных преимуществ процесса накопления единиц пуповинной крови — это простота. Сбор пуповинной крови по сравнению с костным мозгом провести легче, процедура эта и для матери и новорожденного безопасная.

ПК является альтернативой для тех пациентов, нуждающихся в трансплантации, которым не был подобран совместимый родственный или неродственный донор КМ, особенно это важно для групп этнических меньшинств. Кроме того, не всегда доноры костного мозга доступны. Так, по данным J.J. Van Rood и М. Oudshomm (2008), за период с 2000 по 2006 г. 151 ООО пациентам был подобран неродственный донор и только в 64 720 случаях трансплантация была проведена[11].

Другим важным преимуществом ПК является более короткое время, необходимое для поиска подходящего донора, особенно это важно для тех пациентов, которые нуждаются в проведении трансплантации в течение 3 мес. после проведения поиска донора[12].

При сравнении результатов трансплантации ГСК КМ, периферической крови и ПК в зарубежных исследованиях было продемонстрировано длительное время приживления нейтрофилов и тромбоцитов при проведении трансплантации ПК (22^33 дня). В нашем исследовании время до приживления нейтрофилов составляло от 15 до 36 дней, что сопоставимо с зарубежными данными[1, 2].

Количество ЯСК на кг веса реципиента в единице ПК является важным фактором, коррелирующим с результатами трансплантации. В попытке увеличить дозу ЯСК для трансплантации используются две единицы пуповинной крови от разных доноров, в нашем исследовании таких пациентов было 8, что составило 50%. При исследовании химеризма гемопоэтических клеток у этих больных отмечено приживление только одного образца ПК, что соответствует данным литературы[13].

Не менее важным преимуществом трансплантации ПК является более низкая степень развития РТПХ. В нашем исследовании не было ни одного случая развития РТПХ тяжелой степени, и только у одного пациента было отмечено развитие хронической РТПХ[1,2].

И хотя много проблем остается нерешенными, большее количество наблюдений поможет более четко определить достоинства трансплантации ГСК пуповинной крови по сравнению с трансплантацией ГСК костного мозга. Но уже сейчас ясно, что для пациентов, которые не имеют совместимого родственного и неродственного донора КМ, ПК является альтернативным источником стволовых клеток.

Увеличение доступного пула единиц пуповинной крови улучшило бы вероятность обнаружения донора с оптимальным количеством ЯСК на кг веса реципиента и минимальным количеством HLA-несовпадений.

ВПК, выдающие образцы для трансплантации, должны быть инспектированы и аккредитированы в соответствующих органах контроля. Должна существовать ясная политика в отношении селекции доноров ПК, скрининга и тестирования. ВПК должны получать полную информацию о проведенной процедуре трансплантации от соответствующих трансплантационных центров для того, чтобы и в дальнейшем гарантировать безопасность и эффективность проведения данной процедуры.

Подняться вверх сайта