Поиск Кабинет

Использование органотипической культуры сетчатки как модели для исследования миграционной активности трансплантированных клеток

Гены & Клетки: Том V, №2, 2010 год, стр.: 56-61

 

Авторы

Семенова МЛ, Сергеев С.А., Сабурина И.Н., Кошелева Н.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В последние годы накоплен значительный экспериментальный материал в области биологии стволовых клеток и выполнено большое количество клинических работ. Однако все еще остаются открытыми вопросы о взаимодействии трансплантированных клеток с новым микроокружением реципиента и их выживаемости. Нами в качестве модели влияния трофических факторов и трансплантированных клеток на сетчатку была выбрана органотипическая эксплантационная культура сетчатки новорожденной крысы. В первую очередь данный выбор объяснятся сохранностью цитоархитектоники сетчатой оболочки глаза и клеточных взаимосвязей при данном методе культивирования. Кроме того, применение органотипических культур существенно облегчает микрохирургические процедуры введения клеток, давая возможность строго контролировать число и место введения клеток, и визуализации их распространения и выживаемости в сетчатке, позволяет вести прижизненные микроскопические наблюдения с любым интервалом времени и четко контролировать условия выращивания клеток.

В данной работе были использованы прикрепленные культуры сетчатки новорожденных крыс Wistar, служившие моделью развивающейся нейросетчатки. Культивирование -эксплантатов сетчатки проводили в стандартных условиях в модифицированной среде DMEM/F12 с добавлением ростовых факторов, 10% сыворотки и антибиотиков. На 10-е сут. в культуры сетчаток инъецировали ксеногенные клетки мышей линии C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)/0sb/J (мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК), нейральные ство-ловые/прогениторные клетки (НСПК) субвентрикулярной зоны, клетки пигментного эпителия (ПЭ) глаза). Производили прижизненные наблюдения за выживаемостью инъецированных клеток, за их миграцией на различных сроках с последующим иммуногистохимическим окрашиванием на маркеры дифференцировки клеток в глиальном и нейрональном направлениях (GFAP и р-Ш-тубулин соответственно).

Были продемонстрированы достоверные отличия в выживаемости различных типов клеток в новом микроокружении, показана наибольшая миграционная активность ММСК и НСПК в первые часы после инъекции и проанализированы морфологические изменения введенных типов клеток.

Эффективность клеточной и тканевой терапии уже сегодня открывает реальную перспективу широкого применения принципиально новых методов лечения болезней. Однако фундаментальные вопросы о взаимодействии введенных клеток с микроокружением реципиента все еще до конца не понятны. Не ясно и то, что побуждает клетки избирательно мигрировать в области поражения и восстанавливать ткани даже при системном введении в кровоток. И, наконец, остается непонятным, что происходит с клетками и их потомками в тканях реципиента при транспалантации, с какими клетками они устанавливают взаимосвязи и как регулируется их поведение.

На все эти вопросы может помочь найти ответы метод органотипического культивирования. Моделирование в экспериментальных условиях трансплантации стволовых клеток в организм реципиента на примере инъекции этих же клеток в эксплантат in vitro позволит гораздо глубже понять клеточную иерархию в различных тканях и организацию их ниш. Накопление экспериментальных данных в этой области даст возможность значительно продвинуться в понимании функционирования организма на клеточном и субклеточном уровнях, а значит повысить практический выход из экспериментальных работ.

Начиная с 60-х гг. XX века, различные типы клеточных и тканевых культур сетчатки широко используются в нейроофтальмологии как экспериментальные модели развития и патологии сетчатки. В этих исследованиях значительное внимание уделяется органотипическим культурам, основным преимуществом которых является максимальная сохранность цитоархитектоники сетчатки[1 ]. Эксплантаты сетчатки обладают теми же биохимическими и физиологическими особенностями, что и сетчатка in vivo и могут поддерживаться в культуре очень долгое время — от нескольких дней, до месяцев[2] и интенсивно используются для исследования разнообразных клеточных ассоциаций.

Потеря зрения при дегенеративных заболеваниях сетчатки обычно связана с нарушением функции клеток пигментного эпителия сетчатки СПЭJ, Его клетки, содержащие пигмент, секретируют огромное количество ростовых и регуляторных паракринных факторов[3], принимающих активное участие в развитии нервных клеток сетчатки, ее глиальных компонентов и блокирующих прорастание сосудов в нейросетчатку[4].

Нарушения слоя ПЭ приводит к необратимым изменениям в сетчатой оболочке и, следовательно, к частичной, либо полной потере зрения. Клиническими исследованиями доказана возможность трансплантации клеток ПЭ для восстановления зрения[5]. Трансплантация суспензии клеток ПЭ под сетчатку помогает предотвратить разрушение фоторецепторных клеток, гиперваскуляризацию сетчатой оболочки и нормализовать трофику клеток сетчатки.

Кроме того, предотвратить потерю зрения помимо введения клеток ПЭ, позволяет использование стволовых клеток. Подходы, связанные с аутотрансплантацией гемопоэтических или мезенхимных стволовых клеток, уже начинают успешно использоваться в клинических испытаниях для лечения многих заболеваний, в том числе и в офтальмологии. Трансплантация мультипо-тентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) в зоны повреждения различного генеза приводит к значительным улучшениям и ускорению в них процессов репарации и стимуляции трофики ткани. Считается, что при трансплантации в организм реципиента, ММСК заполняют новые ниши и дифференцируются согласно их микроокружению. Это способствует длительному терапевтическому воздействию ММСК на ткань и дает возможность их широкого клинического применения.

Независимо оттого, какая была произведена трансплантация (аллогенная или ксеногенная), судьба введенных стволовых клеток зависит от условий их культивирования, возраста реципиента и локальных свойств ткани, в которые были трансплантированы клетки, то есть зависит от их микроокружения. Поэтому в нашей работе, кроме ММСК, попадающих при трансплантации в сетчатку глаза в новое микроокружение, использовались нейральные стволовые/прогениторные клетки (НСПК). Показано встраивание меченых НСПК во все слои сетчатки и их дифференцировка в астроцитопо-добные клетки, нейроны и олигодендроциты[6]. При введении НСПК супраретинально существенно улучшаются показатели ретинограммы, что свидетельствует о положительном терапевтическом воздействии трансплантированных в сетчатку клеток.

Использование неонатального реципиентного материала позволяет проследить встраивание трансплантированных клеток в уже сформировавшиеся ниши реципиентной ткани, и одновременно произвести анализ их влияния на механизмы поддержания развивающейся сетчатки.

В связи с вышеизложенным, целью нашей работы было следующее: на модели органотипической эксплан-тационной культуры сетчатки исследовать дифферен-цировку трансплантированных клеток в нейральном направлении, а также динамику их миграционной активности при инъекции в эксплантат различных типов клеток (ММСК, НСПК и клеток ПЭ).

Материал и методы

Культуры сетчатки

Источником получения эксплантатов сетчатки являлись новорожденные самцы крыс Wistar. В опыте использовали неонатальных (2-дневных) крыс. Для устранения влияния временного интервала после умерщвления животного, сетчатку выделяли из энук-леированных глаз непосредственно после декапитации при помощи микроинструментов, обработанных 70% этанолом для дезинфекции по протоколу A. Kretz (2007). Эксплантаты промывали раствором антибиотиков и помещали в культуральную чашку с полной питательной средой DMEM/F12 (ПанЭко, С420, С600) и добавлением цитокинов, антибиотиков и 5% эмбриональной телячьей сыворотки.

Культуры клеток для трансплантации

Донорами клеток являлись мыши линии C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)/Osb/J, экспрессирующие маркер EGFP.

Для получения ММСК использовали красный костный мозг EGFP+ мышей месячного возраста. Непосредственно после умерщвления животного производился забор красного костного мозга из большеберцовых и бедренных костей по стандартному протоколу[7].

Культивирование ММСК проводили в среде DMEM/ F12 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, SH30109.03), L-глутамина (Sigma, G-8540), гепарина, фактора роста фибробластов, инсу-лин-трансферрин-селенита и антибиотика (гентамицин).

Для трансплантации стволовых клеток с потенциями дифференцировки в нейрональные и глиальные элементы использовали культуру НСПК EGFP+ мышей. Для перевода в культуру и наращивания НСПК использовали область субвентрикулярной зоны головного мозга новорожденных мышей, которую отделяли от соединительной ткани и других отделов мозга микрохирургическими методами после вскрытия черепной коробки в стерильных условиях. Выделенная область содержит большое количество стволовых и прогени-торных элементов, для выделения которых ее переводили в дезагрегированную культуру посредством механической и ферментативной обработки (трипсин + р-р Версена 10 мин. при +37°).

После получения первичной культуры суспензию НСПК помещали в термостат в культуральной среде DMEM/F12 с добавлением 2% эмбриональной сыворотки коров, L-глутамина, гепарина, фактора роста фибробластов, фактора роста эндотелия, инсулин-трансферрин-селенита, 1М2-добавки и антибиотика (гентамицин).

Помимо стволовых клеток, в работе были использованы высокодифференцированные клетки ПЭ глаз EGFP+ взрослых мышей. После ферментативной обработки трипсином с последующим центрифугированием отделяли клетки ПЭ от остальных типов клеток оболочек глаза. Для обогащения культуры клетками ПЭ перед трансплантацией в эксплантационных культурах сетчатки использовали среду DMEM/F12 с добавлением 5% эмбриональной сыворотки коров, L-глутамина, гепарина, фактора роста фибробластов, |\12-добавки и антибиотиков (гентамицин).

Через каждые трое суток производили смену среды на свежеприготовленную, при необходимости пассировали клетки в смеси растворов трипсина и версена. Перед микроинъекцией клетки доращивали до состояния монослоя. Инъекцию клеток проводили на 3^4 пассажах.

Микроинъекция клеток

Микроинъекцию клеток проводили капилляром из пироксного стекла диаметром 30 мкм под бинокуля-ром Olympus CZX 20 с цифровой камерой DP50 при помощи микроинъекционной приставки в зону разрастания клеток эксплантата в количестве культуральной среды 0,1 мкл на 10-е сут. культивирования эксплантатов сетчатки.

Иммуногистохимия

Для иммуногистохимического анализа использовали anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) (Sigma, G9269) и mouse anti-tubulin, betta III isoform monoclonal antibody (Chemicon, MAB1637). Предварительно образцы отмывали PBS. Общее время инкубации в растворе первичных антител составило 12 ч. На следующий день проводилась окраска вторичными антителами Texas read, Су2.

Анализ на жизнеспособность

Эксплантаты окрашивали йодидом пропидия (PD для выявления погибших клеток (они имели красную окраску, обусловленную проникновением PI в ядра), ядра докрашивали Hoechst 33342, а цитоплазму контрастировали неконъюгированным Fluorescein isothiocyanate (FITC). Живые клетки окрашивались исключительно FITC и Hoechst 33342.

Анализ полученных результатов

Получение прижизненных фотографий клеток и флуоресцентных изображений проводили под инвертированным микроскопом Axsiovert 25 с приставкой mbq 52 ас и цветной камерой DP 500. Анализ фотографий проводился с помощью пакета программ AxioVision 3.1. Также применяли метод конфокальной микроскопии на микроскопе Lieca TCS SPE с программным обеспечением Leica application suite advanced fluorescence (LAS AF) и объективом 40X и микроскопе Carl Zeiss Axsiovert 200LSM 510Meta для прижизненного наблюдения за миграцией клеток, инъецированных в эксплантат сетчатки.

Анализ значимости полученных результатов и статистическая обработка проводились при помощи программы STATISTICA 6.0. Наличие и значимость разли- чий между выборочными величинами независимых выборок оценивали при помощи непараметрического критерия Kruskal-Wallis. Статистическую значимость отличий между группами инъецированных клеток (ММСК, НСПК, ПЭ) определяли при помощи теста Newman-Keuls (AN0VA).

Результаты и обсуждение

Была произведена трансплантация в эксплантаты нейросетчатки новорожденной крысы ксеногенных клеток. Причем в случае НСПК и ПЭ трансплантированные клетки попадали в свойственное им микроокружение, в то время как ММСК оказывались в совершенно новых для них условиях.

Для предотвращения искажения результатов по изменению морфологии отростков введенных клеток, их миграционной способности и пролиферативной активности были предприняты опыты по культивированию клеток ПЭ, ММСК и НСПК на среде для культивирования сетчатки (контроль) и на среде, кондиционированной эксплантатами. Значительных различий в двух группах экспериментов обнаружено не было, что позволяет говорить о непосредственном влиянии клеточного микроокружения на введенные в эксплантат клетки. Однако опыты по трансплантации клеток в эксплантаты сетчатки показали резкое снижение миграционной способности предифференцированных на кондиционированной сетчаткой среде клеток, что позволяет сделать предположение о необходимости низкодифференцированного фенотипа клеток для достижения наибольшей миграционной способности. Отмечено резкое снижение подвижности клеток при дифференцировке, обусловленное в первую очередь сильным изменением морфологии клеток (образование отростков). Долгосрочные наблюдения в течение 2 мес. за трансплан-тировнными клетками проводили с целью выявить динамику изменения их численности во времени. Анализ на жизнеспособность показал хорошую переживае-мость клеток ПЭ и НСПК в течение 2 мес. как при введении в небольших (до 50 клеток) количествах, так и при значительном числе (500 и более) трансплантированных клеток. В то же время, для инъецированных ММСК, попадающих в новое микроокружение, была продемонстрирована значительная клеточная гибель уже на 3^5 сут. кокультивирования с сетчаткой при введении малого (около 50) количества клеток и их сохранность при инъекции большого (>200) количества клеток. Однако единичные клетки переживали в культуре достаточно длительный период времени и сохранялись на протяжении всего времени наблюдения за образцом (до 2 мес.) (табл.).

С использованием критерия Kruskal-Wallis было показано достоверное отличие выживаемости ММСК, НСПК и клеток ПЭ на 1-е сут. (Н = 7,581796, р=0,0226), на 2-е сут. СН=6,905353, р=0,0317), на 5-е сут. (Н = 6,320694, р = 0,0424) и на 6-е сут. культивирования после трансплантации (Н = 6,61053, р = 0,0367). Попадая в свойственное им микроокружение, клетки ПЗ выживали достоверно лучше трансплантированных ММСК и НСПК.

При помощи теста Newman-Keuls было подтверждено статистически значимое Ср с 0,05J отличие более высокой выживаемости клеток ПЗ от выживаемости ММСК и НСПК, начиная с первого дня культивирования, и отсутствие статистически значимого (р>0,05) отличия в выживаемости ММСК и НСПК. Данная тенденция появления различий в более высокой выживаемости клеток ПЗ и стволовых клеток имела место на протяжении всего времени эксперимента (в течение 6 сут. после трансплантации). После выселения за пределы эксплантата сетчатки миграционная способность ММСК резко падала, начиная с 3-го дня культивирования, но клетки не экспрессировали дифференцировочные маркеры нейронов. В эксплантате сетчатки часть трансплантированных ММСК меняла морфологию, образовывая длинные разветвленные тонкие отростки. В контрольных образцах клеток ММСК, которые культивировали в монослое на кондиционированной сетчаткой среде, подобных изменений морфологии не наблюдалось. Наиболее интенсивно шло образование разветвленных отростков вне зоны эксплантата у клеток, выселившихся из него (рис. 1).

В опытах по долгосрочному культивированию НСПК происходила интенсивная дифференцировка введенных клеток в нейроноподобные клетки. Образовывались длинные сильноветвящиеся тонкие отростки, соединяющие различные группы трансплантированных клеток, наблюдалось формирование обширных сетей отростков нейроноподобных клеток, в т. ч. и с клетками сетчатки (рис. 2).

Прижизненные наблюдения за распространением трансплантированных в сетчатку клеток позволили визуализировать пути миграции различных типов клеток и проследить динамику миграционных изменений инъецированных клеток.

Клетки пигментного эпителия практически не мигрировали из зоны введения, их распространение внутри эксплантата сетчатки, по-видимому, было обусловлено пассивным разнесением выселяющимися клетками самого эксплантата, так как происходило сравнительно медленно (несколько суток) и совпадало с основными путями движения расползающихся клеток кусочка сетчатки.

В противоположность клеткам ПЭ, низкодифференцированные ММСК и НСПК мигрировали активно и на большие расстояния. Распространение НСПК и ММСК от зоны введения за короткий промежуток времени (от нескольких часов до 6 сут.) и за пределы зоны миграции элементов самого эксплантата в случае ММСК позволяет говорить о самостоятельной подвижности этих клеток. Причем популяция введенных ММСК представлялась гетерогенной по миграционной способности ее клеток. Наибольшей подвижностью обладали клетки небольших размеров (около 10—15 мкм), выселяющиеся из зоны инъекции на значительное расстояние уже через час после трансплантации. Предположительно именно эти клетки и составляли пул истинных стволовых клеток костного мозга, что согласуется с классическими представлениями о стволовых клетках[8]. Кроме того, полностью избавиться от гетерогенности выращиваемых in vitro ММСК невозможно. Инъецированные ММСК образовывали агрегаты из клеток различного диаметра, к которым наблюдалась интенсивная миграция мелких клеток, проходящих для этого значительные расстояния (до 500 мкм) (рис. 3).

При проведении непрерывных наблюдений за трансплантированными ММСК и НСПК в течение первых 4 ч после инъекции происходила их массовая миграция из зоны введения, начинающаяся уже через 10 мин после трансплантации и продолжающаяся в течение всего эксперимента. В некоторых случаях наблюдалось сильное вытягивание инъецированных НСПК и образование ими отростков в течение первого часа эксперимента. Также наблюдалась миграционная подвижность ядросодержащей части клетки вдоль образованных отростков. Кроме того, происходило перемещение НСПК и в вертикальном, и в латеральном направлениях, в отличие от ММСК, мигрирующих преимущественно латерально.

Распространение трансплантированных НСПК проходило исключительно по распластанным клеткам эксплантата и не наблюдалось на пластике чашки, что показывает необходимость клеточного окружения для изменения положения нейральных клеток. Распространение клеток шло с образованием коротких неветвя-щихся отростков, расположенных вблизи тела клетки и «ощупывающих» поверхности соседних клеток. Особенно много таких отростков образовывали наиболее активно мигрирующие клетки, проходящие значительные расстояния, среди клеток эксплантата сетчатки.

Прижизненные наблюдения за активно перемещающимися НСПК в течение 4 ч после инъекции показали, что при установлении достаточно большого числа контактов трансплантированной клетки с клетками эксплантата происходило резкое торможение миграционной активности трансплантированных клеток и начало их морфологических изменений, причем данные изменения в морфологии и подвижности клеток НСПК наблюдались уже на второй час после трансплантации. Наличие в эксплантате миграционных дорожек, то есть путей наибольшей и предпочтительной клеточной миграции, показывает неоднородность окружающих трансплантированные клетки тканевых структур. Данный факт позволяет сделать предположение о наличии специфических молекул адгезии, принимающих активное участие в миграции именно нейральных клеток, и отсутствие таковых (VLA-4 и VLA-5) для стромальных ММСК[9].

Исследование образцов через двое суток на миграционную способность трансплантированных клеток активно мигрирующих ММСК и НСПК не выявило.

Распространяющиеся таким образом клетки, образовывали отростки, связывающие их друг с другом. Непосредственное взаимодействие между клетками наблюдалось еще до стадии морфологической дифференци-ровки при продолжающихся процессах миграции, что может говорить в пользу предположения о необходимости установленных функциональных связей для нормальных процессов дифференцировки нервных клеток.

Отсутствие мигрирующих клеток уже на вторые сутки культивирования говорит о том, что расселение введенных клеток происходит в первые сутки или даже часы после трансплантации, что наблюдалось ранее в экспериментах нашей лаборатории[10]. Именно от условий непосредственно после инъекции будет зависеть скорость миграции вводимых клеток, их последующая локализация и способность к образованию отростков, а значит и терапевтический эффект, описываемый в клинике.

Наличие гетерогенности в миграционной способности в популяциях трансплантируемых клеток является следствием неоднородности трансплантируемых in vitro клеток. Данная неоднородность проявлялась в том, что наибольшее количество мигрирующих клеток наблюдалось на второй час после трансплантации, потом происходила миграция отдельных клеток на небольшие расстояния, а через двое суток активное распространение инъецированных клеток практически прекращалось. Оставшиеся в области инъекции клетки не обладали подвижностью и оставались в месте инъекции, кроме того, такие клетки не проявляли потенции к диффе-ренцировке.

Схожие данные были получены и при трансплантации клеток in vivo[11]. Наличие нескольких групп клеток с различной миграционной способностью показано для целого организма и продемонстрировано нами в условиях органотипической культуры, то есть in vitro.

Заключение

Таким образом, в нашей работе было показано, что при инъекции в эксплантат клеток с различными диф-ференцировочными способностями не происходят изменения морфологии и подвижности терминально дифференцированных клеток ПЭ, но имеет место сильное изменение морфологии ММСК и НСПК. Была показана значительная клеточная гибель ММСК при введении их в небольшом количестве (до 50) и их сохранность на протяжении 2 мес. при значительной концентрации клеток (более 200). Инъецированные ММСК изменяли свою морфологию, но не экспрессировали диффе-ренцировочные маркеры нейронов (p-lll-тубулин) и глии (GFAP). Миграция ММСК происходила в первые часы после инъекции. В отличие от них, инъецированные НСПК сохраняли миграционную активность в течение 24 ч после инъекции, дифференцировались с образованием нейроно- и глиеподобных клеток.

Нами было показано, что органотипическая культура сетчатки является адекватной моделью для исследования миграционной активности трансплантированных клеток и представляет удобный инструмент исследования поведения трансплантированных клеток в новое микроокружение реципиентной ткани.

Подняться вверх сайта