Поиск Кабинет

Использование нанокомпозитных покрытий в технологиях культивирования мультипотентных мезенхимных стромальных клеток

Гены & Клетки: Том VIII, №1, 2013 год, стр.: 46-50

 

Авторы

Гольцев А.Н., Рассоха И.В., Дубрава Т.Г., Останкова Л.В., Останков М.В., Гордиенко Е.А., Сафонов В.И., Зыкова А.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Представлены результаты экспериментальных исследований характера влияния нанокомпозитных покрытий с различными физико-химическими параметрами на структурные и функциональные свойства (адгезивный потенциал, фенотип, экспрессия гена ido) мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК).

Апробирован ряд нанопокрытий (Al2O3, ZrO2, Ta2O5), установлена способность оксидного покрытия Аl2O3 обогащать культуру ММСК in vitro, а также повышать степень экспрессии ими гена ido, что может расширять и придавать им новые формы терапевтического потенциала для клинической практики.

Cтремительное развитие исследований в области клеточной и тканевой инженерии потребовало интенсификации работ по внедрению новых технологий, методических и методологических подходов, в том числе с использованием различных по своей природе наноматериалов[1, 2].

Уже сейчас доказана возможность управления функциональным состоянием клеток посредством модификации поверхности нанокомпозитных покрытий, на которых их культивируют[3]. Продемонстрировано влияние физико-химических параметров материалов (титан и его сплавы, рутений, ниобий, разные полимеры) на функциональные характеристики культивируемых остеобластов, фибробластов, макрофагов[4]. Однако, несмотря на значительное количество работ по изучению поведения различных видов клеток при культивировании на тех или иных наноносителях, в отношении стволовых и прогениторных клеток этих данных явно недостаточно. Общеизвестно, что мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) при культивировании in vitro проявляют «пластичность», то есть способность под действием специфических индукторов дифференцироваться в нужном направлении. Очевидно, что дополнительным и весьма существенным фактором управления функциональным потенциалом ММСК может быть и модификация поверхности покрытий, на которых они культивируются. В связи с этим, целью работы было изучение особенностей влияния нанокомпозитных покрытий Al2O3, ZrO2, Ta2O5 с различной шероховатостью (20, 200, и 400 нм) и поверхностной энергией на структурно-функциональные характеристики (адгезивный потенциал, фенотип, продукция транскриптов гена ido) культивируемых in vitro ММСК.

Материал и методы

Эксперименты проводили на мышах линий СВА/Н 3-месячного возраста, массой 22–24 г, в соответствии с «Общими принципами экспериментов на животных», одобренными III национальным конгрессом по биоэтике (Киев, 2007) и согласованными с положениями Европейской конвенции о защите позвоночных животных (Страсбург, 1986 г.).

Получение и культивирование ММСК

Клетки костного мозга получали из бедренных костей мышей линии СВА/Н и культивировали в среде Iscov, содержащей 10% FBS, 50 ед./мл пенициллина, 50 ед./мл стрептомицина в стеклянных чашках Петри (диаметр 3 см) без или с исследуемыми нанопокрытиями с плотностью посева 0,5–1×104 кл/см2 при 37°С, 5% СО2. Долю адгезивных клеток костного мозга оценивали через 2 сут. культивирования[5]. Неприкрепившуюся фракцию клеток удаляли путем двукратного промывания исследуемых поверхностей средой культивирования. Прикрепившиеся клетки фиксировали метанолом с последующим окрашиванием по Романовскому – Гимзе. Зная количество посаженных и количество прикрепившихся клеток, рассчитывали уровень адгезии, то есть долю адгезировавшихся клеток.

Визуальный контроль клеточных культур осуществляли с использованием светового фазово-контрастного микроскопа Axiovert 25 (Zeiss, Германия).

Пассирование ММСК проводили после достижения субконфлюентного монослоя с плотностью 0,5–1×106 кл/см2. В конце каждого пассажа клетки снимали раствором трипсин-ЭДТА (Sigma, США) по стандартной методике[5], инактивировали средой, содержащей 10 % FBS, производили отмывку и оценку их структурно-функциональных характеристик.

Иммунофенотипические характеристики ММСК

Иммунофенотипическое исследование выполняли на проточном цитофлуориметре FACS Calibur (Becton Dickinson, США) с использованием флуорохромных (FITC или PE) конъюгатов моноклональных антител (BD Bioscience, США) СD73, CD105, CD106, CD90, CD44, согласно инструкции фирмыпроизводителя. В качестве контроля использовали пробы с добавлением неиммунных меченых FITC или PE моноклональных антител (BD Bioscience, США) того же изотипа, что и антитела к исследуемому маркеру. Анализ данных, полученных цитофлюориметрическим методом, осуществляли с помощью программы WinMDI 2.8. В каждой пробе (n = 7–11) анализировали 10 000 событий.

Экспрессия гена ido

Содержание транскриптов гена ido определяли методом ОТ-ПЦР. Для выделения нуклеиновых кислот использовали 1×105 клеток и наборы Diatom RNA Prep 100 (Isogene Lab, Ltd, Росия), содержащие лизирующий реагент – гуанидинтиоцианат. Реакцию ОТ-ПЦР ставили с использованием комплекта random-олигонуклеотидов и ревертазы (М-Мlv), согласно инструкции фирмы-производителя «Реверта L» (Россия).

Праймер исследуемого гена ido был сконструирован на основе базы данных на сайте «GenBank» (NCBI BLAST, USA) – NM_008324.1 (длина фрагмента 342 п.н.) и синтезирован в АОЗТ «Медбиосервис» г. Киева.

Амплификацию фрагментов ДНК осуществляли в термостате «Терцик» ЗАТ «НВФ ДНК-технология» (Россия). Денатурацию проводили при 94°С в течение 30 с, гибридизацию матрицы с праймером при 60°С – 30 с, элонгацию – при 72°С 60 с. Количество циклов – 40. После окончания ПЦР проводили элонгацию при 72°С в течение 5 мин. Детекцию продуктов амплификации проводили методом капиллярного электрофореза в чип-анализаторе «Agilent 2100» (США). Подготовка чипов осуществлялась согласно инструкции набора ДНК 1000 («Fermentas», Литва).

Сравнение количества транскриптов исследованных мишеней проводили на основе относительной количественной оценки продуктов амплификации[6]. Кратко, готовили последовательные десятикратные разведения исходного препарата кДНК из каждого исследуемого образца. К каждому разведению добавляли реакционную смесь и проводили амплификацию. Чем меньше в исходном препарате было последовательностей-мишеней, тем раньше (то есть при меньших разведениях) прекращалась амплификация. Логарифм разведения (lg) кДНК служил показателем уровня экспрессии исследуемых генов. Система β-actin была использована как внутренний контроль для ПЦР реакции. Результаты были нормированы по отношению к показателю экспрессии гена «домашнего хозяйства» β-actin (NM_007393.3). Отрицательным контролем была реакционная смесь без кДНК.

Нанокомпозитные покрытия

В работе исследовали оксидные (Al2O3, ZrO2, Ta2O5) покрытия, наносимые модернизированными вакуум-плазменными методами: дуговыми с сепарацией плазменного потока; электронно-лучевым; методом магнетронного распыления и магнетронного распыления с ионной бомбардировкой. Параметры шероховатости покрытий (20, 200 и 400 нм) были измерены с помощью профилометра-профилографа модели 252 («Калибр», Россия) и профилометра Hommel T-2000 («Hommelwerke GmbH», Германия).

Контактные углы измеряли методами тенсиометрии на приборе Kruss 12 («Kruss», Германия) при температуре 20°C с использованием стандартных жидкостей с известными значениями поверхностного натяжения, компонентами полярного и дисперсионного взаимодействия, таких как α-bromonaphthaleneformamideethylene glycol-diidomethane-glycerol-water[7].

Суммарная поверхностная энергия, ее полярная и дисперсионная компоненты были определены методом Wu для двух жидкостей и методом Owens-WendtRabel-Kaeble’ для α-bromonaphthalene-formamideethylene glycol-diidomethane-glycerol-water, а также методами Van Oss и Fowkes[7].

Полученные данные оценивали с помощью непараметрического U-критерия Манна – Уитни. Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью программы Microsoft Excel.

Результаты и обсуждение

Рецепторный «репертуар» клеток представляет собой сложную систему, посредством которой клетки взаимодействуют друг с другом, структурами межклеточного матрикса и реализуют в итоге объем функциональной активности. Одно из главных «мест» в широком спектре мембранных рецепторов занимают молекулы клеточной адгезии. Отмечено, что рельеф поверхности выступает в качестве фактора, модулирующего адгезивный потенциал клеток[4].

Представленные на рис. 1 результаты демонстрируют зависимость изменения адгезивных свойств культивируемых ММСК костного мозга как от вида покрытия, так и от шероховатости его поверхности (20, 200, 400 нм). Для Al2O3 и ZrO2 продемонстрировано снижение адгезивного потенциала ММСК с увеличением шероховатости подложки. Для Ta2O5 такой закономерности не было отмечено. Доля адгезировавшихся к стеклу с покрытием Al2O3 клеток была самой высокой, а с покрытием Ta2O5 – самой низкой.

Помимо топографии, на адгезию клеток влияла поверхностная энергия подложки, определяющая ее гидрофобно-гидрофильные характеристики (табл.). Учитывая, что гидрофильность подложки обратно пропорциональна величине контактного угла, наибольшими гидрофильными свойствами из всех исследуемых оксидных покрытий обладала подложка с покрытием Al2О3, имеющая и наибольшую поверхностную энергию. Покрытие Ta2O5 характеризовалось максимально гидрофобной природой и наименьшим значением поверхностной энергии.

Очевидно, что для реализации адгезивного потенциала клеток значимо то или иное сочетание этих свойств подложки.

Известно, что из гетерогенной популяции клеток костного мозга уже на первых этапах культивирования in vitro адгезивные свойства проявляют, главным образом, ММСК[8]. Для их идентификации цитофлюориметрическим методом были выбраны общепринятые мембранные маркеры, имеющие различную функциональную нагрузку. В частности, CD73 (Ecto-5’-nucleotidase), реализующий регуляцию клеточной пролиферации; CD106 (VCAM-1), присутствующий только на ММСК костного мозга[9] и определяющий взаимодействие клеток стромы с предшественниками гемопоэтического ряда; CD44 – рецептор гиалуроновой кислоты, формирующей внеклеточный матрикс[10]; CD105 (Endoglin) – рецептор ростовых факторов: активина А и TGF-β[11]; CD90 (Thy-1), характерный и для клеток гемопоэтического ряда, маркер адгезии и Т-клеточной активации.

По этим маркерам нами было идентифицировано содержание ММСК в культуре клеток костного мозга, пассированной на стекле (контроль) и на стекле с покрытием Al2O3 и шероховатостью 20 нм (опыт) (рис. 2), на котором был показан больший уровень адгезии клеток.

Было установлено, что содержание СD73+, CD106+ и CD105+ клеток, культивируемых на Al2O3, после 1 пассажа в 1,4–1,5 раза, а после 2 – в 1,2– 1,46 раза превышало соответствующие каждому пассажу показатели в контроле (стекло).

Увеличение содержания СD73+, CD106+ и CD105+ клеток после 2 пассажа было достоверно выше как в контроле (стекло), так и в опыте (Al2O3), по сравнению с 1. После 3 пассажа содержание клеток, экспрессирующих маркеры ММСК, как на стекле, так и на оксидном покрытии достоверно не изменялось, по сравнению с соответствующими показателями, определяемыми после 2 пассажа. Важно заметить, что в соответствии с вышеприведенными данными (см. рис. 1), общая доля адгезировавшихся клеток на стекле, покрытом Al2O3, достоверно не отличалась от контроля (стекло).

В таком случае полученные на данном этапе результаты убедительно свидетельствуют о способности покрытия Al2O3 селективно «обогащать» культуры костного мозга ММСК. Пластичность клеток была подтверждена при оценке дифференцировочного потенциала в остео- и адипогенном направлениях при культивировании в присутствии специфических индукторов.

Одной из важнейших характеристик ММСК является их иммуномодулирующая активность[12], реализация которой связана с экспрессией в этих клетках гена ido. Именно этому гену принадлежит ключевая роль в расщеплении триптофана и активации его катаболитами супрессорного звена иммунной системы[13]. В связи с этим, в исследуемых ММСК была оценена экспрессия гена ido, продукты амплификации которого были визуализированы на чип-анализаторе «Аgilent» 2100 (рис. 3).

Результаты анализа экспрессии гена ido (рис. 4) показали увеличение содержания его транскриптов в ММСК, культивированных на нанопокрытии Al2O3, после 1 пассажа в 3,6 раза. Важно, что после 2 пассажа в контроле (стекло) степень экспрессии гена ido снижалась в 2 раза, тогда как у культивированных на Al2O3 клетках оставалась достаточно высокой.

В связи с этим после 2 пассажа уровень транскриптов исследуемого гена был уже в 7,3 раза выше, чем в контроле.

Значимость этих данных возрастает в связи с дискуссией об изменении функционального потенциала ММСК по мере увеличения кратности их пассирования[14]. Действительно, иммуносупрессивный потенциал ММСК, культивируемых на стекле, в виде продукции транскриптов гена ido существенно снижается уже на втором пассаже (см. рис. 4). В то же время, покрытие Al2O3, напротив, «реанимирует» «ido-экспрессирующий» потенциал ММСК.

Выводы

Представленные результаты доказывают возможность модификации структурно-функциональных характеристик ММСК подложками культивирования. Установлена способность оксидного нанопокрытия Аl2O3, нанесенного на стеклянную подложку с шероховатостью 20 нм, селективно «обогащать» культуры костного мозга ММСК, а также повышать в них уровень экспрессии гена ido. Факт повышения содержания транскриптов гена ido в ММСК после культивирования на покрытии Al2O3 ориентирует на возможность более эффективного их использования при лечении патологий аутоиммунного генеза.

Подняться вверх сайта