Поиск Кабинет

Инсулин-продуцирующие клетки в лечении инсулинозависимого сахарного диабета

Гены & Клетки: Том XI, №1, 2016 год, стр.: 24-34

 

Авторы

Шереметьева М.Е., Бухарова Т.Б., Гольдштейн Д.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Эффективным методом лечения инсулинозависимого сахарного диабета, альтернативным гормонозаместительной терапии, является трансплантация инсулин-продуцирующих клеток (ИПК). Донорские β-клетки трансплантируются как в составе поджелудочной железы целиком, так и в виде изолированных островков Лангерганса. Однако применение метода ограничено недостатком донорского материала и необходимостью проведения пожизненной иммуносупрессивной терапии, пагубно сказывающейся на состоянии ослабленного организма больных диабетом. Альтернативный способ получения ИПК – дифференцировка из стволовых или прогениторных клеток. Способность к панкреатической дифференцировке выявлена у различных типов стволовых клеток. В настоящее время в качестве наиболее перспективного источника ИПК рассматривают индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), включая те, которые получены из специализированных клеток самих пациентов. Такие ИПК, во-первых, могут быть получены в неограниченном количестве, а во-вторых, в случае аутогенной трансплантации в наименьшей степени подвергаются иммунной атаке со стороны реципиентов, тем самым давая возможность полностью отказаться от иммуносупрессивной терапии. Внедрению ИПСК в клиническую практику препятствует то, что они способны провоцировать образование тератом в организме реципиентов, причём сохраняют эту способность даже после дифференцировки за счёт отдельных недифференцированных клеток, сохранившихся в популяции.

Данный обзор посвящён современным протоколам получения ИПК из ИПСК, воспроизводящим этапы формирования β-клеток при эмбриональном развитии. Рассмотрено применение для трансплантации ИПК иммунноизолирующих контейнеров, полупроницаемые стенки которых, с одной стороны, защищают трансплантат от воздействия иммунной системы реципиента, а с другой, обеспечивают безопасность трансплантата для реципиента с точки зрения образования опухолей. Описано использование ИПК, полученных из ИПСК, в качестве модельного объекта для изучения процессов, происходящих в β-клетках в норме и при сахарном диабете.

Введение

Распространение сахарного диабета (СД) в последние годы приобрело масштабы эпидемии. По данным Международной федерации диабета в 2014 г. в мире насчитывалось 387 млн больных, а к 2035 г. их количество возрастёт до 592 млн. В России зарегистрировано более 3,5 млн больных СД, однако реальное число, по некоторым оценкам, гораздо выше и может достигать 9 млн человек[1].

СД – тяжёлое заболевание, приводящее к резкому снижению качества жизни, развитию системных осложнений, инвалидизации и представляющее собой серьёзную медико-социальную проблему. Выделяют два основных типа диабета. СД 1 типа (СД-1) – заболевание, связанное с недостатком у пациента β-клеток поджелудочной железы вследствие разрушения последних, главным образом, за счет аутоиммунных механизмов. Инсулин перестаёт синтезироваться в достаточном количестве и требуется его искусственное введение. Чаще всего СД-1 развивается в детском, подростковом и молодом возрасте. Диабет 2 типа (СД-2) – хроническое заболевание неиммунной природы, которое чаще встречается у взрослых пациентов; с возрастом риск его возникновения увеличивается. Причина развития СД-2 – инсулинрезистентность периферических тканей организма. Выработка инсулина остаётся высокой на протяжении длительного времени, но не даёт необходимого физиологического эффекта, из-за чего происходит истощение β-клеток и также появляется потребность в искусственном введении инсулина[2].

Проблема лечения СД далека от решения. Поздняя диагностика и сложность физиологического контроля уровня глюкозы приводят к развитию отдаленных осложнений диабета, таких как нефропатия, ретинопатия, нейропатия, сердечно-сосудистые и другие заболевания. Применение препаратов инсулина кратковременного и пролонгированного действия, тщательный подбор режимов их введения и даже использование инсулиновой помпы далеко не всегда позволяют добиться адекватного контроля уровня глюкозы в крови, следствием чего являются повторяющиеся эпизоды острой гипергликемии[2].

Наиболее результативный метод лечения больных с тяжёлыми формами диабета – это трансплантация донорской поджелудочной железы, изолированных островков Лангерганса или выделенных из них β-клеток[3]. Трансплантация поджелудочной железы избавляет пациентов от искусственного введения инсулина на протяжении нескольких лет. Однако такая операция представляет собой объёмное хирургическое вмешательство со смертностью от 1 до 3% и серьёзными осложнениями со стороны сердечно-сосудистой системы. Кроме того, в дальнейшем пациентам требуется пожизненная иммуносупрессивная терапия, поэтому трансплантация поджелудочной железы рекомендуется больным с тяжёлыми формами СД, такими как терминальная стадия диабетической нефропатии, лабильное течение заболевания, частые эпизоды тяжёлой гипогликемии и нарушение восприятия гипогликемии[4, 5].

Трансплантация островков Лангерганса в настоящее время введена в клиническую практику в ряде стран Европы и Северной Америки. Данный способ хорошо зарекомендовал себя с точки зрения эффективности и безопасности для пациентов. Метод получения донорских островков Лангерганса отработан и стандартизирован[6]. Довольно продолжительного терапевтического эффекта при трансплантации изолированных островков удалось получить после того, как в клиническую практику был внедрён так называемый Эдмонтоновский протокол[7]. С помощью этого протокола достигнуты результаты, существенно превышающие предыдущие: возрастает уровень С-пептида, улучшаются показатели теста на толерантность к глюкозе, снижается уровень гликозилированного гемоглобина и не повторяются эпизоды острой гликемии. Были предприняты попытки выделения β-клеток из островков Лангерганса с целью их дальнейшей экспансии in vitro, но они не увенчались успехом, поскольку эти клетки являются терминально дифференцированными. Таким образом использование β-клеток для трансплантации наименее перспективно.

Аллогенная пересадка островков Лангерганса или целой поджелудочной железы позволяет добиться заметного терапевтического эффекта, однако нехватка донорского материала так велика, что пациенты вынуждены ожидать операции на протяжении многих лет. Кроме того, для повышения эффективности трансплантации требуется оптимизация метода выделения донорских тканей, определение места трансплантации и выбора режима иммуносупрессии. Нельзя не учитывать и тот факт, что при аллогенных клеточных трансплантациях не исключена вероятность контаминации вирусными и прионными возбудителями заболеваний[8]. Тем не менее, даже успешная трансплантация снимает потребность в инсулиновой терапии на ограниченное время: до 10 лет при трансплантации поджелудочной железы и до 5 лет при пересадке изолированных островков[9–11].

Таким образом, широкому распространению трансплантационных методов лечения СД мешают два обстоятельства: во-первых, ограниченное количество донорского материала, во-вторых, массивная иммуносупрессивная терапия, действующая губительно на ослабленный организм пациентов, но при этом не исключающая развития реакции отторжения организмом трансплантированных островков Лангерганса и поджелудочной железы[12].

Проблема, связанная с нехваткой донорского материала может быть решена, если использовать для трансплантации инсулин-продуцирующие клетки (ИПК), полученные в результате перепрограммирования стволовых/прогениторных клеток, количество которых неограниченно. В отличие от трансплантации аллогенных островков Лангерганса или β-клеток, возможно получение ИПК из клеток самого пациента. Однако СД-1 имеет, как правило, аутоиммунную природу, поэтому время жизни трансплантированных аутогенных ИПК может быть недостаточным для эффективного применения. Выживаемость ИПК, также как и β-клеток без использования иммуносупрессии, можно обеспечить путем иммуноизоляции трансплантированных клеток с помощью полупроницаемых контейнеров (капсул).

Выделяют следующие способы получения ИПК[2, 11]:

1) дифференцировка стволовых клеток (СК), включая эмбриональные (ЭСК) и индуцированные плюрипотентные (ИПСК);

2) трансдифференцировка клеток других типов, таких как гепатические, ацинарные и α-клетки;

3) дифференцировка панкреатических прогениторных клеток;

4) экспансия собственных β-клеток пациента.

В настоящее время ИПСК рассматриваются как самый привлекательный объект для клеточной терапии, благодаря их высокой пластичности – способности формировать ткани всех трех зародышевых листков – и практически неограниченному пролиферативному потенциалу. При этом применение ИПСК свободно от этических ограничений, существующих для работы с ЭСК. С тех пор, как впервые была показана возможность репрограммирования посредством активации экспрессии генов OCT4, SOX2, KLF4 и c-MYC[13, 14], ИПСК были получены из многих типов клеток[15]. ИПСК пригодны для ауто- и аллогенных трансплантаций пациентам, а забор биоптата (например, небольшого фрагмента кожи) для их получения – малоинвазивная и безболезненная процедура[11]. В последнее время безопасность применения ИПСК в клинической практике была существенно повышена – разработаны методы получения ИПСК без инсерции транскрипционных факторов в геном – на основе вируса Cендай[16] и с использованием микроРНК[17, 18]. Кроме того, ведется разработка протоколов культивирования и дифференцировки ИПСК в «xeno-free»-условиях, что позволяет снизить иммуногенность трансплантата и риск контаминации (табл. 1)[19, 20].

Существует и другой аспект применения ИПСК – использование клеток на разных стадиях панкреатической дифференцировки для моделирования процессов, происходящих при развитии СД[11, 21]. Для этой цели подходят ИПСК, полученные как из клеток здоровых доноров, так и из клеток больных диабетом[22, 23].

Разработкой способов индукции дифференцировки ИПСК и СК других типов в ИПК занимаются ведущие лаборатории по всему миру. Однако большинство существующих протоколов не позволяют получить зрелые β-клетки, способные к изменению уровня секреции инсулина в ответ на изменение уровня гликемии. В ряде случаев показано, что ИПК, прошедшие первичную панкреатическую дифференцировку, дозревают после трансплантации в организме реципиента[24]. В 2014 г. опубликованы две работы, в которых удалось дифференцировать ИПСК в ИПК, осуществляющие выброс инсулина при увеличении концентрации глюкозы в среде в нескольких последовательных циклах. Эти клетки весьма близки по своим свойствам к β-клеткам, выделенным из островков Лангерганса[25, 26]. Данные результаты дают надежду на скорое внедрение ИПК, полученных из ИПСК, в клиническую практику, и на прорыв в области лечения инсулинозависимого СД.

В данном обзоре рассматриваются методы получения ИПК путём дифференцировки ИПСК, а также макроинкапсуляция ИПК как способ повышения эффективности трансплантации ИПК для лечения больных СД.

Свойства β-клеток и панкреатическая дифференцировка in vivo

Инсулин-продуцирующие β-клетки составляют основную массу эндокринной части поджелудочной железы и входят в состав островков Лангерганса (60–70% от общего количества клеток в островках). Единичные β-клетки могут быть расположены в составе ацинусов и протоков[27]. β-клетки поддерживают базальный уровень инсулина в крови, обеспечивают быстрое выделение накопленного инсулина и его синтез при повышении уровня глюкозы в крови. Помимо инсулина, β-клетки выделяют в кровь в эквимолярном количестве С-пептид – полипептид, после отщепления которого от молекулы проинсулина образуется инсулин. Уровень С-пептида позволяет косвенно судить об инсулин-секретирующей способности β-клеток, поскольку не зависит от инсулина, вводимого извне[28].

В клетках протоков развивающейся поджелудочной железы человека ИПК можно обнаружить, начиная с 7-й нед. развития после оплодотворения[29]. Дифференцировка β-клеток – это сложный, тонко регулируемый процесс, в который вовлечено множество сигнальных путей и транскрипционных факторов (рис. 1)[30, 31]. Следует отметить, несмотря на то, что всеми авторами выделяются одни и те же этапы этого процесса, детальное его описание варьирует в разных источниках.

На первом этапе панкреатической дифференцировки вскоре после гаструляции и формирования из СК трёх зародышевых листков – эктодермы, мезодермы и энтодермы – происходит выделение дефинитивной энтодермы, клетки которой коэкспрессируют транскрипционные факторы FOXA1 и FOXA2[30]. Отмечается также действие других факторов, например, WNT4, FGF4, NCAD, GOOSECOID[32]. Из клеток дефинитивной энтодермы затем формируются гастроинтестинальные органы: печень, лёгкие, тимус, дыхательный и пищеварительный тракты, поджелудочная железа.

Второй важный этап дифференцировки – формирование примитивной кишечной трубки, дающей начало кишечнику. В этом процессе участвуют транскрипционные факторы PDX1 и PTF1α. Для клеток, экспрессирующих PDX1 (панкреатический дуоденальный гомеобокс 1), доказано их участие в формировании эндокринных и экзокринных компартментов[29]. Среди прочих факторов, влияющих на этот процесс, указывают FOXA4, SOX17, CXCR4, BMP2 и др.[32]. Клетки кишечной трубки при участии HNF1B и HNF4A дифференцируются в клетки передней кишки, которые и дают начало всем клеткам поджелудочной железы, включая инсулин-продуцирующие[32].

Панкреатические зачатки на ранних стадиях развития соседствуют с кардиальной мезенхимой и нотохордом, синтезирующими морфогены, направляющие дальнейшие этапы дифференцировки клеток поджелудочной железы: активин А, факторы роста фибробластов и костные морфогенетические факторы[30].

В панкреатических зачатках формируются мультипотентные прогениторные клетки, которые затем превращаются во все типы клеток поджелудочной железы. Для клеток, которым предстоит стать эндокринными, отмечают экспрессию PDX1, PTF1A, CPA1 и c-MYC. Дифференцировка эндокринных клеток требует ингибирования сигнального пути Notch, что ведёт к усилению экспрессии транскрипционного фактора NGN3 (нейрогенин 3) с последующей активацией нескольких регуляторов, включая NKX2.2, NKX6.1, NEUROD1, PAX4, PAX6, ISL1[30, 32]. Согласованное последовательное действие этих факторов приводит к получению ИПК.

Однако дифференцировка β-клеток на этом не заканчивается. На следующих стадиях развития, должен сформироваться механизм, позволяющий клеткам изменять уровень секреции инсулина в соответствии с уровнем гликемии. При созревании β-клеток увеличивается экспрессия следующих ключевых факторов[30]:

1) INS1 (препроинсулин и инсулин, определяющие функцию β-клеток);

2) GLUT2 и GK (транспортер глюкозы 2 и глюкокиназа, участвующие в системе восприятия глюкозы);

3) PDX1, MAFA и NEUROD (транскрипционные факторы, участвующие в развитии β-клеток и их функционировании);

4) CHGA, CHGB и IAPP (хромогранины и амилоидный полипептид, участвующие в формировании секреторных гранул инсулина);

5) SUR1 и KIR6.1 (гены каналов калия и кальция, участвующие в секреции инсулина);

6) гены пируваткарбоксилазы, митохондриальной глицерол-3-фосфатдегидрогеназы и других ферментов, участвующих в формировании специфического фенотипа β-клеток.

В организме взрослого человека β-клетки de novo практически не образуются, что и приводит к их быстрой гибели при аутоиммунной атаке и развитию сахарного диабета 1 типа. Образование новых β-клеток, как путём дифференцировки клетокпредшественников, так и путём деления имеющихся β-клеток, продемонстрировано для взрослых мышей и для крыс[33].

Дифференцировка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в инсулин-продуцирующие клетки in vitro

Существует два основных подхода к репрограммированию СК: с помощью их генетической модификации и путём подбора селективных сред. Нередко при разработке протоколов дифференцировки используют комбинацию этих подходов, что справедливо и для получения ИПК из ИПСК и ЭСК.

В большинстве исследований превращение плюрипотентных СК в ИПК происходит в результате последовательного действия индукторов цитодифференцировки, которые добавляют в среду в различных комбинациях[34–44] (табл. 2, 3).

Детальное описание больших и малых молекул, направляющих процесс дифференцировки ИПCК в β-клетки, представлено в обзоре S. Kumar с соавт. (2014)[31].

Общим для всех методов является использование активина А и ретиноевой кислоты[43]. Воздействие активина А на недифференцированные клетки приводит к дифференцировке энтодермы; последующая обработка ретиноевой кислотой – к индукции дифференцировки по панкреатическому пути[42]. Оба индуктора обладают системным действием, являются компонентами многих сигнальных путей, в том числе активируют экспрессию PDX1.

В ряде случаев усиление специфических транскрипционных факторов проводят за счёт прямого введения в клетку белков или соответствующих им генов, что делает процесс более эффективным. В первую очередь это касается фактора PDX1, который при дифференцировке in vivo играет важную роль как на стадии формирования панкреатических прогениторов, так и при созревании β-клеток[45– 50]. Сверхэкспрессия генов Pdx1 и Ngn3 при активин-индуцированной панкреатической дифференцировке ЭСК мыши приводила к резкому увеличению количества полученных инсулин-продуцирующих клеток[46]. Трансдукция белком PDX1 ИПСК человека стимулировала их превращение в эндокринные панкреатические клетки-предшественники, усиливая экспрессию NGN3[48]. Для эффективной дифференцировки также применяли трансдукцию ЭСК и ИПСК мыши белками Pdx1, NeuroD и MafA[50]. В экспериментах с ЭСК человека было отмечено стимулирующее действие таких факторов роста, как BMP4, bFGF[51] и FGF4[52].

Опубликованы исследования, в которых для запуска панкреатической дифференцировки в ИПСК используют микроРНК. Лентивирусная трансдукция miR-375 позволила получить функционально активные ИПК, способные к глюкозо-зависимой секреции инсулина и демонстрирующие высокий уровень экспрессии маркеров панкреатической дифференцировки[53]. Другая группа исследователей в качестве фактора дифференцировки применила комбинацию miR-375 и miR-186, что также привело к получению ИПК, способных изменять уровень секреции инсулина в ответ на изменение уровня гликемии[54]. В качестве эффективного фактора панкреатической дифференцировки используют также miR-7, помещённую в клетки при помощи химической трансфекции[55].

В качестве других факторов, которые влияют на эффективность формирования из ИПСК зрелых β-клеток, может быть, например, концентрация О2[56]. Обнаружено, что культивирование клеток в дифференцировочной среде при повышенном содержании О2 приводит к подавлению гена Hes1, усилению Ngn3, активации сигнального пути Wnt – и, в конечном итоге, к увеличению количества ИПК, полученных по протоколу К.А. D’Amour (2006)[34]. Ряд авторов указывают на то, что эффективность панкреатической дифференцировки ИПСК повышается при культивировании в 3D-условиях[25, 57–59]. ИПК после трансплантации под капсулу почки мышам с диабетом, индуцированным стрептозотоцином, формировали васкуляризованный объёмный органоид, в котором сохранялась экспрессия инсулина[60]. В недавнем исследовании А. Shaer с соавт. (2015) из ИПСК были получены ИПК в виде островково-подобных кластеров; эти кластеры обнаружили способность увеличивать секрецию инсулина в ответ на повышение концентрации глюкозы в среде, и могут служить модельным объектом для изучения дифференцировки ИПСК в ИПК[61].

Для дифференцировки ИПСК в ИПК также имеют значение свойства исходных ИПСК. Отмечается, что при получении ИПСК из клеток больных СД-1 свойства ИПК, дифференцированных из этих клеток, различаются у разных пациентов; это касается как генов плюрипотентности, так и генов маркеров панкреатической дифференцировки. Для успешной дифференцировки ИПСК в глюкозо-зависимые ИПК необходимо, чтобы гены плюрипотентности были полностью неактивны[23]. В исследовании по перепрограммированию β-клеток человека в ИПСК β-клетки приобретали маркеры плюрипотентных клеток и могли быть дифференцированы во все три зародышевых листка. Такие ИПСК обладали более выраженной способностью дифференцироваться в ИПК по сравнению с ИПСК, полученными не из β-клеток того же индивидуума[62], что указывает на наличие эпигенетической памяти у ИПСК, способствующей их дифференцировке в ИПК.

Различные группы исследователей предпринимают попытки получить ИПК из ИПСК в «xenofree »-условиях, что обусловлено требованиями по безопасности применения клеточных продуктов в медицинской практике. Однако в большинстве опубликованных работ при культивировании ИПСК всё же использовали мышиные фибробласты либо применяли бычью сыворотку в ходе дифференцировки. Информация о том, что полученные таким образом клетки не просто способны к синтезу инсулина, а близки по своим свойствам к зрелым бета-клеткам, в настоящее время отсутствует[19, 63, 64].

Все разрабатываемые протоколы получения ИПК так или иначе направлены на воспроизведение регуляторного каскада, определяющего формирование β-клеток при эмбриональном развитии. Эффективность дифференцировки оценивают по уровню экспрессии маркерных генов, таких как PDX1, INS1, SOX17, NGN3 и др.

Ключевым моментом оценки функциональной активности ИПК является их способность синтезировать и секретировать инсулин в ответ на повышение концентрации глюкозы в среде. ИПК, полученные с помощью большинства протоколов, обычно являются полигормональными, то есть синтезируют одновременно инсулин и глюкагон или инсулин, глюкагон и соматостатин. Зачастую анализ показывает, что эти клетки не способны демонстрировать секрецию инсулина в ответ на стимуляцию глюкозой, то есть не функционируют как зрелые β-клетки[11]. Однако есть и такие исследования, в которых удалось наработать достаточное количество моногормональных клеток, проявляющих чувствительность к глюкозе[39, 41, 45]. В некоторых случаях продемонстрировано дозревание ИПК до функционально активных β-клеток in vivo после трансплантации экспериментальным животным. Однако и оно не всегда бывает успешным. В исследовании S. Pellegrini с соавт. (2015) показано, что ИПК после трансплантации под капсулу почки иммунодефицитным мышам со временем, наоборот, утрачивали способность синтезировать инсулин. Гистологический анализ выявил, что популяции трансплантированных клеток, помимо зрелых панкреатических, содержат плюрипотентные и нейрональные клетки[65].

Трансплантация клеток, способных не только к синтезу и секреции инсулина, но и к регуляции этих процессов в зависимости от концентрации глюкозы в среде – вопрос, принципиально важный с точки зрения разработки медицинских технологий.

В 2014 г. опубликован протокол получения ИПК, чрезвычайно близких по своим свойствам к зрелым β-клеткам, как по уровню секреции инсулина, так и по способности изменять этот уровень в ответ на изменение концентрации глюкозы, причём для одних и тех же клеток фиксировалось несколько циклов глюкозо-зависимого выброса инсулина[25]. Превращение ИПСК в ИПК достигалось путём последовательного многостадийного воздействия на клетки факторов цитодифференцировки (рис. 2).

В этих ИПК наблюдали экспрессию панкреатических генов PDX1 и NKX6-1. Эти клетки были способны выбрасывать кальций в ответ на добавление в среду глюкозы, упаковывали инсулин в секреторные гранулы, секретировали инсулин в количествах, сопоставимых с таковыми у зрелых β-клеток, в ответ на множественные эпизоды добавления глюкозы, и, наконец, хорошо показали себя в экспериментах in vivo: после трансплантации их диабетическим мышам у последних снижался уровень гипергликемии. Сходные результаты были продемонстрированы и другой группой исследователей[26].

В 2015 г. была опубликована работа, авторы которой выполнили сравнительную характеристику ИПК, полученных из ИПСК по разным протоколам[66]. Однако в экспериментах in vivo не удалось обнаружить столь же обнадёживающие результаты, как в оригинальных исследованиях, из чего следует, что и эти протоколы нуждаются в дальнейшей оптимизации.

Использование иммуноизолирующих контейнеров для трансплантации ИПК

Усилить защиту трансплантированных клеток, как аллогенных, так и аутогенных, от иммунной атаки организма можно путём их инкапсуляции. Полупроницаемые стенки иммуноизолирующей капсулы будут пропускать инсулин и низкомолекулярные продукты обмена, но не пропустят целые клетки – как трансплантированные ИПК, так и компоненты иммунной системы реципиента.

Иммуноизолирующие «приспособления» привлекают внимание исследователей уже многие десятилетия. Главная задача, стоящая перед разработчиками – добиться того, чтобы клетки внутри капсулы были в достаточной мере обеспечены веществами, необходимыми для поддержания их жизнедеятельности. Наиболее простой, на первый взгляд, способ заключения клеток в микрокапсулы, которые затем помещаются в кровеносное русло, чреват закупоркой кровеносных сосудов, повышением риска образования тромбов и невозможностью локализовать микрокапсулы в области введения. Поэтому в последние годы усилия направлены на разработку экстраваскулярных приспособлений – макрокапсул. Такие макрокапсулы, во-первых, должны иметь небольшие объём и (или) толщину, обеспечивая доступ к питательным веществам и кислороду для всех клеток. Во-вторых, вокруг них должна образовываться капиллярная сеть. И, в-третьих, необходимо предотвращать формирование вокруг имплантата фиброзной капсулы, которая сведёт к нулю обмен веществ между клетками и организмом реципиента[67].

Степень васкуляризации трансплантированной макрокапсулы имеет исключительное значение для ее функционирования. Поэтому разрабатываются методы, стимулирующие ангиогенез в тканях, окружающих трансплантат: добавление в состав капсулы ангиогенных биологически-активных веществ, таких, как VEGF, FGF1, FGF2 и др., противовоспалительных агентов, а также использование в качестве главного компонента капсулы полимерных материалов, состав и структура которых сами по себе обладают способностью индуцировать неоваскуляризацию[67]. В качестве одного из основных факторов, стимулирующих образование новых кровеносных сосудов, указывают гипоксию. Васкуляризация трансплантированной макрокапсулы определяется в значительной степени также и структурой поверхности ее внешнего слоя: высокопористые материалы обеспечивают лучшее прорастание капилляров и сосудов.

Дополнительный аспект, который необходимо учитывать при разработке иммуноизолирующих приспособлений – это наличие и состав матрикса внутри капсулы, имитирующего межклеточную среду для повышения выживаемости клеток. Таким матриксом может быть, например, коллаген, фибрин и полисахариды (хитозан, декстран, альгинаты, агароза). Наиболее перспективным, с точки зрения использования в качестве материала внутреннего слоя капсул, представляется коллаген, поскольку именно он является природным матриксом для адгезии клеток различных типов, в том числе стволовых клеток и фибробластов[68].

В ряде западных лабораторий проводятся исследования, посвящённые трансплантации панкреатических клеток в иммуноизолирующих изделиях (табл. 4)[69]. Обычно в экспериментах используются камеры на основе политетрафлуороэтилена TheraCyte™ (TheraCyte Inc., США). Такая камера представляет собой плоскую систему тонких полимерных биосовместимых мембран (рис. 3). Толщина внутренней мембраны 30 мкм, наружной – 15 мкм[70], объём камер 5–20 мкл. Наружная мембрана обладает свойством индуцировать васкуляризацию в прилегающих к ней тканях. Внутренняя мембрана непроницаема для клеток, помещённых внутрь капсулы. Обе мембраны свободно пропускают питательные вещества и терапевтической продукт. Размер пор внутренней мембраны 0,4 мкм[71], наружной, ламинирующей внутреннюю – 5 мкм[70]. Внутрь приспособления помещается 1–10 млн клеток[72] либо около 1000 островков Лангерганса[73]. Клетки загружаются в капсулу через специальное отверстие, которое затем заклеивают кремниевым клеем медицинского качества[74].

В настоящее время TheraCyte™ считается «золотым стандартом» в технологии макроинкапсулирования ИПК. Однако размер макрокапсулы позволяет поместить в нее небольшое количество клеток, которых не достаточно для достижения нормогликемии у крупных лабораторных животных и человека, поэтому требуется трансплантация нескольких таких устройств, что ограничивает клиническое применение этой технологии.

Трансплантированные внутри контейнера островки Лангерганса долгое время сохраняли жизнеспособность и секретировали инсулин глюкозо-зависимым образом, уменьшая симптомы заболевания у животных с индуцированным диабетом[74–76]. Полигормональные ИПК, введенные таким же образом, дозревали и начинали эффективно регулировать уровень глюкозы только через 2–3 мес. после трансплантации[71, 74, 76].

Было показано, что иммуноизолирующие камеры с политетрафторэтиленовыми мембранами позволяют успешно осуществлять не только аллогенные[73, 75], но и ксеногенные трансплантации. Крысиные островки Лангерганса, помещённые в подобную камеру и трансплантированные свиньям Синклера с индуцированным диабетом, приводили к восстановлению нормогликемии при отсутствии иммуносупрессивной терапии[77].

Использование технологий макроинкапсуляции позволит безопасно и эффективно трансплантировать клетки различных типов. В случае СД это могут быть как донорские островки Лангерганса (алло- и ксеногенные), так и ИПК, полученные путем репрограммирования, в том числе из собственных клеток пациента. Такой подход может привести к созданию радикального способа лечения СД-1 и других заболеваний, обусловленных нарушением синтеза гормонов, так как технология макроинкапсулирования обеспечивает условия для более длительного, возможно, пожизненного функционирования трансплантированных гормон-продуцирующих клеток.

Заключение

В 2014 г. были опубликованы протоколы, которые позволяют получать из ИПСК ИПК, приближенные по своим свойствам к зрелым β-клеткам. Такие клетки в ответ на многократное стимулирование глюкозой высвобождают инсулин из секреторных гранул, тем самым в полной мере реализуя свою физиологическую функцию. Эксперименты in vivo показали способность этих ИПК регулировать уровень глюкозы в крови животных с индуцированным СД[26].

Интенсивно ведутся разработки макроконтейнера, обеспечивающего, с одной стороны, выживаемость трансплантированных клеток, с другой, защиту организма реципиента от их потенциально возможного туморогенного и канцерогенного действия. Данный эффект достигается за счёт полупроницаемости стенок контейнера, способных пропускать кислород, питательные вещества и инсулин, но препятствующих перемещению клеток как внутрь контейнера, так и наружу.

В настоящее время компанией ViaCyte™ уже начаты клинические исследования (1/2 фаза) по трансплантации клеток в контейнере[78].

Несмотря на ряд нерешённых проблем в этой области, имеющиеся к настоящему времени результаты и объём накопленных данных позволяют надеяться, что в ближайшие годы в медицинской практике появится эффективный и относительно недорогой метод лечения инсулинозависимого СД с использованием ИПК, полученных из собственных клеток пациентов.

Подняться вверх сайта