Поиск Кабинет

Инкапсуляция клеток и тканей поджелудочной железы: проблемы и пути их преодоления

Гены & Клетки: Том XI, №1, 2016 год, стр.: 18-23

 

Авторы

Шуплецова В.В., Литвинова Л.С., Карпов А.А., Корнюшин О.В., Неймарк А.Е., Сохоневич Н.А., Василенко М.А., Дора С.В., Деркач  А.С.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Пациенты, страдающие сахарным диабетом 1 типа, несмотря на достигнутые успехи в лечении, имеют продолжительность жизни ниже средней в популяции. Это обусловлено, прежде всего, отсутствием удовлетворительного контроля гликемии у больных диабетом. В последние десятилетия активно ведутся работы по оценке безопасности и эффективности применения различных трансплантационных материалов. В обзоре представлены современные представления о применении инкапсуляции клеток и тканей поджелудочной железы как возможного метода лечения сахарного диабета 1 типа. Рассмотрены основные проблемы использования капсул и возможные пути их преодоления.

Введение

Сахарный диабет (СД) 1 типа – одна из ведущих медико-социальных проблем современности. Известно, что в основе патогенеза СД 1 типа лежит абсолютный дефицит инсулина в результате аутоиммунного поражения β-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы (ПЖ). В последние годы стал отмечаться существенный рост численности пациентов с СД 1 типа. Так по данным Государственного регистра РФ больных сахарным диабетом (ГРСД) распространенность СД 1 типа за 10 лет у детей выросла на 35,7%, у подростков на 68,9%, у взрослых на 2,36%[1].

Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в терапии заболевания, продолжительность жизни больных СД 1 типа все еще остается ниже средней в популяции, что обусловлено, прежде всего, отсутствием удовлетворительного контроля гликемии у больных диабетом. Согласно ГРСД, данные о компенсации СД 1 типа свидетельствуют, что в соответствии с критериями, рекомендованными Международной федерацией диабета (International Diabetes Federation), состояние хронической декомпенсации углеводного обмена наблюдается у 84,5±0,14% детей, 92,6±0,16% подростков и 83,9±0,16% взрослых больных СД 1 типа[2]. Гипергликемия приводит к возникновению и прогрессированию хронических осложнений СД, что и обуславливает инвалидизацию и смертность в молодом возрасте, тогда как мероприятия, направленные на снижение уровня сахара в крови, достоверно уменьшают риск возникновения осложнений[3–5]. В качестве лечения СД 1 типа в настоящее время используется, главным образом, заместительная инсулинотерапия, то есть имитация нормальной физиологической секреции инсулина. В соответствии с рекомендациями ВОЗ и Международной диабетической федерации, для лечения больных СД желательно использовать генно-инженерный инсулин человека или его аналоги. Однако даже использование современных гибких схем введения инсулина, новейших его аналогов не всегда позволяют ряду больных добиться целевых параметров компенсации углеводного обмена, поэтому во всем мире проводятся исследования применения альтернативных, потенциально более эффективных методов лечения.

Основные экспериментальные и клинические подходы с использованием трансплантационных материалов

Экспериментальные и клинические исследования по лечению СД 1 типа с применением разного рода трансплантационных материалов проводятся уже на протяжении длительного времени[6]. Однако пересадка ПЖ и ее участков не привели к желаемому результату, так как для успешного и длительного функционирования подобных трансплантатов необходимо применение пожизненной иммуносупрессивной терапии, которая имеет широкий спектр побочных эффектов и тяжело переносится пациентами. В связи с этим данная операция в настоящее время не получила широкого клинического применения. В настоящее время активно изучается трансплантация островковых клеток ПЖ, синтезирующих инсулин. Данный подход характеризуется меньшими хирургическими рисками и потенциально высокой эффективностью в отношении снижения уровня глюкозы в периферической крови. Донорские аллогенные островки ПЖ изолируют путем перфузии по протокам ПЖ холодной очищенной коллагеназы. Затем после дополнительной диссоциации, ферментирования и отмывки в камере Рикорди, инсулинсекретирующие клетки отделяют от экзокринной и стромальной составляющих, а также от остатков ткани протоков центрифугированием (центрифуга COBE 2991) в градиенте плотности фиколла или других неионогенных радиологических контрастных градиентов, таких как йодиксанол. Таким образом получают клеточный трансплантат, содержащий, в основном, инсулин-секретирующие клетки, что позволяет избежать сосудистых осложнений при инфузии через воротную вену[7].

В сентябре 2004 г. были получены обнадеживающие результаты в одном из первых клинических испытаний трансплантации инсулин-синтезирующих клеток. Из 86 пациентов, которым в рамках программы испытаний Collaborative Islet Transplant Registry (CITR) была проведена трансплантация островковых клеток аллогенной ПЖ, 58% смогли обходиться без инъекций инсулина в течение года после операции. Однако в дальнейшем потребовалось возобновление терапия инсулином. Чтобы трансплантация островковых клеток вошла в широкую клиническую практику, требуется дальнейшее усовершенствование метода. Процедура получения островковых клеток из донорской ПЖ позволяет выделить 18–35% клеток от всей массы эндокринной ткани. Реципиент островковых клеток в этом случае получает около 40% (примерно 2 млн) от нормального числа инсулин-секретирующих клеток, что обеспечивает только 20% нормальной продукции инсулина. В послеоперационном периоде требуется адекватная иммуносупрессия, несмотря на которую иногда происходит отторжение трансплантата. В свою очередь, иммуносупрессивная терапия может ухудшить функции трансплантированных клеток. Таким образом, данное направление лечения инсулинзависимого СД требует дальнейшего изучения и оптимизация.

Еще в 30-х годах прошлого столетия были начаты исследования по разработке методик «иммуномаскировки» и «иммуноизоляции» клеток и тканей ПЖ от системы реактивности организма реципиента. Наиболее перспективный путь в этом направлении – использование методик инкапсуляции β-клеток и их конгломератов. Одной из ключевых задач таких разработок является создание инертных материалов для капсул, выполняющих функции полупроницаемых мембран, не вызывающих иммунный ответ организма и не приводящих к гибели заключенных в них клеток. Поры подобных мембран должны обеспечивать прохождение малых молекул, таких как инсулин (около 6 кДа) и глюкоза, а также предотвращать проникновение крупных молекул (150–900 кДа), например, антител и иммунокомпетентных клеток[8]. Большое значение для успешного функционирования трансплантатов имеет химический состав материалов, применяемых для изготовления капсул, а также степень и качество очистки от посторонних примесей, таких как иммуногенные белковые компоненты, эндотоксины, полифенолы и др.[9–11]. Как правило, капсулы изготавливают из полимеров, которые образуют гидрогели. Наиболее часто используют капсулы из альгинатов – полисахаридов, полученных из морских водорослей. Многие исследования подтверждают иммуноизолирующие свойства альгинатных капсул. Наиболее перспективным является применение капсул из альгината с высоким содержанием α-L-гиалуроновой кислоты[12], с использованием в качестве стабилизатора таких ионов как Ca2+ или Ba2+[13–15], а также альгинатных капсул в сочетании с полиэтиленгликолем[16]. Помимо альгината изучают другие полимерные соединения – агарозу, хитозан, метакриловую кислоту, метилметакрилаты, полиэтиленгликоль и 2-гидроксиэтилметакрилат[17–19]. Вариативные части основного компонента капсул используют с целью максимального снижения иммуногенности, обеспечения длительной жизнеспособности трансплантата и повышения его функциональной активности (выработка инсулина в ответ на стимуляцию глюкозой) [16, 19, 20].

Помимо химического состава для успешного приживления капсул и последующей функциональной активности трансплантата важное значение имеет способ их введения в организм и место их конечной локализации. Следует отметить, что на данный момент существует два типа капсул: макро- и микрокапсулы, значительно отличающиеся по размеру. Так называемые макрокапсулы (диаметр от 1 до 10 см) представлены различными трубчатыми либо дискообразными изделиями, содержащими от нескольких тысяч до миллионов клеток. Микрокапсулы (диаметром 0,2–0,8 мм) представлены сферическими изделиями с полупроницаемой мембраной. Количество клеток в подобных сфероидах может колебаться от одной или нескольких до 103–106 клеток в сфероиде.

В течение последних двух десятилетий были исследованы три основных подхода к способам введения в организм трансплантатов островковых клеток ПЖ:

1) внутрисосудистое введение макрокапсул посредством трансплантации в стенку сосуда (островки заключали в мембрану, а затем полученное изделие соединяли с кровеносным руслом реципиента с помощью сосудистых анастомозов в виде внутрисосудистых шунтов)[21];

2) внесосудистое введение макрокапсул, трансплантированных в различные области (подкожно, забрюшинное пространство, под почечную капсулу и т.д.);

3) внесосудистое введение микрокапсул (в брюшную полость, печень, селезенку, почки, сальник, подкожно)[17, 22–27].

Реакция организма на любое внешнее вмешательство (в том числе и трансплантацию) обеспечивается двумя глобальными механизмами: врожденным и адаптивным иммунными ответами[28]. Таким образом, внесение в организм любого чужеродного материала, используемого для изоляции трансплантатов, в том числе и альгинатного происхождения, потенциально может вызывать разной степени выраженности иммунный ответ, что требует многоплановой проверки на биосовместимость и иммуногенность.

Работы по исследованию биосовместимости не заселенных капсул, введенных в организм млекопитающих, до настоящего времени не дали однозначного ответа об оптимальной локализации капсул в организме, методике имплантации и не выявили наилучший материал. Показано, что пустые микрокапсулы из очищенного альгината не вызывают никакой заметной реакции в организме млекопитающих. В течение длительного времени (максимально до двух лет) не было обнаружено реакций в виде отторжений, активного воспалительного процесса, а также перикапсулярного фиброзирования[11, 29–31]. Кроме того, на биосовместимость пустых капсул не влияет и место их имплантации. Интраперитонеальное, подкожное и околопочечное введение в течение более 30 сут. не приводили к активации вокруг пустых капсул клеток, несущих такие кластеры дифференцировки, как CD68 (моноциты/макрофаги) и CD3 (Т-лимфоциты). Однако аналогичные исследования с капсулами, заселенными ксеногенным трансплантатом островковых клеток ПЖ показали другие результаты: расположенные интраперитонеально капсулы были частично разрушены (более 13%), что привело к морфологическим и функциональным нарушениям находящихся в них островковых клеток ПЖ, а также наблюдалась значительная инфильтрация CD68+-клетками (более 50%). Подобных эффектов не наблюдалось при подкожном и субкапсулярном введениях[24, 32]. Также было показано, что инкапсулированные в альгинат ксеногенные островковые клетки ПЖ остаются жизнеспособными (до 86%) в течение 6 мес. с сохранением функциональной активности, несмотря на выработку антиинсулиновых антител, тогда как неинкапсулированные ксеногенные трансплантаты быстро разрушаются, подвергаясь атаке иммунной системы реципиента[32]. Интрапортальное введение альгинатных микрокапсул с аллогенными островковыми клетками ПЖ у свиней спровоцировала различную степень перикапсулярного фиброза в течение 3 мес., что делает подобную локализацию наименее предпочтительной [22]. Однако, учитывая интенсивное кровоснабжение имплантатов при внутрисосудистой локализации, дальнейшее продолжение исследований в этом направлении с другими материалами может быть более успешным.

Таким образом, исследования in vivo показали успешность метода инкапсуляции (создание биоинженерной ПЖ) как для аллогенной, так и для ксеногенной трансплантаций клеток и тканей ПЖ со снижением иммунореактивности организма реципиента. Актуальны исследования (in vitro и in vivo) по изучению иммунной реакции организма на трансплантаты и иммуноизолирующие материалы. В частности, в экспериментах in vitro было изучено влияние гипоксии (2–5% О2), что является вариантом нормоксии в условиях in vivo, на продукцию цитокинов капсулированными и не инкапсулированными островковыми клетками ПЖ. Гипоксия увеличивала секрецию IL-6 и IL-8/CXCL8 в обеих группах β-клеток, тогда как рост продукции MCP-1/CCL2 был показан только у не инкапсулированных островковых клеток ПЖ. В то же время кислородная депривация в условиях in vitro не оказывала влияния на продукцию IL-9 в экспериментальной и контрольной группах, тогда как секреция IL-12 и VEGF значительно снижалась у неинкапсулированных островковых клеток ПЖ и оставалась неизменной в случае инкапсуляции. В период реоксигенации уровни IL-6, IL-8/CXCL8, MCP-1/CCL2 и VEGF возвращались к первоначальным значениям. Данные факты требуют дальнейшего изучения, так как наряду с фракцией островковых β-клеток, трансплантат содержал примесь секреторных и стромальных клеток (α-клетки, продуцирующие глюкагон; дельта-клетки, образующие соматостатин; D1-клетки, выделяющие ВИП; PP-клетки, вырабатывающие панкреатический полипептид, а также клетки стромы)[33].

Эксперименты, проведенные на NOD мышах (Non-Obese Diabetic mice – искусственно выведенные линейные мыши с индуцированным диабетом, являющиеся экспериментальной моделью СД 1 типа) показали, что островковые клетки свиньи, изолированные и помещенные в капсулы из альгинатполи-L-лизина, без иммуносупрессивной терапии индуцируют иммунную реакцию организма в виде повышенной продукции IFNy, IL-5 и IL-12. Однако уровни таких медиаторов, как IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNFa и TGF-β, остаются неизменными. В случае применения инкапсулированных трансплантатов в комбинации с блокадой ко-стимулирующих путей (CTLA4-CD28/B7, Анти-CD154-CD40/CD40-лиганд) снижалось количество активированных клеток реципиента и, соответственно, выработка провоспалительных цитокинов: IFNy, IL-5 и IL-12[34].

Более полная картина иммунной реакции реципиента была получена при использовании моделей NOD/SCID мышей с инкапсулированными островковыми клетками и мононуклеарами периферической крови человека. Были проанализированы спектры плазменных уровней медиаторов Th1 (IL-1β, IL-1ra, IL-2, IL-5, IL-12, IFN-γ и TNF-α) и Th2 (IL-4, IL-10) путей иммунного ответа, а также некоторых хемокинов, участвующих в процессах активации лимфоидных клеток и связанных, в том числе, с механизмами клеточной деструкции трансплантатов: МСР-1, MIP-1α, MIP-1β, IP-10, эотаксина и RANTES. Предполагают, что гибель островковых клеток у «гуманизированных» мышей связана с цитотоксическим действием высоких (по сравнению с контролем) уровней хемокинов: МСР-1, эотаксина, и IP-10, – вырабатываемых, преимущественно, моноцитами/ макрофагами[21]. Также выявлена положительная роль IL-4 и IL-10 в сохранении и функционировании островковых клеток, инкапсулированных в гиалуронмануроновые альгинатные капсулы, за счет их ингибирующего влияния на продукцию мононуклеарными клетками IL-2 и TNF-α[21].

Основной проблемой, связанной с приживлением и длительным сохранением инсулин-продуцирующей функции клеточных и тканевых трансплантатов ПЖ, является гипоксическая и метаболическая гибель клеток, опосредованная слабым неоангиогенезом, отложением амилоида, и фиброзированием капсул. Перечисленные процессы ассоциированы с каскадным запуском иммунных механизмов[21, 35]. В связи с вышесказанным, снижение иммунореактивности является основным лейтмотивом современных исследований, среди которых ведущими являются нижеприведенные направления.

1. Применение иммуносупрессивных препаратов. В экспериментах in vitro введение такролимуса в среду для культивирования в присутствии IL-1 (50 МЕ/мл) и IF-γ (1000 МЕ/мл) уменьшало оксидативный стресс, что проявлялось значительным снижением липопероксида и оксида азота[36]. Сочетание препаратов, таких как ингибитор протеинкиназы С – AEB-071 и низких доз циклоспорина А, значительно повышало срок функционирования трансплантатов[37]. Интересны варианты имплантации альгинатных капсул высокой степени очистки в сочетании с краткосрочной терапией низкими дозами иммуносупрессивных препаратов (например, циклоспорина А, такролимуса, рапамицина, микофенолат мофетила и т.п.), иногда в сочетании с антителами к провоспалительным цитокинам. В последнем случае отмечалась низкая степень фиброзирования как заселенных, так не заселенных островковыми клетками капсул, даже при относительно длительном (в течение не менее 4–6 нед.) пребывании имплантатов в организме, что свидетельствует, вероятно, о положительном эффекте краткосрочной и низкодозовой иммуносупрессивной терапии[12, 13, 38].

2. Применение новых иммуноизолятов (в основном, многослойных), состоящих из нескольких, уже известных компонентов (альгинат с покрытием из поли-L-орнитина или поли-L-лизина, конъюгаты различных видов альгината и полиэтиленгликоля и т.п.)[34, 39, 40]. Успешна методика инкапсуляции островковых клеток в биотин-ПЭГ-Nгидроксисукцинимид (NHS) с дополнительным покрытием стрептавидином (SA) и глюкагон-подобным пептидом-1 (GLP-1), что способствует не только иммунопротекторным, но и инсулин-стимулирующим эффектам[41].

3. Снижение реакции IBMIR (instant blood mediated inflammatory reaction) и защита от влияния системы комплемента[42]. В частности, С5а-ингибиторный пептид в сочетании с габексата-мезилатом купируют реакцию IBMIR, связанную с активацией системы комплемента при трансплантации островковых клеток[43].

4. Стимуляция неоангиогенеза с применением факторов роста, таких как VEGF, FGF-1 и др. Внесение в среду (в условиях эксперимента in vitro) либо введение в капсулы ангиогенных факторов (in vivo), приводило к усилению миграции и пролиферации эндотелиальных клеток и формированию сосудистой сети вокруг капсул[44–46].

5. Использование потенциальных возможностей клеточной терапии для повышения биосовместимости и снижения иммунореактивности биоинженерных конструкций ПЖ и увеличения «выхода» клеток трансплантата, либо усиления их функциональной активности (со снижением количества трансплантируемого материала). В этом направлении ведутся исследования по со-культивированию агрегатов ПЖ с лимфоидными, эмбриональными стволовыми (ЭСК) и мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками (ММСК) с последующим капсулированием, разрабатываются новые технологии по применению индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток, а также методики «трансдифференцировки», генная терапия и т.п.

По данным ряда авторов ММСК при сокультивировании in vitro и (или) совместной с β-клетками и тканями поджелудочной железы трансплантации реципиентам оказывают ингибирующее влияние на процессы пролиферации Т-клеток и подавляют аутореактивность, реакции отторжения сингенных и аллогенных трансплантатов за счет регуляции механизмов гуморальной активации наивных Т-лимфоцитов и снижения уровней продукции противовоспалительных цитокинов. Кроме того, ММСК обеспечивают благоприятное микроокружение, формируют внеклеточный матрикс, экспрессируя высокие уровни VEGF189 и VEGF165, стимулируют процессы васкуляризации. Все вышеперечисленное приводит к продлению сроков функционирования и улучшает секреторную функцию как инкапсулированных так и не инкапсулированных трансплантатов. Дополнительным эффектом применения ММСК является снижение количества трансплантированных клеток в 1,5–2,0 раза, что также является преимуществом данного метода в условиях дефицита донорского материала[47–51].

В исследованиях последних лет для создания биоинженерной ПЖ показана потенциальная возможность использования не донорских инсулин-продуцирующих клеток, получение которых связано с рядом трудностей, а различных альтернативных источников клеток, таких как ЭСК, iPS клетки и стволовые клетки постнатального происхождения. На современном этапе для генерации инсулин-продуцирующих клеток активно используются методы направленной дифференцировки, репрограммирования и трансдифференцировки[52–55]. Так, в частности, выделенные из тканей поджелудочной железы предшественники, несущие маркеры стволовых клеток (Oct-4, Sox-2, Nanog, ABCG2, Klf-4, CD117), при направленной дифференцировке приобретали специфический фенотип β-клеток[54–56].

Создание трехмерных матриксов-носителей на основе различных биосовместимых материалов – еще один вспомогательный метод для создания биоинженерных конструкций ПЖ. Например, заселение фибробластов в коллагеновый матрикс с последующей инкапсуляцией β-клеток приводит к высокой выживаемости инсулин-секретирующих клеток, индукции пролиферативной активности в связи с выработкой фибробластами факторов роста и фибронектина. Индуцирующие эффекты фибробластов также дают возможность сократить количество трансплантируемых клеток в 2 раза[57, 58]. Есть единичные сведения и о других вспомогательных клетках, формирующих микроокружение трансплантатов клеток островков Лангерганса, таких как клетки Сертоли [59]. Разработка противовоспалительных гидрогелей на основе полиэтиленгликоля, коньюгированного с ингибиторным пептидом IL-1R – противовоспалительным антагонистом IL-1 – является одним из эффективных методов увеличения сроков выживания заключенных в них островковых клеток даже в присутствии таких провоспалительных агентов, как IL-1β, TNF-α, INF-gamma[16]. Новые подходы к формированию капсул, их состава и толщины стенок также приводят к положительным результатам. В частности, иммуноизоляты из ПЭГ-изолированного альгинатного гидрогеля, созданные по технологии, позволяющей уменьшить толщину стенок каждой капсулы до нескольких десятков микрон, способны решить трудную задачу задержки выработки инсулина и его диффузии во внешнее пространство. Подобные капсулы позволяют проводить имплантацию даже в местах, не доступных для других методик, таких как почечное субкапсулярное пространство [60]. Методы блокады ко-стимуляторных факторов активирования наивных Т-лимфоцитов и антигенпрезентирующих клеток путем введения таких антител, как anti-CD154, CTLA4Ig и anti-LFA-1, приводят к повышению сроков выживания и функционирования трансплантированных островковых клеток[34, 61, 62].

Заключение

Таким образом, с учетом высокой инвалидизации и смертности больных СД 1 типа, актуальным является проведение работ, направленных на изучение и разработку новых, более эффективных направлений в лечении данных пациентов. В последние годы возрастает интерес к разработке методов клеточных технологий и тканевой инженерии в лечении больных СД 1 типа с учетом имеющихся технических возможностей. Однако остается нерешенным целый ряд вопросов: фиброзирование капсул, преодоление иммунных механизмов организма и, соответственно, отторжение трансплантатов. Создание противовоспалительных гидрогелей, новые подходы к формированию капсул, их состава и толщины стенок делают работы в данном направлении перспективными.

Подняться вверх сайта