Поиск Кабинет

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки как модель для изучения болезней человека

Гены & Клетки: Том VI, №2, 2011 год, стр.: 32-37

 

Авторы

Е.Д. Некрасов, М.А. Лагарькова, С.Л. Киселев

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Известно, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) способны к бесконечному самовозобновлению и дифференцировке во все типы клеток. Обзор посвящен современным методам и подходам к созданию моделей заболеваний на основе ИПСК человека; недавним достижениям и перспективам в этой области, а также применению таких моделей для изучения заболеваний человека.

Введение

Первые линии плюрипотентных стволовых клеток были получены из внутренней клеточной массы бластоцисты мыши в 1981 г. двумя группами исследователей [1, 2]. Их назвали эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК). Было показано, что ЭСК в специально подобранных условиях культивирования способны длительное время пролиферировать in vitro, оставаясь при этом плюрипотентными. При трансплантации иммунодефицитным мышам ЭСК формируют тератома-подобные новообразования, в составе которых можно идентифицировать производные эктодермы, мезодермы и энтодермы. In vitro ЭСК также способны дифференцироваться в клетки – производные трех зародышевых листков.

Важным свойством ЭСК является то, что, несмотря на длительное существование в культуре in vitro, они сохраняют свойство клеток внутренней клеточной массы, из которой они произошли, а именно, способность полностью выполнить программу онтогенетического развития при обратной имплантации в бластоцисту. В химерных мышах, полученных таким образом, производные ЭСК могут присутствовать во всех тканях, включая клетки зародышевого пути. С ЭСК мыши можно проводить генетические манипуляции in vitro, а затем получать гетерозиготных или гомозиготных мутантных мышей [3, 4]. Эти уникальные свойства ЭСК позволили найти широкое практическое применение для них. Так, за открытие принципов введения специфических генных модификаций в организм мышей посредством эмбриональных стволовых клеток, то есть за изобретение метода нокаута генов, в 2007 г. М. Эвансу, О. Смитису и М. Капеччи была присуждена Нобелевская премия по медицине.

С момента выделения первых линий ЭСК человека в 1998 г. Джеймсом Томсоном и соавт. [5], исследователей интересовал вопрос о получении плюрипотентных стволовых клеток с генотипом конкретного человека, поскольку такие клетки могли бы найти широкое применение в регенеративной медицине и моделировании человеческих заболеваний, что сделало бы их важным тест-объектом. Однако только в 2007 г. удалось получить плюрипотентные стволовые клетки с генотипом конкретного пациента методом индукции плюрипотентного состояния в соматической клетке [6, 7].

Индукция плюрипотентности

Задолго до того, как были получены первые линии эмбриональных стволовых клеток, Д.Б. Гордон и соавт. (1959, 1960) показали, что замена ядра овоцита коричневой лягушки вида Xenopus laevis на ядро соматической клетки лягушки-альбиноса того же вида приводит к образованию клетки, способной развиться в лягушку-альбиноса [8, 9]. Таким образом, впервые была показана возможность репрограммирования ядра соматической клетки до плюрипотентного состояния. В 1997 г. Ян Вильмут и соавт. сообщили о клонировании первого млекопитающего (овечки Долли) методом переноса ядра соматической клетки в энуклеированный овоцит [10]. Это исследование в совокупности с получением линий ЭСК человека в 1998 г. обозначило возможность получения эмбриональных стволовых клеток с генотипом конкретного пациента. Стоит отметить, что механизмы и молекулы, ответственные за феномен репрограммирования ядра соматической клетки, остаются до настоящего времени все еще в значительной степени непонятыми.

Независимые группы исследователей показали, что индуцировать плюрипотентное состояние возможно слиянием соматической клетки и ЭСК [11– 13]. Однако эти подходы не получили широкого распространения.

В 2006 г. профессору Ш. Яманака удалось идентифицировать набор транскрипционных факторов, введение которых в соматические клетки переводит их в ЭСК-подобное состояние [14]. Такие клетки были названы индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (ИПСК).

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки

ИПСК получают из соматических клеток, репрограммируя их до плюрипотентного состояния с помощью набора определенных транскрипционных факторов. В 2006 г. научной группой профессора Ш. Яманака был проведен анализ влияния 24 факторов, тем или иным образом вовлеченных в процессы становления и (или) поддержания плюрипотентности. Используя ретровирусную трансфекцию, авторы произвели трансформацию мышиных эмбриональных фибробластов различными комбинациями данных факторов. В результате экспериментальной работы было установлено, что использование комбинации факторов Oct-4, Sox2, c-Myc и Klf4 необходимо и достаточно для индукции плюрипотентного состояния в мышиных эмбриональных фибробластах [14]. Та же самая комбинация факторов способна индуцировать плюрипотентное состояние в клетках человека [6]. Группа Джеймса Томпсона позже идентифицировала частично перекрывающуюся комбинацию факторов – Oct4, Sox2, Nanog и Lin-28 [7]. Хотя получение линий ИПСК выглядит концептуально и технически простой процедурой, репрограммирование – это процесс, включающий в себя много неизученных событий. На сегодняшний день этот процесс широко исследуется во многих лабораториях мира [15].

ИПСК являются на сегодняшний день более перспективными для применения в регенеративной медицине, чем ЭСК. Их получение не требует использования человеческих бластоцист, которые остаются невостребованными после процедуры экстракорпорального оплодотворения, что снимает этические проблемы. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, как и эмбриональные стволовые клетки, имеют нормальный кариотип, экспрессируют маркерные гены плюрипотентности. Другим преимуществом ИПСК является то, что они в перспективе могут быть получены рутинными методами из клеток любого пациента, что снимает проблемы иммунологической совместимости (рис. 1).

ИПСК и ЭСК

Выяснение эквивалентности ИПСК и ЭСК – это сложный и не разрешенный на сегодняшний день вопрос [16]. Генетические и эпигенетические отличия ЭСК и ИПСК способны влиять на процесс дифференцировки ИПСК, что может привести при дифференцировке к появлению клеток с профилями экспрессии генов и биологическими характеристиками, отличными от клеток, полученных из ЭСК [16].

Критерии, используемые для сравнения ИПСК и ЭСК – это биологические тесты на способность к дифференцировке и молекулярные анализы профилей экспрессии генов, эпигенетических характеристик. Тесты на способность к дифференцировке считают ключевыми в доказательстве плюрипотентности клеток. Для индуцированных плюрипотентных стволовых клеток мыши в качестве основного теста на способность к дифференцировке обычно исполь зуется тест на формирование жизнеспособных химер [16]. В 2009 г. методом инъекции диплоидных ИПСК в тетраплоидную бластоцисту (тетраплоидная комплементация) была получена мышь, организм которой полностью развился из ИПСК, что указывает на эквивалентность некоторых линий ИПСК по своей способности к дифференцировке эмбриональным стволовым клеткам [17].

В случае клеток человека исследователям доступны только менее строгие тесты, такие как in vitro дифференцировки, формирование тератомаподобных новообразований при введении иммунодефицитным мышам и способность к образованию эмбриоидных телец. Способность к формированию тератома-подобных новообразований является необходимым и достаточным тестом для того, чтобы определять клетки человека как плюрипотентные [16].

Модели заболеваний на основе ИПСК

Несмотря на то, что модели на животных продолжают оставаться важным методом изучения заболеваний, такие подходы имеют множество ограничений, которые могут быть преодолены с помощью моделей болезней на основе ИПСК. Таким ограничением, в частности, является отсутствие адекватных моделей на животных для некоторых заболеваний человека.

Благодаря возможности получения ИПСК от любого пациента в совокупности с возможностью их дифференцировки практически в любой клеточный тип модели заболеваний на основе ИПСК потенциально могут быть созданы для любой, даже самой редкой болезни (рис. 2). Способность ИПСК бесконечно пролиферировать и дифференцироваться in vitro в детерминированных условиях позволяет такие модели стандартизировать и автоматизировать. Так как технологии получения, культивирования и дифференцировки ИПСК активно развиваются, можно ожидать, что модели заболеваний на основе ИПСК будут значительно дешевле животных моделей.

Современные стратегии создания клеточных моделей болезней на основе ИПСК

Для заболеваний, имеющих выраженную генетическую этиологию, создание модели болезни человека с помощью технологии ИПСК производится в два этапа: сначала получают ИПСК из соматических клеток пациента, а затем дифференцируют их в клеточные типы, связанные с моделируемой болезнью [18].

Первый вопрос, который возникает перед исследователем – это выбор исходного типа соматических клеток для получения ИПСК. ИПСК уже удалось получить из фибробластов [19], кератиноцитов [20], эндотелиальных клеток [21], нейральных стволовых клеток [22], CD34+ клеток [23] и некоторых других. В большинстве случаев мутация, вызывающая патологию, является наследственной, и, следовательно, содержится во всех клетках пациента. В таких случаях разумно использовать фибробласты кожи, так как их легко культивировать и получать от пациентов с помощью несложной и малоинвазивной процедуры биопсии кожи [18]. А.Д. Эберт и соавт. получили ИПСК из фибробластов кожи ребенка, больного спинальной мышечной атрофией первого типа (МКБ-10 G12.0), затем дифференцировали их в моторные нейроны и культивировали в течение двух недель. Полученные нейроны имели меньший размер и худшую выживаемость по сравнению с нейронами, полученными из ИПСК дикого типа [19]. В случае соматических мутаций только некоторая часть клеток организма содержит мутантный ген, что может вызвать необходимость использовать другие типы клеток. Например, истинная полицитемия является следствием соматической мутации, которая присутствует в CD34+ клетках пациента. Специалисты из университета Джона Хопкинса получили ИПСК из CD34+ клеток двух пациентов, страдающих истинной полицитемией (МКБ-10 D45), причиной которой является соматическая мутация JAK2-V617F. Мутантные линии ИПСК затем дифференцировали в CD34+ клетки и показали повышенную пролиферацию полученных клеток, характерную для данной патологии [23].

Следующий вопрос – это выбор технологии репрограммирования соматических клеток до плюрипотентного состояния. На сегодняшний день наиболее совершенными и перспективными для применения как в регенеративной медицине, так и в моделировании болезней являются ИПСК без геномных интеграций, так как остаточная экспрессия интегрированных копий генов факторов репрограммирования может влиять на профили генной экспрессии и потенциально изменить биологические свойства полученных из ИПСК дифференцированных клеток.Некоторое время назад технологии получения ИПСК без геномных интеграций имели низкую эффективность и поэтому не были широко распространены, однако недавно были описаны высокоэффективные методы получения ИПСК без геномных интеграций [24, 25]. В процессе репрограммирования образуется множество ЭСК-подобных колоний, многие из которых являются трансформированными клетками и не полностью репрограмироваными клонами, поэтому каждая новая линия ИПСК перед дальнейшим использованием в работе должна быть охарактеризована и тщательно протестирована на наличие плюрипотентности [18].

В большинстве случаев вызываемые мутацией нарушения наблюдаются только в дифференцированных клетках и никак не проявляются в ИПСК. Таким образом, на следующем шаге конструирования модели болезни необходимо дифференцировать ИПСК в подверженные патологическим изменениям типы клеток. Уже существуют протоколы дифференцировки ИПСК в нейрональные предшественники [26], моторные нейроны [27], дофамин-продуцирующие нейроны [28], пигментный эпителий сетчатки [29], гепатоциты [30], CD34+ клетки [23], адипоциты [31], эндотелиальные клетки [32] и фибробласты [33]. В процессе дифференцировки, который может занять многие недели, образуются клетки различных типов. Эти клетки перед использованием должны быть охарактеризованы. Как правило, клетки анализируют по поверхностным антигенам и экспрессии ключевых транскрипционных факторов [18], а также проводят функциональные тесты, специфические для каждого типа клеток. Например, нейроны должны образовывать функциональные синапсы, эндотелиальные клетки – образовывать сосудоподобные структуры. Безусловно, очень важно показать функциональность клеток in vivo, при введении иммунодефицитным животным.

Немаловажным фактором построения успешной модели заболевания является выбор контрольных клеток для выявления патологических изменений. Для контрольного сравнения с ИПСК от пациента может быть использован широкий спектр контрольных клеточных линий, таких как охарактеризованные линии эмбриональных стволовых клеток и охарактеризованные линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток от здоровых доноров [18].

В общем случае, для создания модели болезни необходимо использовать наборы линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных от нескольких пациентов, чтобы убедиться, что наблюдаемые эффекты не являются специфическими для данной клеточной линии или определенного пациента. Учитывая генетические различия, которые существуют между неродственными людьми, контрольные клетки, полученные от здоровых родственников пациента, вероятно, будут давать меньшую ошибку в процессе сравнения. Для моногенных заболеваний ИПСК с исправленной генетической мутацией могут служить идеальным изогенным контролем. В случае болезней, вызванных соматическими мутациями, линии ИПСК, полученные из незатронутых мутацией клеток, могут быть использованы в качестве контроля. Например, при хронических миелопролиферативных заболеваниях, которые характеризуются генетическими нарушениями в гемопоэтической системе, линии ИПСК, полученные из кожи пациента, могут служить в качестве контрольных линий для исследования линий ИПСК, полученных из крови пациента [23].

Применение клеточных моделей на основе ИПСК для изучения нейродегенеративных заболеваний

Нейродегенеративные заболевания представляют большую группу различных нарушений, которые сводятся к тому, что определенные группы нейронов деградируют и гибнут. В большинстве случаев, эти нарушения возникают по неизвестным причинам и постоянно прогрессируют. Согласно докладу Всемирной организации здравоохранения (2005), нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, другие деменции и болезнь Паркинсона составили более 14% от общего числа неврологических заболеваний, и их уровень, как ожидают, повысится вместе с продолжительностью жизни в промышленно развитых странах [34]. Подавляющее большинство современных лекарственных препаратов предоставляют только ограниченную помощь пациентам, облегчая определенные симптомы. Более того, их постоянное использование часто вызывает серьезные побочные эффекты, и, видимо, ни один курс лечения не препятствует естественному развитию хронических болезней. Разработке эффективных профилактических и протективных методов лечения нейродегенеративных заболеваний препятствует наше ограниченное знание нейробиологии этих тяжелых состояний и нехватка адекватных модельных систем [35].

Модели нейродегенеративных заболеваний на основе ИПСК, помимо их применения для поиска новых лекарств, вероятно, позволят преодолеть трудности в изучении механизмов развития нейродегенеративных заболеваний, которые отчасти связаны с ограниченным доступом к человеческим нервным клеткам. Благодаря применению ИПСК уже удалось продвинуться в изучении механизмов некоторых болезней нервной системы.

Семейная дизавтономия является редкой периферической нейропатией, вызванной точечной мутацией в гене IKBKAP. Г. Ли и соавт. (2009) получили ИПСК от трех пациентов, больных семейной дизавтономией. Затем они дифференцировали их в клетки-производные всех трех зародышевых листков, в том числе в периферические нейроны. Анализ экспрессии генов в производных ИПСК показал тканеспецифичный аберрантный сплайсинг транскрипта IKBKAP in vitro. В клетках нервного гребня наблюдался особенно низкий уровень экспрессии нормального транскрипта IKBKAP. In vitro тесты показали заметные отличия в нейрональной дифференцировке содержащих мутацию ИПСК и миграционном поведении полученных клеток нервного гребня. Исследователи также использовали ИПСК для изучения воздействия лекарств-кандидатов на аберрантный сплайсинг и функциональные клеточные тесты [36].

К.Д. Бреннанд и соавт. (2011) получили ИПСК от четырех пациентов, больных шизофренией, а затем дифференцировали их в нейроны. Они обнаружили, что нейроны из ИПСК пациентов больных шизофренией образуют меньшее количество нейронных связей, чем нейроны, полученные из нормальных ИПСК. Затем был проведен сравнительный анализ экспрессии генов в полученных группах нейронов, в результате было обнаружено 596 дифференциаль но экспрессированных генов, 25% из которых ранее связывали с шизофренией. Результаты исследования не только подтвердили основные гипотезы о молекулярных механизмах шизофрении, но и идентифицировали сигнальные пути, которые ранее не связывали с этой болезнью [37].

Перспективы развития технологий моделирования болезней, основанных на ИПСК

Подход к моделированию и изучению патогенеза заболеваний с помощью ИПСК был успешно применен для целого ряда заболеваний [19, 23, 38–42]. Вместе с тем, стратегии моделирования более сложных болезней сопряжены со значительными трудностями [18].

Во-первых, сложно моделировать многие болезни старческой возрастной группы, такие как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, несмотря на то, что динамика прогрессии болезней в клеточных типах, полученных путем in vitro дифференцировки ИПСК, будет, вероятно, весьма отличаться от прогрессии болезни у пациента [43]. Одна из возможностей преодоления этой проблемы – искусственное ускорение появления патологических фенотипов в культуре клеток, чего можно добиться, подвергая клетки воздействию внешних факторов, таких, как например оксидативный стресс, который может поспособствовать проявлению болезни.

Другая серьезная проблема изучения патогенеза болезни заключается в том, что могут возникнуть трудности с моделированием болезни in vitro на одном типе клеток. Для решения этой задачи необходимо реконструировать возможные взаимодействия различных типов клеток в ткани. В некоторых случаях требуются типы клеток, для получения которых из ИПСК еще не существует протоколов дифференцировки [18]. Например, еще не удалось получить из ИПСК фолликулярные эндокриноциты.

И, наконец, болезни со значительной эпигенетической составляющей может быть трудно изучать с помощью моделей на основе ИПСК, так как процесс репрограммирования скорее всего удалит любые эпигенетические изменения, связанные с возникновением патологического фенотипа. Эта проблема особенно актуальна для спорадических и многофакторных нарушений, вызванных комбинацией генетических особенностей и воздействия факторов окружающей среды [18]. Внешние факторы, такие как токсичные металлы и пестициды, образ жизни и особенности диеты коррелируют с повышенным риском развития некоторых болезней и могут вызвать изменения в эпигеноме [44]. Таким образом, ИПСК от пациентов со спорадическими заболеваниями, которые вызываются в основном эпигенетическими изменениями, вряд ли можно будет использовать для моделирования заболеваний, если эти эпигенетические изменения не связаны с неизвестными генетическими нарушениями.

Перспективы применения тканевого инжениринга в моделировании болезней

На клетки влияют не только собственные клеточные программы, но и стимулы микроокружения, которые включают в себя соседние клетки, внеклеточный матрикс, факторы окружающей среды и физические силы [18]. Искусственные конструкции на основе биоматериалов, заселенные одновременно несколькими типами клеток, могут обеспечить эффективный способ создания более богатого внешнего окружения, полезного для изучения патологических межклеточных взаимодействий [45]. Эти внешние стимулы особенно важны для моделирования заболеваний, затрагивающих сложные взаимодействия нескольких типов клеток. Например, в процессе сокультивирования астроцитов с мутацией, вызывающей боковой амиотрофический склероз, и моторных нейронов дикого типа, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, обнаружено токсичное воздействие мутантных астроцитов на моторные нейроны [46].

Принимая во внимание, что полная реконструкция архитектуры ткани остается труднодостижимой задачей тканевой инженерии, меньшие функциональные единицы (10–100 мкм) уже были сконструированы для изучения клеточных реакций на различные локальные стимулы. С.Н. Бхатиа и соавт. (2008) использовали легкую литографию, чтобы создать микроскопические кластеры клеток, в которых 500-микрометровые островки человеческих клеток печени были окружены фибробластами. Эти микрокластеры клеточных культур были проанализированы на наличие функций печени с помощью анализа профилей экспрессии генов, метаболизма, секреции специфических факторов печени, и восприимчивости к гепатотоксинам. В результате было показано, что гепатоциты в микрокластерах по своим свойствам более схожи с гепатоцитами в печени, чем обычная культура гепатоцитов [47].

Такие подходы также могут быть применены в трехмерных конструктах, которые получают из коллагена, синтетических биоматериалов и из натуральных внеклеточных матриксов, которые предварительно очищают от живых клеток [48]. Использование производных ИПСК в комбинации с биоматериалами, например, формирование микрокластеров клеток на трехмерных матриксах, могло бы заполнить промежуток между традиционными клеточными культурами и животными моделями.

Заключение

Создание клеточных моделей большинства болезней человека – это большой и долгосрочный проект. По всей видимости, потребуются многие годы, чтобы адекватно решить существующие задачи для широкого круга заболеваний. Однако уже достигнут определенный прогресс в моделировании некоторых заболеваний. Применение таких моделей уже позволило найти малые молекулы – кандидаты для лечения семейной дизавтономии [36] и спинальной мышечной атрофии I типа [19]. Более того, модели болезней человека на основе ИПСК позволили продвинуться в изучении некоторых нейродегенеративных заболеваний [36, 37]. Клеточные модели на основе ИПСК выглядят особенно полезными в отношении орфанных заболеваний, для которых не существует моделей на животных и количество носителей болезни невелико. Для более сложных заболеваний можно ожидать синтез достижений в исследовании индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и конструировании тканей.

Подняться вверх сайта