Поиск Кабинет

Индукция нейральной дифференцировки стромальных клеток жировой ткани

Гены & Клетки: Том III, №4, 2008 год, стр.: 50-54

 

Авторы

Лопатина Т.В., Калинина Н.И., Ревищин А.В., Беме АА, Спирова ИА., Павлова Г.В., Парфенова Е.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В работе исследованы способы индукции нейральной дифференцировки стромальных клеток жировой ткани (СКЖТ). Для выделения стромальных клеток использовали жировую ткань человека и мыши. СКЖТ второго пассажа были индуцированы различными агентами, в том числе изобутилметилксантином (Isobutylmethylxanthine, IBMX], $-меркаптоэтанолом, глия-производным нейротрофическим фактором, (glial cell line derived neurotrophic factor, GDNF), мозг-производным нейротрофическим фактором, (brain-derived neurotrophic factor; BDNF), рети-ноевой кислотой (retinoic acid, RA), 5-азацитидином, а также сочетанием этих веществ. Через 3 сут. после индукции проводили анализ дифференциальной экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени. Эффективность индукции оценивали на основе повышения транскрипции маркерных генов нейральной дифференцировки: нестина, $3-тубулина, МАР2 и нейрон-спе-цифической енолазы (Епо2). Экспрессию маркерных белков нейральной дифференцировки тестировали с помощью вестерн-блот анализа. При добавлении в индуцирующую среду RA или BDNF в сочетании с 5-азацитидином и культивировании СКЖТ с этими индукторами в течение недели увеличивается количество мРНК и белка нестина, тубулина и Епо2. При трансплантации в головной мозг мыши индуцированных мышиных СКЖТ, увеличивается время жизни этих клеток, а также наблюдается миграция из области введения в ткани мозга реципиента. Таким образом, воздействие на СКЖТ ретиноевой кислоты и BDNF в сочетании с 5-азацитидином повышает уровень транскрипции нейральных маркеров, а также жизнеспособность и интеграцию этих клеток после трансплантации в головной мозг мыши.

Введение

Строма жировой ткани содержит малодифференцированные клетки-предшественницы, которые по своему фенотипу и экспрессионному профилю сходны с мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга[1]. Стромальные клетки-предшественницы из жировой ткани (СКЖТ) под действием различных индукторов способны дифференцироваться in vitro в различные типы клеток: остеобласты, хондробласты, адипоциты

[2], гепатоциты, эндотелиальные клетки [3], миоблас-ты [4], кардиомиоциты [5], эпителиальные клетки [6], а также нейральные предшественники [7]. В частности, нейральную дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток можно индуцировать с помощью ретиноевой кислоты [8] и нейротрофических факторов [9, 10]. Однако способность СКЖТ воспринимать сигналы нейротрофических факторов остается невыясненной. Кроме того, до сих пор не было предложено оптимального способа индукции нейральной дифференцировки СКЖТ in vitro.

В данной работе проведен сравнительный анализ эффективности нейральной дифференцировки под действием различных индукторов, как по ранее опубликованным [2], так и по разработанным нами протоколам, основанным на использовании ретиноевой кислоты и BDNF в сочетании с 5-азацитидином — химическим соединением, вызывающим деметилирование ДНК. BDNF способен активировать пролиферацию нейральных стволовых клеток и их дифференцировку [11]. Ретиноевая кислота активирует транскрипцию генов, участвующих в регуляции нейральной дифференцировки, посредством взаимодействия с ядерными рецепторами.

Материал и методы

Выделение стромапьных клеток из жировой ткани

СКЖТ были выделены по протоколу P.A. Zuk et al. [12]. Подкожная жировая клетчатка человека была получена при полостных операциях у неонкологических больных, средний возраст которых составлял 4СЫ30 лет. СКЖТ мыши были выделены из подкожного жира паховой области самцов линии Black/б. Жировую ткань измельчали ножницами, затем обрабатывали коллагеназой («Invitrogen», США, 30 ед. на мл ткани) и протеазой («Gibco», США, 200 ед. на мл ткани) в течение 40 мин при 37°С при постоянном перемешивании. Затем в суспензию добавляли равный объем среды DMEM («Gibco», США) с 10% фетальной сыворотки коров (FBS, «Gibco», США) и центрифугировали 5^10 мин при 900 оборотах в минуту. Осадок, в котором находилась фракция стро-мально-васкулярных клеток, ресуспендировали в DMEM с 10% FBS и фильтровали через 100-мм клеточный фильтр (BD Biosciences, Bedford, МА). Далее клетки высаживали на культуральные чашки Петри («Costar Corning», США) и помещали в С02-инкубатор при 37°С и 5% С02. На следующий день в чашках меняли среду. Таким образом, в культуре оставались только прикрепившиеся клетки. После образования монослоя клетки снимали трипсином и рассевали в соотношении 1:2.

Окрашивание клеток и проточная цитометрия СКЖТ были охарактеризованы по наличию антигенов CD34 (Dako, # С7238), c-kit (Dako, # R7145), CD73 (BD, # 550257), CD105 (Serotec, # MCA1557). Клеточную суспензию (0,5^1 х108 клеток) первичной культуры и второго пассажа в 500 ц1 PBS буфера (phosphate buffered saline) инкубировали с первичными антителами в течение 40 мин. После трехкратной отмывки в PBS клетки инкубировали с вторичными антителами. Флуоресценция клеток была оценена методом проточной цитометрии на приборе MoFlo (Dako Cytomation, Дания) и проанализирована с помощью программы Summit 4.1. Изотипический контроль присутствовал в каждом эксперименте, и специфичность окрашивания была подтверждена сравнением флуоресценции между контролем и специфическими антителами. Всего для определения наличия антигена анализировали более 300 ООО клеток.

Индукция нейральной дифференцировки После 2-го пассажа СКЖТ переносили в 6-луночную плату и заливали средой DMEM с 10% FBS. Через сутки среду заменяли на DMEM/F12 с 3% FBS и добавляли индукторы (табл. 1).

Анализ изменения транскрипции генов Через 3 сут. после индукции из клеток выделяли суммарную РНК («RNeasy Mini Kit», «QIAGEN», США). Затем синтезировали кДНК согласно стандартному протоколу фирмы «Fermentas», используя олиго^Т-праймеры. Анализ дифференциальной экспрессии генов проводили методом ПЦР в реальном времени с применением Sybr Green («Синтол», Россия). Используемые в работе праймеры представлены в табл. 2.

Иммунофлуоресцентное окрашивание индуцированных СКЖТ

Для анализа индукции дифференцировки на белковом уровне СКЖТ 2-го пассажа переносили в 8-луноч-ные стеклянные платы (Lab-Tek Chamber Slide, Nalge Nunc Int.) и на следующий день вносили индукторы. Через 3 сут. индуцирующую среду меняли на свежую, также содержащую соответствующие индукторы, культивировали еще 4 сут., после чего фиксировали в 4% растворе формальдегида 2 мин при комнатной температуре с последующей 3-х кратной отмывкой PBS. После отмывки клетки обрабатывали 1% раствором БСА (бычий сывороточный альбумин) с 10% козьей сыворотки в течение 30 мин, затем в течение 1 часа инкубировали при комнатной температуре в растворе кроличьих антител против нестина (Chemicon, США, 1:100), Eno2 (Chemicon, США, 1:50) и мышиных против тубу-лина (Abeam, 1:100). В качестве отрицательного контроля использовался 1% раствор БСА с 10% козьей сывороткой. После отмывки в PBS клетки в течение 30 мин инкубировали в растворе PBS с флуоресцентными вторичными козьими антителами (1:100) против иммуноглобулина мыши (Alexa 488, Molecular Probes, США) или против иммуноглобулина кролика (Alexa 568, Molecular Probes, США).

Статистический анализ

Статистический анализ данных проводился с использованием программы SigmaStat 9.0. Для сравнения маленьких групп и ненормальных распределений использовался U-критерий Манна-Уитни. Различия считались статистически значимыми при уровне значимости р<0,05.

Результаты и обсуждение

Характеристика первичной культуры СКЖТ

Исходная популяция стромально-васкулярных клеток жировой ткани гетерогенна. На основании анализа экспрессии маркерных антигенов на поверхности этих клеток можно утверждать, что в этой популяции содержатся стволовые клетки, сходные по антигенному профилю с мезенхимальными и гемопоэтическими клетками-пред-шественницами [13—15]. После выделения из ткани культивируемые СКЖТ образовывали монослой фиброб-ластоподобных клеток. Через 8^9 сут. культивирования определяли соотношение мезенхимальных и гемо-поэтических клеток-предшественниц в этой популяции. Оказалось, что популяция клеток 2-го пассажа содержит около 98% клеток, имеющих фенотип мезенхимальных клеток-предшественниц, содержащих антигены CD73 и CD105. Несмотря на то, что в первичной культуре СКЖТ большинство клеток, несущих антиген CD73, экспрессировали также маркерный антиген гемопоэти-ческих стволовых клеток CD34, на клетках 2 пассажа экспрессия этого антигена практически была нулевая. Это согласуется с ранее опубликованными данными о том, что экспрессия мембранного гликопротеида CD34 на клетках снижается по мере их культивирования. Что касается маркера гемопоэтических стволовых клеток с-kit, то в популяции СКЖТ 2 пассажа обнаружено около 1% клеток, несущих этот антиген. Доля клеток, содержащих c-kit, не изменилась по сравнению с популяцией свежевыделенных СКЖТ. Эти данные свидетельствуют о способности гемопоэтических предшественников к са-моподдержанию в составе популяции. Проверка эффективности различных индукторов дифференцировки

Нейральная дифференцировка клеток сопровождается повышением экспрессии специфичных генов. В частности, клетки, дифференцирующиеся в нейральном направлении, содержат белок цитоскелета нестин (маркер ранних нейральных предшественников), нейрональную форму рЗ-тубулина, глиальный кислый фибриллярный белок GFAP (маркер астроцитарной глии), белок, взаимодействующий с микротрубочками МАР2, специфичную для нейронов енолазу Епо2 и другие маркеры нейральной дифференцировки.

Нами было проанализировано содержание продуктов, перечисленных выше, маркерных генов нейральной дифференцировки в СКЖТ, инкубированных в присутствии 5-азацитидин [2, 7, 16], а также нейротрофических факторов роста BDNF и GDNF (см. табл. 1). Продукт гена GFAP не определялся ни в контрольных СКЖТ, ни в клетках, инкубированных в присутствии индукторов, перечисленных в табл. 1. Анализ содержания мРНК других маркерных генов показал, что уровень экспрессии Eno2, МАР2, TUBB и Nestin был выше в клетках, инкубированных в присутствии ретиноевой кислоты или BDNF на фоне 5-азацитидина (табл. 3).

В СКЖТ, культивированных в присутствии других индукторов нейральной дифференцировки, увеличения уровня мРНК маркерных генов нейральной дифференцировки не наблюдалось (см. табл. 3).

На основании полученных результатов для индукции нейральной дифференцировки СКЖТ были выбраны ре-тиноевая кислота или BDNF в сочетании с 5-азацитиди-ном. При индукции дифференцировки СКЖТ, полученных от 8 доноров, было установлено, что при культивировании клеток в присутствии ретиноевой кислоты в сочетании с 5-азацитидином в этих клетках возрастал уровень мРНК, нестина и тубулина. Индукция нейральной дифференцировки клеток с помощью BDNF в сочетании с 5-азацитидином вызывает увеличение экспрессии всех 4 проанализированных генов (табл. 4).

Полученные данные были подтверждены с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания индуцированных клеток. Показано, что инкубация клеток с ретиноевой кислотой приводит к повышению содержания в них не-стина и рЗ-тубулина, а в СКЖТ, культивированных в присутствии BDNF, возрастает содержание как нестина и Епо2 (рис. 1). Активация экспрессии генов Епо2, МАР2, TUBB и Nestin в СКЖТ, культивированных в присутствии BDNF или ретиноевой кислоты, может свидетельствовать об индукции нейральной дифференцировки этих клеток. Ретиноевая кислота в комплексе с белком CRABP входит в ядра клеток и взаимодействует с транскрипционным комплексом, который включает пару рецепторов ретиноевой кислоты RAR (retinoic acid receptor) и RXR (retinoic X receptor). По последним данным, ретиноевая кислота влияет на экспрессию около 530 генов, из них более 27 являются ее непосредственными мишенями. В частности, это гены транскрипционных факторов, таких как Hoxal, Н0ХА4, НохМ, Hoxb4, Hoxd4, Cdx1, и Pit1, которые принимают участие в регуляции эмбрионального развития [17]. BDNF — это нейротрофический фактор, контролирующий жизнеспособность, развитие и функционирование нервных клеток в центральной и периферической нервной системе [11].

Индуцированные мышиные СКЖТ способны встраиваться в ткань стриатума мыши

Для того чтобы проанализировать способность СКЖТ после индукции нейральной дифференцировки встраиваться в ткань мозга мыши, нами были использованы клетки самцов мышей линии Black/б, трансгенных по гену GFP. СКЖТ, содержащие зеленый флуоресцентный белок, культивировали в присутствии ретиноевой кислоты или BDNF в течение 3-х сут. Затем эти клетки были введены в стриатум мышей линии Black/б, не экспрессирующих белок GFP. Через 7, 9 и 11 сут. головной мозг извлекали, проводили анализ распределения трансплантированных клеток с помощью флуоресцентного микроскопа. Уже через 9 сут. после инъекции были заметны различия в распределении контрольных и индуцированных клеток в ткани мозга. Так, контрольные клетки не контактировали с тканью реципиента и располагались исключительно в области трека, оставленного иглой. Напротив, СКЖТ, культивированные в присутствии индукторов, мигрировали в ткани мозга (рис. 2).

Более того, через 11 дней после инъекции в стриа-туме не обнаруживалось контрольных клеток, тогда как СКЖТ, индуцированные в нейральную дифференциров-ку, выживали в мозге мыши-реципиента.

Заключение

Обнаружено, что BDNF и ретиноевая кислота в сочетании с 5-азацитидином вызывают активацию экспрессии маркерных генов нейральной дифференцировки в СКЖТ. Однако использование этих факторов без 5-азацитиди-на оказалось малоэффективным. С помощью анализа увеличения транскрипции маркерных генов нами были подобраны эффективные индукторы нейральной дифференцировки СКЖТ. Выживаемость и способность индуцированных клеток к миграции была проверена in vivo с помощью трансплантации индуцированных мышиных СКЖТ, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP), в головной мозг мыши. Клетки, в которых была индуцирована нейральная дифференцировка, способны встраиваться в ткань мозга реципиента после трансплантации и сохранять жизнеспособность более 11 сут. после введения. Для того чтобы установить, какие пути внутриклеточной сигнализации опосредуют индуцирующее воздействие BDNF и ретиноевой кислоты на нейральную дифференцировку СКЖТ, необходимы дальнейшие исследования. Таким образом, трансплантация СКЖТ, в которых была индуцирована нейральная дифференцировка, может являться перспективным подходом для восстановления нервной ткани.

Подняться вверх сайта