Поиск Кабинет

Имплантат — носитель клеточного материала из пористого проницаемого титана

Гены & Клетки: Том I, №3, 2006 год, стр.: 59-63

 

Авторы

Итин В.И., Прибытков Г.А., Хлусов И.А., Загребин Л.В., Шестов С.С.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В работе проведен анализ свойств нового материала для изготовления имплантатов — пористого титана. Показано, что материал обладает достаточными механическими свойствами. Поглощение биологической жидкости составляло 7,5%. Материал совместим с живыми клетками. При культивировании клеток костного мозга мыши и фетальных человеческих гепатоцитов в условиях дексто-ровской системы и in vivo у мышей, такой имплантат функционирует как очаг гемопоэза в течение всего срока наблюдений — до 9 мес. Получены данные о депрессирующем влиянии на рост и развитие лимфом. Таким образом, данный материал можно рассматривать как перспективный носитель для клеток в трансплантологии и создания «искусственных органов».

В настоящее время клеточная и тканевая трансплантация рассматривается как перспективный метод лечения широкого спектра патологии, включая онкологические и он-когематологические заболевания. Тем не менее, существуют проблемы клеточной терапии [строгий отбор пациентов, иммунные реакции хозяина, расселение трансплантированных клеток в организме, быстрая их элиминация, краткосрочный эффект лечения), которые можно решить либо минимизировать с помощью применения носителей-инкубаторов для клеточного материала. Они позволяют ставить вопрос о возможности создания, выращивания и имплантации искусственных органов, пролонгации терапевтических эффектов трансплантированных клеток.

6-й мировой конгресс по биоматериалам, состоявшийся в США в 2000 г., обозначил различные направления поиска материалов для конструирования носителя, например, полимеры, керамику, металлы. В практике наших лечебных учреждений активно используется пористый титан, обладающий наиболее оптимальными физико-химическими и биомедицинскими свойствами. В связи с этим экспериментальное и клиническое тестирование пористого титана [ПТ) как перспективного носителя для формирования гибридных имплантатов и искусственных органов представляет несомненный интерес.

Одно из основных направлений в проблеме создания функциональных неорганических материалов и конструкций для лечения различных заболеваний и травм связано с разработкой и исследованием искусственных аналогов тканей и отдельных органов, в частности, имплантатов, которые являются носителями [scaffold) клеточного материала, в первую очередь, стволовых клеток. Введение в организм такого имплантата-носителя повышает эффективность трансплантации клеточного материала по сравнению с инъекционным назначением, позволяет пролонгировать терапевтические эффекты трансплантированных клеток.

Для создания имплантатов-носителей [scaffold-технология] могут быть использованы различные материалы: графит, полимеры, керамика, металлы и их сплавы [1-6]. В связи со спецификой различных клеток и тканей организма каждый вид искусственных материалов может найти свою нишу. В частности в качестве имплантата-носителя клеточных культур применяют пористые проницаемые металлические материалы с памятью формы, например, пористый никелид титана [7-8], полученный методом самораспространяющегося высокотемпературного синтеза [9].

В состав этого сплава входит около 50 ат.% никеля. Известно, что никель является токсичным элементом, обладает аллергенной и канцерогенной активностью и около 15% людей характеризуются повышенной чувствительностью к нему. Этот металл в виде ионов Ni2+ оказывает сильное хе-миотоксическое действие на клетки организма и является биокатализатором, ускоряющим процесс деструкции протеинов плазмы крови. При имплантации никеля в организм достоверно установлены канцерогенная активность иона Ni2+ и широкая зона воспалительных процессов, связанных с растворением никеля в тканевых жидкостях.

Несмотря на тот факт, что сплавы на основе никелида титана не подвергаются заметной коррозии, так как при пассивации в биологических жидкостях на их поверхности образуется слой, содержащий небольшое количество никеля, проблему их биосовместимости нельзя считать решенной.

Рекомендуемые в качестве материала носителей клеточного материала нержавеющая сталь и кобальт-хромовые сплавы [3] также оказывают сильное влияние на клеточные и внутриклеточные процессы. При превышении содержания железа выше физиологической нормы нарушаются окислительно-восстановительные процессы в тканях, а ионы железа обладают цитотоксическим действием [11 ]. Ион хрома Сг+ имеет очень малый ионный радиус [0,47 А), легко проникает внутрь клетки через клеточные мембраны и взаимодействует с ДНК, вызывая мутации [10]. Ионы кобальта Со+ совместно с ионами хрома и/или никеля при высоких концентрациях приводят к некрозу клеток. Выживаемость клеток при содержании 400мг/моль никеля или кобальта равна нулю [11], в результате тест LCso [критерий цитотоксичности химических веществ) для этих элементов отсутствует.

Таким образом, сплавы, содержащие никель, кобальт и хром оказывают отрицательное воздействие на жизнеспособность клеточного материала.

Использованию титана в медицине посвящено огромное количество публикаций, в которых показана его биоинертность, причем увеличение содержания титана в организме на несколько порядков не оказывает аллергенного, канцерогенного или токсического воздействия [11]. В частности, не обнаружено цитотоксического эффекта при взаимодействии пористого титана с культурой клеток костного мозга [12]. Этот результат полностью подтверждает данные [13], полученные ранее в условиях in vitro при взаимодействии сплавов титана с культурой спинномозгового узла новорожденных крыс. Оказалось, что ионы титана не влияют на клеточные мембраны. Индекс биофункциональности В титана и его сплавов медицинского назначения заметно выше, чем других материалов, особенно керамик [S = а /Е, где а - предел выносливости, г. Е- модуль Юнга).

В настоящей работе предлагается в качестве материала имплантата-носителя клеточного материала взамен нержавеющей стали, кобальт-хромовых сплавов и сплавов на основе никелида титана использовать пористые проницаемые материалы на основе спеченного титана.

Материал и методы исследования

Использовали порошок титана с размером частиц менее 160 мкм и со следующим содержанием основных примесей [% вес): Fe < 0,330; О < 0,080; N < 0,033. После сушки в вакуумном сушильном шкафу при 300°С в течение 2 часов порошок спекали в вакууме 133-10"5 Па при различных температурах в интервале 1000-1300°С в течение 4 часов.

Вид порового пространства и химический состав спеченного титана изучали методами растровой электронной микроскопии и микрорентгеноспектрального анализа [Phillips SEM515 с приставкой EDAX EKOHIV).

Спеченные образцы в виде цилиндров диаметром 8 и высотой 12 мм испытывали на одноосное сжатие при скорости деформации 1 мм/мин, на испытательной машине «In-stron 5582» с реверсивным устройством.

Для тестирования гидрофобных и гидрофильных свойств пористого титана использованы конструкции с размерами 3,3^3,6x16 мм с общей пористостью 58% и размером пор около 100 мкм. Жидкостью насыщались интактные изделия, а также после насыщения 96° этанолом и отжига в пламени спиртовки. В качестве биологических жидкостей применялись: 1 - сбалансированный фосфатный буфер Дульбекко без ионов кальция и магния [жидкая среда); 2 -полная культуральная среда [ПКС) для клонирования клеток, включающая 1% метилцеллюлозы, 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 94% среды RPMI-1640 [полувязкая среда).

Степень насыщения образцов жидкостью определяли весовым способом. Масса исходных титановых изделий варьировала в пределах 329-442 мг.

Клетки костного мозга вымывали из бедренной кости мышей СВА/CaLac средой RPMI-1640 с 5% эмбриональной телячьей сыворотки [ЭТС), разводили полной культуральной средой [без гидрокортизона) до требуемой концентрации жизнеспособных нуклеаров. Затем во взвесь миелокарио-цитов помещали ПТ. Через 24 часа ПТ переносили в другие пробирки, определяли число заселившихся в него клеток и выращивали в течение 6 недель при 37° С и 5% СО2 в культуральной среде следующего состава: 12,5% ЭТС, 12,5% лошадиной сыворотки, 300 мг/л L-глутамина, 2,5 х 10-5 М 2-меркаптоэтанола, 10-6 гидрокортизона гемисукцината и 75% RPMI-1640. Каждую неделю меняли половину среды [1 мл).

Подсчитывали число ядросодержащих, а также жизнеспособных миелоцитов в культуральной среде, оценивали морфологию клеток. Количество коммитированных прекурсоров грануломоноцитопоэза [КОЕ-ГМ) и гранулоцитопоэза [КОЕ-Г) в жидкой фазе определяли методом колониеобра-зования в метилцеллюлозной культуре при клонировании миелоцитов в течение 7 суток. В качестве стимуляторов роста применяли супернатант стимулированных ФГА сплено-цитов мыши [10%) в комбинации с рекомбинантным Г-КСФ человека [6 нг/мл).

«Искусственную эмбриональную печень» человека создавали in vitro путем засевания фетальных клеток печени 11-й недели гестации в конечной концентрации 20*106 на 1 пластину из ПТ. Под эфирным наркозом по одному «искусственному органу» имплантировали каждой из 20 3-месячных мышей линии AKR/JY. 20 животных составляли контрольную группу. Через 4 дня после трансплантации и на 4, 5, 7 и 9-й месяцы у мышей изучали состояние системы крови [костный мозг, периферическая кровь, тимус, селезенка), что требовалась для определения эффективности работы имплантатов и причин гибели животных.

Статистическую обработку результатов осуществляли согласно t-критерию Стьюдента и Т-критерию Вилкоксона. Интегральный показатель (ИП), характеризующий снижение (< 100%) либо увеличение [> 100%) суммы изучаемых показателей относительно их исходных величин, вычисляли как описано ранее.

Результатыi и их обсуждение

Микроструктура и деформационное поведение пористого материала

Исследование рельефной топографии поверхности частиц порошка титана показывает, что они относятся к типичному губчатому морфологическому типу, при этом на гладких поверхностях частиц видны округлые выросты разных размеров [рис. 1). После спекания порошинки образуют каркас с открытыми порами, имеющими размер в интервале 50-200 мкм. Поры характеризуются неопределенной формой с морфологически слабо развитыми поверхностями, в значительной части наследующими форму и вид поверхности исходных частиц [рис. 2). Пористость спеченного материала составляет 50-65% в зависимости от режима спекания.

Данные микрорентгеноспектрального анализа, проведенного на изломах спеченного титана, показывают, что концентрация основных примесных элементов соответствует его содержанию в исходном порошке. Таким образом, спеченный титан полностью наследует состав порошка.

Характерная кривая «напряжение-деформация», описывающая упруго-пластическое поведение спеченного титана в условиях одноосного сжатия приведена на рис. 3. На кривой отчетливо выделяются участки упругой деформации, пластического течения и резкого падения нагрузки после достижения максимума. Падение нагрузки соответствует разрушению цилиндрического образца вследствие появления одной или нескольких диагональных трещин.

Полученные результаты показывают, что модуль Юнга и предел прочности пористого спеченного титана соответствуют показателям для некоторых видов тканей человека, например для губчатого вещества бедренной кости (eg = 68,7 - 147 МПа) [14].

Поглощение биологических жидкостей

Результаты исследований поглощения биологических жидкостей ПТ представлены в табл. 1. Интактный ПТ практически не смачивается биологическими жидкостями. Были использованы два способа смачивания: 1 - опускание в жидкость («пассивное смачивание»); 2 - насыщение пористой структуры жидкостью с помощью автоматического дозатора («активное смачивание»). В обоих случаях поглощение жидкостей (как раствора Дульбекко, так и ПКС) не превышало 7,5-11,7% от массы изделия, что соответствовало 29-44 мкл (75-117 мкл на 1 г пористого металла). Большая часть жидкости стекала по поверхности изделий, глубоко не проникая в пористую структуру. Интересен тот факт, что ПКС, проявляющая одновременно гидрофильные и гидрофобные свойства, также плохо всасывалась изделиями (на уровне 10,9 масс%). Похожие данные были получены ранее при испытании ок-сидциркониевой керамики с пористостью около 60% [15]. Поглощение биологической жидкости составляло 7,5%.

В другой серии опытов образцы из пористого титана смачивали 96° этиловым спиртом и отжигали в пламени спиртовки. После отжига результаты смачиваемости улучшились в 3-4 раза (см. табл. 1). В данном тесте жидкость активно входила в поры изделий. В случае применения раствора Дульбекко поглощение жидкости достигало 14,9-33,7 масс%. При использовании полувязкой ПКС данный показатель оставлял 32,4-35,1 масс% (323-351 мкл на 1 г пористого титана).

Полученные результаты показывают, что пористый титан наиболее пригоден как матрица для клеток при условии его отжига в пламени спиртовки.

Биологическая совместимость с клеточным материалом

Поскольку гибридные имплантаты предполагают комбинацию биоматериала (-ов) и живых клеток для длительного нахождения в организме, на первом этапе мы изучили влияние ПТ на жизнедеятельность клеток in vitro и in vivo. Длительное культивирование клеток костного мозга (ДККМ] согласно модели, предложенной М. Dexter, оказалось удобной системой для изучения.

Результаты показали, что через 6 недель инкубации на ПТ in vitro доля выживших клеток костного мозга, продуцируемых из ячеек носителя в жидкую среду, варьировала в пределах 58-82%, что соответствовало цифрам 1-й недели инкубации [рис. 4). При этом культура отдельных клеток на ПТ приобретала свойства, сближающие ее с нативной тканью. Так, молодые, близкие по своим пролиферативным и дифференцировочным потенциям к стволовым, клетки [например, клетки-предшественники гранулоцитопоэза и гра-нуломоноцитопоэза, КОЕ-Г, КОЕ-ГМ) находятся внутри пор и плохо выходят в окружающую среду [так называемый костномозговой барьер) [рис. 5).

В дальнейшем изучалось поведение гибридных имплантатов [ПТ + фетальные гепатоциты человека) в организме мышей AKR/JY и реакция животных, страдающих спонтанной Т-клеточной лимфомой. Лимфома имеет свойства и гематосаркомы, и солидной опухоли, что было удобным для аппроксимации полученных данных в онкологическую практику.

Оказалось, что имплантат успешно приживается, так как за исключением первоначального нейтрофильного лейкоцитоза, обусловленного стресс-реакцией на оперативное вмешательство, в последующие 3 месяца заметных колебаний лейкоцитарной формулы не наблюдалось. Более того, через

3-4 недели после введения в организм «искусственная печень» человека начинала активно функционировать. Об этом свидетельствует 3-кратное увеличение уровня эритроцитов с фетальным гемоглобином, происходящих из эритроид-ных прекурсоров фетальной печени и в норме практически не встречающихся у взрослых мышей [табл. 2). Одним из положительных эффектов является постимплантационная активация эритрона реципиентов, что проявлялось в увеличении [на 274%, P<0,05) числа ретикулоцитов в крови. Кроме того, на 26% снижалась активность опухолевого процесса, что было обусловлено, по-видимому, развитием реакции «трансплантат против опухоли». Очень важным для дальнейших исследований следует признать развитие в 33% случаев реакции «трансплантат против хозяина» [РТПХ) [табл. 3).

С одной стороны, иммунологический конфликт свидетельствует о созревании фетальных ксеногенных клеток, слабо экспрессирующих антигены главного комплекса гистосовместимости, в зрелую иммуногенную ткань. В этом случае речь уже не может идти об эмбриональной терапии, сталкивающейся с острыми этическими проблемами. С другой стороны, зафиксированный уровень РТПХ при огромном количестве пересаженного мышам клеточного материала можно считать умеренным, по-видимому, вследствие иммуноизолирующих, барьерных свойств ПТ.

Таким образом, экспериментальный блок исследований показал, что в системах in vitro и in vivo отдельные клетки, пересаженные на ПТ, активно созревают и формируют единую тканевую структуру. Это позволяет перевести гибридные имплантаты, имеющие ПТ в качестве носителя, в разряд гибридных искусственных органов, предназначенных для временной, либо постоянной замены утраченной функции природного прототипа.

Безопасность имплантата-носителя клеточных культур из пористого титана оценена в испытательной лаборатории биологической безопасности медицинских изделий ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов министерства здавоохранния и социального развития: «О токсикологических, санитарно-химических испытаниях, испытаниях на пирогенность, стерильность №036.0149.Р.05 от 23.06.05».

В результате испытаний показано, что имплантат-носитель для хирургического лечения внутренних органов не обладает местнораздражающим, сенсибилизирующим и токсическим действием, стерилен, соответствует требованиям, предъявляемым к изделиям, длительно контактирующим с внутренней средой организма.

Подняться вверх сайта