Поиск Кабинет

Иммунорегуляторные свойства клеток фетальной печени человека

Гены & Клетки: Том II, №3, 2007 год, стр.: 57-61

 

Авторы

Петренко Ю.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Фетальная печень человека [ФПЧ] является уникальным органом, в котором содержатся стволовые кроветворные клетки и их ком-митированные потомки различной степени зрелости. В настоящей работе проведено определение содержания иммунокомпетентных клеток в ФПЧ 9-10 недель гестации по фенотипическим свойствам и реакции на митогены, а также исследовано влияние клеток ФПЧ на пролиферацию лимфоцитов периферической крови взрослых доноров при совместном культивировании.

Суспензию клеток ФПЧ получали неферментативным методом с использованием вибрации. Клетки криоконсервировали под защитой 5% ДМСО со скоростью 1 и/мин. Фенотипический анализ проводили с использованием флуоресцентной микроскопии. Пролиферативную активность клеточных культур ФПЧ и лимфоцитов периферической крови (ЛПК} взрослых доноров определяли по включению 3Н-тимидина. В смешанной культуре клетки ФПЧ совместно культивировались с ЛПК в присутствии или отсутствие митогенов.

Иммунофенотипический анализ суспензии клеток ФПЧ не выявил зрелых В- и Т-лимфоцитов. Клетки ФПЧ, в отличие от ЛПК взрослых доноров обладали высоким уровнем спонтанной пролиферации в условиях культивирования in vitro. Митогены - фитогем-агглютинин [ФГА] и конканавалин А [Кон-А) подавляли пролиферацию клеток ФПЧ. При совместном культивировании, клетки ФПЧ подавляли как спонтанную, так и митоген-стимулированную пролиферацию ЛПК взрослых доноров, а также пролиферацию ЛПК в двунаправленной смешанной культуре. В работе обсуждаются возможные механизмы действия клеток ФПЧ.

Введение

Реакция иммунной системы реципиента на вводимые клетки аллогенного происхождения является одним из клю чевых вопросов клеточной терапии. Если трансплантация клеток взрослого человека, например, клеток костного мозга (КМ), требует проведения тщательного подбора донора и реципиента по антигенам гистосовместимости и возможна, в основном, между близнецами и сиблингами, то способность клеток фетального происхождения индуцировать специфичес кий иммунный ответ до настоящего времени изучена слабо, а имеющиеся данные характеризуются противоречивостью [1, 2, 11, 14]. Очевидно, что иммуногенность клеток зависит от их типа и степени развития. В этой связи интересным объек том исследования являются клетки фетальной печени че ловека (ФПЧ) - органа, в котором содержатся стволовые кроветворные клетки и их коммитированные потомки раз личной степени зрелости.

В то же время работ, посвященных изучению влияния кле ток ФПЧ на пролиферацию лимфоцитов взрослых доноров in vitro, до настоящего времени выполнено чрезвычайно мало [1, 2 ]. В частности, Ek S. и соавт. (1 ] не смогли прийти к за ключению о влиянии клеток ФПЧ на лимфоциты перифери ческой крови (ЛПК) в смешанной культуре, так как в одних случаях первые стимулировали пролиферацию ЛПК, в дру гих - ингибировали, а в третьих - не вызывали значительного эффекта. Противоречивые данные, полученные в этой ра боте, могут быть обусловлены большим диапазоном сроков гестации исследуемых образцов, которые варьировали в пределах от 8 до 20 недель.

В связи с этим в настоящей работе проведено опре деление содержания иммунокомпетентных клеток в ФПЧ 9 10 недель гестации по фенотипическим свойствам и ре акции на митогены, а также исследовано влияние клеток ФПЧ на пролиферацию лимфоцитов периферической крови взрослых доноров при совместном культивировании.

Материал и методы

Фрагменты печени плодов человека 9 10 недель геста ции получали после искусственного прерывания беременное ти с письменного согласия проинформированных доноров. Суспензию клеток ФПЧ получали в стерильных условиях неферментативным методом с использованием вибрации (3], модифицированным для малых объемов. Полученную клеточную суспензию фильтровали через устройства для пе реливания кровезаменителей и использовали для дальней ших исследований либо криоконсервировали.

Подсчет количества клеток проводили в камере Горяе ва, жизнеспособность до и после криоконсервирования оп ределяли по окрашиванию трипановым синим. Определе ние а фетопротеина (АФП) проводили иммуноферментным методом с помощью набора «Вектор Бест», Новосибирск, Россия) согласно инструкции производителя на планшетном спектрофотометре Tecan GENios (Австралия).

Для криоконсервирования суспензию клеток разводили до концентрации 2x106/мл и по каплям добавляли равный объем криозащитной среды, содержащей 10% диметил сульфоксида (ДМСО). Суспензию эквилибрировали с крио протектором при 4°С в течение 15 мин., после чего замора живали в контейнере Nalgene Mr. Frosty (Sigma, США) три этапа: до температуры 40°С со скоростью 1 °/мин, затем до 80°С со скоростью 10°/мин. Суспензии клеток хранили в жидком азоте не менее 3 х месяцев, а непосредственно перед исследованиями отогревали на водяной бане при средой культивирования, содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (ЭС), и центрифугиро вали при 200 g в течение 10 мин. Осадок суспендировали в 1 мл среды.

Лимфоциты периферической крови (ЛПК) человека выделяли в градиенте Ficoll Paque (Pharmacia, Швеция) согласно протоколу (4).

Для проведения фенотипического анализа клетки иммо билизировали на предметном стекле с помощью 10% ра створа поли L лизина, окрашивали моноклональными ан тителами и, по мере необходимости, фиксировали 4% раствором параформальдегида. В работе использовали моноклональные антитела к: CD3, CD4, CD8, CD20, CD45, HLF DR, HLA ABC. Наблюдение и количественный анализ клеток, меченных вторичными антителами, конъюгирован ными с FITC, проводили под флуоресцентным микроскопом Jenaval (Karl Zeiss, Йена, Германия).

Для исследования пролиферативной активности клетки суспендировали в среде RPM11640, содержащей 10% ЭС, 50 ед/мл пенициллина и 50 мг/мл стрептомицина и по x в течение 48 часов, после чего в лунки добавляли по 1 ^Ci раствора 3Н тимидина. Образцы инкубировали в тех же условиях в течение 24 часов. Включение 3Н тимидина в ДНК клеток определяли на сцинтилляционном р спектрометре S7800 Beckman (США). Данные выражали в импульсах в минуту (имп/мин).

Для определения влияния митогенов на интенсивность пролиферации клеток ФПЧ клетки культивировали с фито гемагглютинином (ФГА, 20 мкг/мл) или конканавалином А (Кон А, 10 мкг/мл). В некоторых экспериментах пролифе рацию клеток ФПЧ ингибировали обработкой митомицином С (МТМ С) в конечной концентрации 25 мкг/мл, после чего МТМ С трижды отмывали средой RPMI 1640.

Для постановки смешанной культуры клетки ФПЧ и лим фоциты периферической крови совместно культивировали в соотношении 1:1 в течение 48 часов, после чего в лунки вносили 3Н тимидин и определяли интенсивность его вклю чения через 24 часа.

Полученные результаты обрабатывали статистически; в зависимости от характера распределения использовали параметрический метод (t критерий Стьюдента) или непа раметрический Вилкоксона (5 ].

Результаты и обсуждение

Жизнеспособность свежевыделенной первичной сус пензии клеток ФПЧ, оцененная по окрашиванию трипано вым синим, составляла 85±2%. Иммунофенотипический анализ первичной суспензии не выявил зрелых В и Т лим фоцитов (CD3, CD4, CD8, CD20). Единственными предста вителями клеток лимфоидного ряда были CD45 позитивные клетки, количество которых составляло 2,09±0,32%. Однако о зрелости этих клеток сложно судить, учитывая, что CD45 экспрессируется не только на зрелых лимфоцитах, но и на лимфоидно коммитированных клетках, а также на кроветвор ных клетках предшественниках (6 ]. Проведенный анализ не исключает присутствия в суспензии клеток ФПЧ незрелых предшественников Т лимфоцитов, способных дифференци роваться тимус независимым путем при культивировании или трансплантации (14).

В связи с этим была предпринята попытка выявить функ ционально активные Т лимфоциты в фетальной печени че ловека при совместном культивировании клеток ФПЧ с митогенами и аллоантигенами. Известно, что фитогемаг глютинин (ФГА) и конканавалин А (Кон А) активируют Т лимфоциты, избирательно связываясь с углеводными компонентами клеточных мембран (7]. В связи с этим, ис следовали влияние этих митогенов на включение 3Н тими дина в ДНК клеток ФПЧ (рис. 1).

Из рис.1, видно, что ФГА и Кон А не только не активи ровали клетки ФПЧ, но даже подавляли их пролиферацию. При этом ФГА достоверно (р<0,05) ингибировал включение 3Н тимидина в ДНК клеток ФПЧ, тогда как значения, полу ченные в присутствии этих двух митогенов, достоверно не отличались между собой.

В литературе отсутствует единое мнение о действии митогенов на клетки ФПЧ. Наличие антиген связываю щих клеток в ФПЧ было установлено 30 лет назад Roberts I.M. и соавт. (8 ]. Однако стимуляции клеток ФПЧ в ответ на до бавку ФГА в этой работе обнаружить не удалось. Стимули рующий эффект ФГА на клетки ФПЧ человека показан в работе [9]. Однако в этой работе исследовались клетки, полученные из плодов более поздних сроков развития (15 26 недель гестации). В работах (2, 10], проведенных на клетках ФПЧ 8 12 недель гестации, было обнаружено ингибирующее действие митогенов (ФГА или Кон А) на пролиферацию клеток ФПЧ. Было показано, что в процес се взаимодействия митогена с клетками ФПЧ в среде обнаруживаются факторы, ингибирующие синтез ДНК и подавляющие пролиферацию лимфоцитов, индуцирован ную аллоантигеном.

Результаты, свидетельствующие об отсутствии фенотипи чески зрелых и функционально активных Т лимфоцитов в сус пензии клеток ФПЧ 1 го триместра гестации, соответствуют данным работы [11 ], в которой присутствие фенотипически зрелых Т лимфоцитов обнаружено в печени человека в более поздние сроки (13 22 недели внутриутробного развития). Предполагают, что предшественники Т лимфоцитов пере селяются в тимус из фетальной печени [6]. Начиная с 8 й недели гестации в фетальном тимусе Т лимфоциты про ходят сложную цепь дифференцировочных событий [12]. В результате этих событий к 13 неделе гестации в кровь по ступают зрелые Т клетки со сформировавшимся TCR (Т cell receptor) комплексом, которые могут колонизировать пери ферические органы, в том числе и печень.

Наряду с этим, существует мнение, что печень может яв ляться и самостоятельным, тимус независимым местом развития и созревания Т клеток [13]. Для выяснения этого вопроса в работе [14] был проведен молекулярный, феноти пический и функциональный анализ клеток ФПЧ. Методом ПЦР с обратной транскриптазой была исследована экспрес сия генов, кодирующих цепи TCR. Молекулярный анализ показал, что, несмотря на достаточно раннее (начиная с 7 недели гестации) развитие отдельных цепей, зрелый TCR комплекс окончательно формируется только после 13,5 не дель гестации. Транскрипция TCR комплекса увеличивается пропорционально сроку развития плода, но даже в возрасте 16 недель зрелый TCR комплекс был обнаружен только в 6 из 10 исследованных образцов ФПЧ [14]. Кроме того, про веденные в работе [14] исследования показали, что путем направленной дифференцировки в присутствии митогенов, цитокинов и аллоантигенов при культивировании клеток ФПЧ 2 го триместра гестации удается получить зрелые и функционально активные Т лимфоциты. Однако количество клеток, способных образовывать клоны Т лимфоцитов, чрезвычайно мало - лишь 2 клетки из 106 обладали такой способностью. Совокупность наших и литературных данных свидетельствуют в пользу того, что в суспензии клеток ФПЧ 1 го триместра гестации отсутствуют клетки, способные вызывать реакцию трансплантат против хозяина (РТПХ) при трансплантации.

Скорость отторжения клеток после их трансплантации зависит, главным образом, от экспрессии антигенов ГКС класса II. Фенотипический анализ клеток ФПЧ на представ ленность антигенов ГКС показал, что в суспензии свежевы деленных клеток ФПЧ содержится 22,3±5,4% клеток, экс прессирующих HLA А,В,С (W6/32) и 7,5*1,4% клеток, позитивных на HLA DR. После криоконсервирования содер жание клеток, экспрессирующих антигены ГКС класса I и II, не изменялось и составляло 23,6±4,1 и 6,1 ±1,8%, соответ ственно. Следовательно, клетки, содержащие антигены ГКС, сохраняются в процессе криоконсервирования и должны распознаваться иммунной системой реципиента при вве дении. Иммунный ответ организма включает активацию Т лимфоцитов, которая запускает каскад событий, ведущих к отторжению введенных клеток. В системе in vitro процесс активации лимфоцитов может быть исследован при совме стном культивировании исследуемых клеток с лимфоцитами периферической крови взрослого человека.

В табл. 1 приведены данные по включению 3Н тимидина в ДНК клеток ФПЧ и лимфоцитов взрослых доноров. Уровень спонтанной пролиферативной активности свежевыделенных клеток ФПЧ, оцененный по включению 3Н тимидина состав лял 7787±820 имп/мин. Криоконсервирование приводило к снижению жизнеспособности клеток ФПЧ на 30%. При этом уровень пролиферативной активности также снижался на 30% и составлял 5344±694 имп/мин (см. табл. 1).

В исследованиях по совместному культивированию ис пользовали криоконсервированные клетки ФПЧ, свободные от вирусной и бактериальной контаминации. Обработка клеток ФПЧ МТМ С практически полностью подавляла про лиферативную активность.

ЛПК взрослых доноров обладали низкой спонтанной про лиферативной активностью.

В двусторонней смешанной культуре, при совместном культивировании ЛПК двух различных доноров (ЛПК^ЛПКд) уровень включения 3Н тимидина составлял 6548±285 имп/мин (см. табл. 1). Эти результаты показывают, что лим фоциты взрослых доноров, использованные в настоящей работе, функционально активны и адекватно реагируют на активацию, стимулированную митогеном и аллогеном.

Напротив, совместное культивирование попарно образ цов аллогенных клеток ФПЧ (ФПЧ, + ФПЧ2) не приводило к стимуляции синтеза ДНК (см. табл. 1). При совместном куль тивировании клеток ФПЧ и ЛПК были получены значения включения 3Н тимидина в ДНК, значительно превышающие уровень спонтанной пролиферации лимфоцитов (см. табл. 1). Подобный же уровень синтеза ДНК наблюдали при куль тивировании клеток ФПЧ в отсутствие ЛПК. Поэтому пред положили, что он может быть обусловлен пролиферацией фетальных клеток.

Внесение в культуральную среду ФГА (ЛПК+ФГА) при водило к 7 9 кратной стимуляции включения 3Н тимидина в ЛПК (рис. 2). Для исключения вклада спонтанной проли ферации клеток ФПЧ во включение 3Н тимидина в смешан ной культуре, клетки ФПЧ предварительно обрабатывали митомицином С. После 3 х кратной отмывки митомицина С, совместное культивирование клеток ФПЧ и ЛПК не вызы вало стимуляции включения 3Н тимидина в ЛПК. Более того, наблюдалось достоверное (р<0,05) снижение спонтанной пролиферации ЛПК.

При активации ЛПК митогеном, присутствие клеток ФПЧ также значительно угнетало включение 3Н тимидина в ДНК (см. рис. 2).

Угнетение пролиферации ЛПК клетками ФПЧ может быть обусловлено присутствием в суспензии клеток ФПЧ мезен химальных стволовых клеток (МСК) [15, 16]. Установлено [15, 17], что МСК, выделенные из КМ взрослых людей, ха рактеризуются умеренной экспрессией молекул ГКС класса I и слабой экспрессией ГКС класса II. Следовательно, аллоген ные лимфоциты узнавали их, но в смешанной культуре этих клеток наблюдали эффект, подобный отмеченному нами -подавление пролиферации лимфоцитов при совместном культивировании [17,18]. Более того, угнетение иммунно го ответа взрослых МСК было подтверждено в условиях in vivo у приматов - при трансфузии аллогенных МСК отмечено улуч шение приживления аллогенного кожного трансплантата [19].

Недавно в нашей лаборатории из суспензии ФПЧ были выделены претенденты на МСК, которые образовывали ко лонии фибробластоподобных клеток и были способны диф френцироваться в остеогенном и адипогенном направле ниях [20, 21 ]. Долевое содержание колониеобразующих клеток в фетальной печени оказалось в 5 7 раз выше, чем в КМ взрослых: одна колониеобразующая клетка приходи лась на 30 ООО 50 ООО клеток ФПЧ, в то время как в КМ одна МСК найдена среди 250 ООО клеток [22 ]. Фенотипи ческий анализ, проведенный в работах [21, 22, 23], пока зал, что мезенхимальные клетки ФПЧ не отличаются от МСК КМ: и те, и другие позитивны по молекулам CD29, CD44, CD166, CD 105 и негативны по CD14, CD34, CD45.

Можно предположить, что механизм действия мезенхи мальных стволовых клеток обусловлен их способностью про дуцировать специфические факторы, способные оказывать иммуносупрессорное действие. Так, на приматах показано, что добавка IL 2 предотвращает ингибирование мезенхи мальными клетками митоген индуцированной активации лимфоцитов [24]. В недавно проведенной работе [25] было установлено, что действие МСК при трансплантации связано не с дифференцировкой клеток, а с изменением цитокино вого профиля в органе мишени. При этом наблюдали сни жение уровня провоспалительных цитокинов и стимуляцию образования антивоспалительных цитокинов и антиапопти ческих факторов. В другом исследовании [15] при добавле нии к смешанной культуре МСК и Т лимфоцитов антител против трансформирующего фактора роста в (TGF в1) и фактора роста гепатоцитов (HGF) наблюдали вместо угне тающего действия МСК обусловленную ими аллогенную стимуляцию. В этой связи следует отметить, что вышеуказанные ро стовые факторы обнаруживаются в ФПЧ 1 го триместра гестации [26, 27 ].

Еще одним претендентом на роль супрессора иммунно на активность Т и В лимфоцитов, но подавляет пролифе ративный ответ лимфоцитов на митогены [28 ]. Для оценки возможности реализации такого механизма угнетения про лиферации лимфоцитов нами было определено содержание АФП в суспензиях клеток ФПЧ. Было показано, что содер жание АФП в суспензии свежевыделенных клеток ФПЧ со ставляло 1044±205 МЕ/106 клеток. Этот уровень АФП в реакции СКЛ значительно превышает физиологические значения, что и может явиться причиной угнетения проли феративной активности ЛПК. Следует отметить, что АФП не вырабатывается МСК и может являться дополнительным супрессорным фактором при использовании тотальной сус пензии клеток ФПЧ.

Заключение

Полученные результаты свидетельствуют о том, что в составе ФПЧ 9 10 недель гестации отсутствуют зрелые, функционально активные лимфоидные клетки, способные участвовать в реакциях иммунного ответа. Выявленное в работе свойство клеток ФПЧ подавлять спонтанную и ми тоген стимулированную пролиферацию лимфоцитов при совместном культивировании обусловлено, очевидно, при сутствием в ФПЧ эмбриоспецифических факторов, способ ных подавлять иммунный ответ. Отсутствие в составе сус пензии клеток ФПЧ иммунокомпетентных клеток, а также способность угнетать реакции иммунного ответа позволяют рассматривать клетки ФПЧ в качестве иммуномодулятора, способного снижать скорость отторжения клеток при транс плантации.

Подняться вверх сайта