Поиск Кабинет

Хроматографическая очистка плазмидной ДНК для клинического применения (генной терапии)

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 142-145

 

Авторы

Романова Ю.Д., Салафутдинов И.И., Замалютдинова Н.М., Ризванов А.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Для успешного применения плазмидных векторов в протоколах генной терапии необходима разработка методов получения гомогенных высокоочищенных препаратов рекомбинантной ДНК, не содержащих загрязняющих компонентов, в первую очередь хромосомной ДНК, бактериальных белков, РНК и эндотоксинов. В ходе проведенного исследования нами была проведена оптимизация способа очистки плазмидной суперскрученной ДНК с помощью трех хроматографических этапов из щелочного лизата бактериального штамма E. coli. Были подобраны оптимальные условия для этапа щелочного лизиса в целях увеличения выхода плазмиды и минимизации длительности очистки с помощью гель-фильтрации.

В настоящее время векторные системы созданные на основе плазмид и вирусов применяют в различных протоколах генной терапии ряда заболеваний человека. Методы генной терапии основаны на введение в клетки векторов с генами, кодирующими терапевтические гены [1]. В разрабатываемых схемах генной терапии, находящихся на разных стадиях клинических испытаний, на долю плазмидных векторов приходится 18% [2]. Векторы на основе плазмид считаются наиболее безопасными по сравнению с вирусными системами доставки, поскольку после их введения в клетки не возникает выраженного иммунного ответа, а также отсутствует интеграция в геномом хозяйской клетки, что нивелирует возможный инсерционный мутагенез. В тоже время вопрос эффективной доставки и экспрессии генетического материала в составе плазмидных конструкций остается открытым. Вследствие этого для успешного лечения заболеваний необходимо введение большого количества препарата плазмидной ДНК или использование специфических систем их доставки [3-4].

Стандартный метод получения плазмид из бактериальных клеток включает несколько ключевых этапов: наработка биомассы рекомбинантного бактериального штамма, лизис клеток, очистку плазмиды от геномной ДНК, РНК, белков и эндотоксинов клеток продуцента [5]. В большинстве современных методов очистки плазмидной ДНК для разрушения клеточной стенки применяется щелочной лизис, который требует тщательного контроля, поскольку превышение времени контакта щелочи со суперскрученной плазмидной ДНК приводит к ее денатурации. Для дальнейшей очистки ДНК из щелочного лизата в основном применяют хроматографические методы – гель-фильтрацию, адсорбционную, ионно-обменную, аффинную, обращенно-фазную и хроматографию гидрофобных взаимодействий. Ряд хроматографических методов имеет существенные недостатки. Например, применение в качестве сорбента гидроксилапатита ограничено тем, что он легко накапливает необратимо адсорбирующие вещества и может применяться лишь после удаления большей части балластного материала [6]. Некоторые из методов, например, аффинная хроматография [7], не дают возможность увеличить масштабы производства изза высокой стоимости сорбентов, а некоторые методы предполагают применение токсичных реагентов, как, например, при применении обращенно-фазной хроматографии [8], что недопустимо для медицинских препаратов. В связи с чем, возникает потребность в методах получения высокоочищенных рекомбинантных ДНК, которые можно было бы масштабировать для производства медицинских препаратов нуклеиновых кислот в промышленных объемах.

Материал и методы

Рекомбинантная плазмида. В работе использовался рекомбинантная плазмида pBud-VEGF-FGF2, представлющая собой кольцевую замкнутую молекулу ДНК молекулярной массой 3,7 кДа (5583 п.н.), созданную на основе плазмидного вектора pBudCE4.1 (Invitrogen, США) [9]. За основу метода получения препаративного количества плазмиды с характеристиками, рекомендованными ВОЗ для клинического применения (WHO Technical Report Series No 941, 2007), был принят протокол фирмы «GEHealthcare», разработанный для трехстадийной очистки плазмиды весом 6,2 кДа с помощью фирменных хроматографических колонок (табл. 1) (GE Healthcare Life Sciences, США).

Культивирование штамма продуцента. Культивирование штамма Escherichia coli XL1 Blue, содержащего плазмиду pBud-VEGF-FGF2, проводили на среде Лурия-Бертани c добавлением антибиотика зеоцин в конечной концентрации 25 мкг/мл. Ночную культуру объемом 2000 мл выращивали при соотношении объема воздуха к объему среды 3:1, на качалке при 200 об/мин до значений оптической плотности 2,5. Клетки концентрировали центрифугированием в течение 10 мин при 6000 об./мин.

Щелочной лизис и осаждение плазмидной ДНК. Щелочной лизис проводили согласно стандартной методике [5]. Осажденную бактериальную культуру ресуспендировали в 100 мл буфера (25 мМ трис-HCl, 10 мМ ЭДТА, 50 мМ глюкозы, рН 7,5, 100 мкг/мл РНКаза А). К суспензии добавляли 100 мл лизирующего буфера (200 мМ NaOH, 1% SDS (додецилсульфат натрия)). Спустя 5 мин проводили нейтрализацию с помощью добавления охлажденного ацетатного буфера (3 М CH3CO2K). Полученную взвесь фильтровали через бумажный фильтр (марка «синяя лента»). К отфильтрованному раствору приливали изопропанол в соотношении 1:0,7, выдерживали при комнатной температуре 10 мин. Осадок центрифугировали при 12 тыс. об/мин в течение 30 мин при 4°С. Супернатант сливали, осадок промывали 70% этанолом, центрифугировали 15 мин при тех же условиях. Спирт сливали, осадок подсушивали при комнатной температуре и растворяли в 50 мл трис-НСl буфера (50 мМ трис-HCl, 10 мМ ЭДТА, рН 7,5).

Хроматографическая очистка рекомбинантной плазмидной ДНК. Все этапы хроматографической очистки проводили с помощью системы жидкостной хроматографии BioLogicLP («Bio-Rad», США), снабженной градиентным насосом с производительностью до 40 мл/мин, проточным УФ-детектором с двумя длинами волн (254 и 280 нм) и кондуктометром. Очистка проводилась на фирменных колонках «PlasmidSelect Xtra Starter Kit» (GE Healthcare Life Sciences, США). Концентрацию нуклеиновых кислот определяли на спектрофотометре NanoPhotometer Pearl («Implen», Германия). Чистоту препарата анализировали с помощью электрофореза в 0,8 % агарозном геле с добавлением бромистого этидия. В качестве маркера молекулярной массы использовали «GenRuler 10kb DNALadder» (Fermentas, США).

Результаты и обсуждение

Согласно протоколу «GE Healthcare» полученный щелочной лизат можно было непосредственно использовать для очистки на колонках. Однако такой лизат содержал избыточное количество РНК, что приводило к увеличению продолжительности очистки на первом этапе с помощью Sepharose 6 Fast Flow (рис. 1А). В целях минимизации длительности первого этапа очистки щелочного лизата, перед внесением на хроматографическую колонку, образец подвергали дополнительной обработке РНКазой А для разрушения РНК, плазмиду из раствора осаждали изопропанолом. На колонку, предварительно уравновешенную буфером А, вносили 10 мл образца, с концентрацией нуклеиновых кислот около 1 мг/мл (табл. 2). Плазмиду элюировали тем же буфером со скоростью 4 мл/мин. Сорбент после каждого выхода пика плазмиды промывали дистилированной водой (рис. 1Б).

На следующем этапе с помощью высаливающей хроматографии отделяли суперскрученную замкнутую кольцевую форму плазмиды от открытой линейной формы на колонке PlasmidSelect Xtra, содержащей меркаптопиридиновые лиганды. На колонку, уравновешенную буфером В, наносили образец в количестве 5 мг. Плазмиду, удержанную на колонке, промывали от открытой линейной формы тем же буфером при скорости потока 4 мл/мин, затем плазмиду элюировали буфером С при скорости потока 3 мл/мин.

Полученные после гель-фильтрации фракции плазмиды содержали значительное количество плазмиды линейной формы. Поскольку нахождение плазмиды в растворе при больших значениях рН вызывает необратимую денатурацию плазмиды за короткий промежуток времени, увеличили объем ацетатного буфера (рН 5,0) для более быстрого и однородного смещения рН раствора в кислую сторону. Увеличение объема ацетатного буфера на 35% приводило к заметному уменьшению количества линейной формы плазмиды.

На финальном этапе очистки использовали анионообменную хроматографию на колонке с сорбентом Source 30Q. На колонку, уравновешенную буфером Д, наносили образец в количестве 5 мг, плазмиду, удержанную на колонке, промывали от эндотоксинов тем же буфером при скорости потока 4 мл/мин, затем плазмиду элюировали буфером Е в те же условиях. Чистоту плазмиды определяли с помощью электрофореза в агарозном геле (рис. 2).

Таким образом, были оптимизированы условия очистки препарата плазмидной ДНК pBud-VEGF-FGF2 с помощью трех хроматографических колонок, входящих в состав набора «PlasmidSelect Xtra Starter Kit» (GE Healthcare Life Sciences, США). В качестве дополнительного этапа очистки щелочного лизата была выбрана преципитация плазмиды изопропанолом. Общий выход плазмиды после всех этапов очистки составил 15,4%.

Подняться вверх сайта