Поиск Кабинет

Характеристика свойств стромальных клеток костного мозга в реакции смешанной культуры лимфоцитов

Гены & Клетки: Том II, №3, 2007 год, стр.: 62-66

 

Авторы

Григорян А.С., Цупкина Н.В., Сергеев В.С., Деев Р.В., Пинаев Г.П.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В настоящее время стромапьные клетки костного мозга [СККМ] привлекают все больший интерес в связи с потенциальной возможностью применения их в качестве иммуномодуляторов в клинической практике. Некоторыми исследователями был отмечен супрессивный эффект, оказываемый СККМ на пролиферацию лимфоцитов в смешанных культурах. В данной работе изучены свойства аллоген-ных и сингенных СККМ in vitro. В качестве метода оценки воздействия СККМ на пролиферацию лимфоцитов была выбрана реакция смешанной культуры лимфоцитов [РСКЛ], в качестве метода визуализации результата - иммуноцитохимическое окрашивание клеток, находящихся в S-фазе, на включение б ромдезоксиуридина [BrdU). В качестве источника СККМ, спленоцитов и фибробластов, использовавшихся в контрольных опытах, были выбраны крысы линии Вистар и беспородные крысы.

Показано, что как аллогенные, так и сингенные СККМ не оказывают подавляющего воздействия на пролиферацию лимфоцитов. Более того, аллогенные СККМ стимулируют пролиферацию лимфоцитов как в РСКЛ, так и при обычном сокультивировании. При этом пролиферация лимфоцитов в ответ на аллогенные СККМ достигает при высоких концентрациях СККМ 85%, что статистически значимо выше уровня пролиферации лимфоцитов в ответ на аллогенные фибробласты. Установлено, что супернатанты культур СККМ также вызывают пролиферацию лимфоцитов.

Введение

Стромальные клетки костного мозга (СККМ), или в зна чительной степени синонимичные им мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки привлекают все боль ший интерес исследователей в связи с потенциальной воз можностью применения их в качестве иммуномодуляторов в клинической практике, особенно в тех случаях, когда стан дартная терапия не приводит к положительным результатам. СККМ оказывают супрессивный эффект на иммунную сис тему реципиента, а также способны к дифференцировке в различные типы клеток [1]. Следовательно, при введении аллогенных СККМ с целью воздействия на регенерацию поврежденных тканей, а также при их котрансплантации с другими клетками (тканями, органами) можно снизить ве роятность возникновения и/или степень выраженности иммунологических реакций, получивших названия «реакция трансплантат против хозяина» и «реакция хозяин против трансплантата» (2].

Существует большой спектр противоречивых данных как о фенотипических характеристиках СККМ, так и об их способности влиять или даже регулировать процессы имму ногенеза. Свойство иммуносупрессии СККМ у человека от мечается в опытах in vitro (в реакции смешанной культуры лимфоцитов), а также в экспериментах на животных [2-9].

Показано, что уровень подавления пролиферации лим фоцитов зависит от количества СККМ. Большие их коли чества ингибируют, а низкие - усиливают пролиферацию лимфоцитов в реакции смешанной культуры. Т клетки не подвергаются апоптотической гибели и не впадают в состо яние анергии. При удалении СККМ из культуры лимфоциты могут быть рестимулированы к пролиферации (5, 6]. Кроме того, аллогенные СККМ увеличивают количество регулятор ных Т клеток (11, 12].

В то же время научной группой A.J. Nauta et al. в 2005 году было продемонстрировано, что аллогенные СККМ вызыва ют реакцию отторжения при котрансплантации с аллогенным костным мозгом (13]. Также в 2006 году было обнаружено, что СККМ, трансплантированные в головной мозг взрослых животных, вызывают воспалительную реакцию, приводящую к отторжению трансплантата (14].

Вышеизложенные положения послужили предпосылка ми к планированию нашего исследования, целью которого стало обнаружение влияния различных количеств аллоген ных и сингенных СККМ на пролиферацию лимфоцитов в реакции смешанной культуры лимфоцитов (РСКП).

Материал и методы

Реакция смешанной культуры лимфоцитов

Цель РСКЛ - оценка МНС совместимости донора и ре ципиента, для чего проводится сокультивирование лимфоци тов донора (клеток респондеров) и лимфоцитов потенциаль ного реципиента (клеток стимуляторов), предварительно обработанных агентом, подавляющим их собственную про лиферацию. В данном исследовании РСКЛ проводилась в присутствии исследуемых популяций клеток.

В качестве агента, подавляющего пролиферацию клеток стимуляторов, был использован митомицин С в концентрации 50 мкг/мл (Sigma, США). Для оценки пролиферации лимфо цитов респондеров был применен иммуноцитохимический метод окрашивания клеток в S фазе на включение в их ДНК бромдезоксиуридина (BrdU) (Sigma, США). Обработка кле ток митомицином С и их иммуноцитохимическая окраска проводились по протоколам фирмы производителя.

Эксперимент включал в себя несколько серий:

1. Постановка РСКЛ в отсутствии СККМ. Подбор опта мального соотношения клеток респондеров (спленоцитов крыс линии Вистар) и клеток стимуляторов (спленоцитов беспородных крыс)1 и времени их сокультивирования, при которых достигается максимальный пролиферативный от вет со стороны клеток респондеров. Каждый отдельный опыт для повышения достоверности результата проводился в четырех параллелях. В контрольных опытах были постав лены серии РСКЛ при сингенном происхождении клеток рес пондеров и клеток стимуляторов, а также определен уровень пролиферации клеток респондеров в отсутствии клеток стимуляторов в бессывороточной ростовой среде аМЕМ и в среде с 10% FBS.

2. Постановка РСКП в присутствии аллогенных клеткам респондерам СККМ в разных соотношениях. Определение эффекта, оказываемого аллогенными СККМ на пролифе рацию лимфоцитов реципиента. В контрольных опытах были поставлены серии РСКЛ в присутствии аллогенных клеткам респондерам фибробластов.

3. Постановка РСКЛ в присутствии СККМ, полученных от различных беспородных крыс2.

4. Сокультивирование спленоцитов с аллогенными СККМ. Определение эффекта СККМ на пролиферацию спленоци тов. В контрольных опытах было проведено сокультивиро вание спленоцитов как с аллогенными, так и с сингенными фибробластами, без присутствия клеток стимуляторов.

5. Культивирование спленоцитов в ростовой среде, в ко торой до этого культивировались аллогенные СККМ.

6. Постановка РСКЛ в присутствии сингенных клеткам респондерам СККМ в разных соотношениях. Определение эффекта, оказываемого сингенными СККМ на пролифера цию лимфоцитов реципиента. В контрольных опытах были поставлены серии РСКП в присутствии сингенных клеткам респондерам фибробластов.

Все манипуляции с крысами выполнялись с учетом пра вил гуманного обращения с животными (15].

Выделение спленоцитов

Селезенку помещали в чашку Петри в 8 мл среды DMEM с 10% FBS (HyClone, Новая Зеландия), фрагментировали и гомогенизировали. Полученную суспензию фильтровали в центрифужную пробирку через нейлоновое сито с диамет ром отверстий 200 нм.

После этого проводилось выделение мононуклеарной фракции на градиенте перколла (плотность - 1,086 г/л) центрифугированием при ЗООд в течение 30 мин при ком натной температуре. Количество полученных спленоцитов определяли подсчетом клеток в камере Горяева.

Выделение СККМ

Полученный костный мозг помещали в чашку Петри, со (HyClone, Новая Зеландия) и гомогенизировали. Затем про водили выделение мононуклеарной фракции на градиенте перколла (плотность - 1,086 г/л) центрифугированием при ЗООд в течение 20 мин при комнатной температуре. Отмывку от перколла производили раствором Хэнкса центрифугиро ванием при 200д 20 мин. Затем клетки высеивали на две чашки Петри и помещали в 5% С02 инкубатор. Смену среды производили спустя сутки . Через несколько дней культиви рования на дне культурального сосуда можно было обнару жить большое количество адгезировавшихся распластанных многоотросчатых клеток, контактировавших между собой (рис. 1).

Культивирование СККМ

FBS (Hyclone, Новая Зеландия) и гентамицина сульфата (50 мкг/мл) на чашках Петри в 5% С02 инкубаторе. Для пассирования использовали стандартную смесь трипсина (0,25%) и ЗДТА (0,02%) (Gibco, США), в которой клетки ин кубировали 3 4 мин.

Выделение фибробластов

Щипок подкожной соединительной ткани размером око ло 1 сма помещали в чашку Петри и накрывали стерильным покровным стеклом, после чего заливали 5 мл среды аМЕМ (ICN, США) с 10% FBS (Hyclone, Новая Зеландия) и поме щали в 5% С02 инкубатор. Затем через каждые 4 5 суток производили смену среды.

Культивирование фибробластов

Примерно через две недели после начала выселения фибробластов из ткани они образовывали на дне чашки Петри монослой. После этого стерильным пинцетом из чашки удаляли покровное стекло и кусочки ткани и произ водили первый пассаж. Для пассирования использовали стандартную смесь трипсина (0,25%) и ЭДТА (0,02%)мы ICN с 10% FBS (Hyclone, США) и гентамицина сульфата (50 мкг/мл) либо в среде DME на чашках Петри в 5%С02 инкубаторе.

Статистическая обработка данных

Количество клеток в S фазе, окрашенных иммуноци тохимическим методом на включение BrdU, было подсчи тано в световом микроскопе из расчета на 500 клеток. Для каждого отдельного опыта производили по 3 параллель ных подсчета, после чего выводили среднее число клеток в S фазе для каждого опыта. Для статистической обработки данных был использован однофакторный дисперсионный анализ.

Результаты и обсуждение

1. Максимальная пролиферация клеток респондеров наблюдалась на пятые сутки инкубации в РСКЛ при количе ствах клеток респондеров от 1,0х Ю7 до 2,0x107 и клеток стимуляторов - 4,0x107 и достигала 63%. В контрольных опытах при сингенном происхождении клеток респондеров и клеток стимуляторов уровень пролиферации отвечающих спленоцитов весьма низок, и, как в ростовой среде с 10% FBS, так и в бессывороточной среде, составляет от 8 до 12%, что позволяет нам считать пролиферацию лимфоцитов в ответ на компоненты сыворотки «фоновой», так как уровень пролиферации отвечающих клеток при аллогенной стиму ляции оказывался гораздо выше (рис. 2).

Известно, что пролиферация клеток in vitro зависит, в том числе, от плотности культуры, обуславливающей число меж клеточных контактов и концентрацию в среде растворимых факторов, продуцируемых клетками. Для проверки нашего предположения о наличии подобной зависимости мы поста вили дополнительный контрольный опыт, в котором установи ли весьма слабую зависимость пролиферации спленоцитов от их исходного количества. Максимальный пролиферативный ответ действительно наблюдался, когда исходное количе ство клеток респондеров было от 1,0x107 до 2,0x107, но процент пролиферирующих клеток от общего их числа ме нялся слабо (в среднем от 4% до 8%), что указывает на то, что мы наблюдали пролиферацию одной и той же клеточной субпопуляции в пределах выделенной из селезенки гетеро генной популяции спленоцитов, и большее количество отве чающих клеток было необходимо для лучшей визуализации результата. Однако некоторое изменение уровня пролифе рации в зависимости от плотности культуры все же наблю общей популяции; при исходных количествах спленоцитов отщего количества клеток.

2. Было обнаружено, что аллогенные СККМ не только не подавляют, но, напротив, стимулируют пролиферацию кле ток респондеров. Наблюдалось статистически значимое увеличение пролиферации клеток респондеров относитель но уровня их максимальной пролиферации в РСКЛ при от сутствии аллогенных СККМ. При различных соотношениях клеток респондеров и аллогенных СККМ изменялся и ха рактер стимуляции: при соотношении 103:1 стимуляции практически не было - пролиферация лимфоцитов респон деров даже несколько снижалась, однако в отдельных опы тах этот эффект не был стабилен; при соотношении 10а:1 стимуляция была незначительной (около 60%); при соотно шениях 10:1 и 1:1 пролиферация клеток респондеров достигала 85%, т.е. могла превышать максимальную про лиферацию лимфоцитов респондеров в РСКЛ на 12%. В контрольных опытах были проведены реакции смешанной культуры лимфоцитов в присутствии сингенных (отрицатель ный контроль) и аллогенных (положительный контроль) клет кам респондерам фибробластов. Сингенные фибробласты не оказывали существенного влияния на пролиферацию сти мулированных клеток респондеров; в случае добавления в культуру аллогенных фибробластов наблюдалось усиление пролиферации спленоцитов, однако достоверно меньшее, нежели в случае добавления в культуру аллогенных СККМ (рис. 3).

Также следует особо отметить тот факт, что слой алло генных СККМ повреждался в РСКЛ, чего не происходило в контрольных опытах с фибробластами. Это можно было на блюдать визуально - обычно к пятым шестым суткам ин кубации в РСКЛ слой адгезивных клеток сохранялся только по периферии культуральной чашки, основная же его часть подвергалась лизису. В суспензии обнаруживались крупные клеточные агрегаты, характерные для пролиферирующих лимфоцитов. Количество этих агрегатов также визуально увеличивалось при увеличении количества стромальных клеток, присутствовавших в РСКЛ.

Таким образом, мы не получили подтверждения лите ратурных данных о том, что СККМ вызывают подавление пролиферации лимфоцитов [10, 16 19]. Напротив, мы на блюдали выраженную пролиферацию клеток респондеров, статистически значимо бьльшую, нежели в ответ на ал логенные фибробласты, использовавшиеся в качестве положительного контроля. Возможно, это связано с секре цией стромальными клетками широкого спектра факторов, регулирующих в норме пролиферацию и дифференцировку гемопоэтических клеток, в том числе и иммунокомпетент ных, как было отмечено многими исследователями [20 22].

3. Мы также проверили, существуют ли различия в эф фектах СККМ на пролиферацию спленоцитов в случае раз личного происхождения СККМ, поскольку в наших опытах источником аллогенных СККМ служил костный мозг беспо родных крыс. Таких различий выявлено не было: аллогенные СККМ разного происхождения в одинаковой степени сти мулировали пролиферацию лимфоцитов респондеров, ко торая достигала 80-85%.

4. Стимулирующий эффект, оказываемый аллогенными СККМ на спленоциты, был выявлен нами и в отдельных опытах по сокультивированию лимфоцитов респондеров с аллогенными СККМ при отсутствии клеток стимуляторов. В ответ на аллогенные СККМ спленоциты пролиферирова ли несколько сильнее, чем в ответ на аллогенные фибробла сты в контрольных опытах. Уровень их пролиферации состав лял от 20% до 50% и также был пропорционален количеству аллогенных СККМ (рис. 4).

5. Мы установили, что ростовая среда, в которой культи вировались аллогенные СККМ, сохраняет свои стимулиру ющие свойства (рис. 5), что расходится с литературными данными о том, что, напротив, супернатанты культур СККМ оказывают на пролиферацию лимфоцитов супрессивный эффект [3, 22]. Объяснением этого факта может служить то, что за стимулирующий эффект ответственны раствори мые факторы, продуцируемые СККМ, и набор этих факто ров зависит от условий, в которых культивируются клетки, а также от степени гетерогенности популяции выделенных СККМ [3].

6. В нашей работе был также проверен эффект синген ных СККМ на пролиферацию стимулированных спленоцитов в РСКЛ. Было обнаружено, что сингенные СККМ вне зависи мости от их количества не подавляют пролиферацию клеток респондеров (рис. 6). На пятые сутки инкубации пролифера ция клеток респондеров не имела достоверных отличий от их пролиферации в обычной РСКЛ в отсутствии сингенных СККМ и оставалась равной от 58% до 63%. В этой серии были также поставлены контрольные опыты, аналогичные контрольным опытам второй серии экспериментов. В случае присутствия в РСКЛ сингенных СККМ уровень пролиферации клеток респондеров был несколько выше, чем в присутствии сингенных клеткам респондерам фибробластов, но эти от личия нельзя считать существенными. Различий в проли ферации клеток респондеров в случаях присутствия в РСКЛ сингенных СККМ или аллогенных фибробластов практически не было. В целом сингенные клеткам респондерам СККМ, как и сингенные им фибробласты, не оказывают существен ного влияния на пролиферацию стимулированных отвеча ющих клеток в реакции смешанной культуры лимфоцитов. Такой результат согласуется с данными литературы о том, что собственные стромальные клетки костного мозга реци пиента не способны купировать иммунные реакции, возни кающие при введении реципиенту аллогенного материала [23, 24].

Заключение

В присутствии аллогенных и сингенных СККМ не проис ходило ингибирования пролиферации клеток респондеров в реакции смешанной культуры лимфоцитов - наоборот, количество клеток респондеров, находящихся в синтети ческой фазе клеточного цикла, в присутствии аллогенных СККМ могло достигать 85% при равном соотношении кле ток респондеров и аллогенных СККМ.

Известно, что нахождение клеток в S фазе означает уси ление синтеза нуклеиновых кислот, но не обязательно про лиферацию. Чтобы прояснить этот момент, мы производили подсчет количества спленоцитов в начале и в конце их инкубации в смешанной культуре и определили, что спле ноциты действительно пролиферируют. В то же время ясно, что сама по себе пролиферация лимфоцитов не всегда оз начает их функциональную активность. Сам факт пролифера ции лишь указывает на высокую вероятность последующего каскада иммунных реакций в ответ на чужеродный антиген. Также возможно, что СККМ стимулируют усиление метабо лизма и пролиферации не только лимфоцитов, но и прочих типов клеток, присутствующих в смешанной культуре1. Это может быть причиной терапевтического эффекта, оказы ваемого СККМ при их котрансплантациях с аллогенным материалом [25].

Аллогенные СККМ стимулируют начальные этапы реакции лимфоцитов на аллоантигены, т.е. усиление синтеза нуклеи новых кислот и пролиферацию. Тем не менее, это не может быть доказательством отсутствия у СККМ иммуномодули рующих свойств, так как неизвестно, как ведут себя лимфо циты после этих этапов: происходит ли продукция про или противовоспалительных цитокинов, осуществляется ли спе цифический лизис аллогенных СККМ и др. Таким образом, в дальнейшей работе по характеристике морфофункциональ ных свойств СККМ требуется последовательный анализ всех этапов взаимодействия аллогенных и сингенных СККМ с лимфоцитами, так как до настоящего времени относитель но них не существует единого мнения.

Подняться вверх сайта