Поиск Кабинет

Характеристика мультипотентных мезенхимных стромальных клеток, полученных из плаценты человека

Гены & Клетки: Том VII, №4, 2012 год, стр.: 55-61

 

Авторы

Шаблий В., Кучма М., Кирик В., Онищенко Г., Арешков П., Скрипник Н., Лукаш Л., Лобынцева Г.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Популяция мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), полученная из плаценты человека, характеризуется иммунофенотипом CD90+/CD73+/ CD105+/HLA-ABClow/CD34-/CD45-/CD133-/CD14- и присутствием клеток, продуцирующих цитокератин 7. Показано достоверное уменьшение количества клеток, экспрессирующих цитокератин-7, в течение трех пассажей в культуре. Установлен уровень химеризма клеток матери в культурах клеток плаценты. Выявлена экспрессия генов транскрипционных факторов, характерных для эмбриональных и сердечных стволовых клеток, OСТ-4 и NKX2-5, и впервые описана экспрессия генов spp1, col2a1 и ppar-γ2 в культуре клеток плацентарных ММСК, способных к дифференцировке в остеогенном, адипогенном и хондрогенном направлениях. Обоснована необходимость индивидуального подбора генов-маркеров дифференцировки для ММСК разного происхождения, в зависимости от исходного уровня их экспрессии.

Плацента млекопитающих является не только органом, выполняющим метаболическую, иммунную и гормональную функции для обеспечения развития плода. В последние годы установлено, что из тканей плацентарного хориона и амниона можно получить мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (MМСК) и мультипотентные клетки цитотрофобласта, которые характеризуются высоким уровнем экспрессии маркеров эмбриональных стволовых клеток (Oct-3/4, Nanog, SSEA-4 и щелочной фосфатазы) [1, 2]. Однако их молекулярно-биологические свойства еще не достаточно описаны, несмотря на очевидную актуальность данного научного направления и быстрые темпы его развития.

Целью данного исследования было охарактеризовать экспрессию некоторых генов у плацентарных ММСК на разных пассажах in vitro.

Материал и методы

Получение плацентарных ММСК

Плаценту получали в условиях родильного зала или операционной после физиологических родов или операции кесарева сечения на сроке беременности 39–41 нед. у пациенток в возрасте 23–36 лет на основании предварительного информированного согласия. Ткань плаценты промывали в растворе Хэнкса с добавлением 50 ед/мл амфотерицина, 100 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, после чего измельчали на фрагменты не больше 3 мм. Клетки выделяли методом ферментации в течение 10– 30 мин в растворе 0,1% коллагеназы I (Serva, Германия) и 0,6 ед/мл диспазы (Gibco, Германия) при температуре 37°С.

Для снижения активности ферментов к выделенным клеткам добавляли фетальную бычью сыворотку (ФБС, Sigma, США) до 10%-ной конечной концентрации. Полученную суспензию фильтровали через фильтр с диаметром пор 70 мкм (Becton Dickinson, США), и отмывали путем центрифугирования при 300 g в течение 10 мин. Осадок клеток суспендировали в растворе Хэнкса и высевали в питательную среду ДМЕМ (Sigma, США), содержащую 15% ФБС (Gibco, Германия), 2 мМ глютамина, 5 мМ НЕРЕS (Biomedicals, США), 100 ед/мл пенициллина, 50 мкг /мл стрептомицина. Культивирование проводили в культуральных флаконах для адгезивных клеток из расчета 300–400 тыс. клеток на 1 см2 при 37°С в атмосфере 5% СО2 с заменой среды 2 раза в нед. Пересев осуществляли при достижении культурой 80–90% конфлюэнтности монослоя в соотношении 1:3. Для пересева культуру выдерживали в течение 3–5 мин с 0,05% раствором трипсина-ЭДТА (Biochrom, Германия) до полного открепления клеток.

Проточная цитофлюориметрия

Иммунофенотипирование клеток осуществляли методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител, конъюгированных с флуорохромами (Becton Dickinson, США), в рабочей концентрации 0,5 мкг на 106 клеток: anti-CD34 APC, anti-CD90 FITC, anti-CD45 APC-Cy7, anti-CD105 PerCP-Cy 5.5, anti-CD73 PE, anti-CD14 Pacific Blue, anti-CD133 PE. Для детекции HLA-ABC использовали первичные мышиные моноклональные антитела (изотип IgG2b) к HLA-ABC человека (Millipore, США) в разведении 1:50 и вторичные крысиные моноклональные антитела к мышиным иммуноглобулинам IgG2a+b, коньюгированным с PerCP (Becton Dickinson, США) в объеме 20 мкл на 106 клеток.

Измерения проводили на лазерном проточном цитофлуориметре-сортере BD FACSAria (Becton Dickinson, США) с помощью программного обеспечения BD FACS Diva 6.1, анализируя одновременно 2 параметра светорассеяния и 6 параметров флуоресценции. Для настройки компенсации перекрытия спектров эмиссии флуорохромов при многопараметрическом анализе использовали контрольные образцы клеток без внесения антител (unstained control), образцы с каждым из антител отдельно (single stained control) и образцы с комбинацией нескольких антител без одного (fluorescence minus one control).

Направленная дифференцировка ММСК in vitro

Для определения способности дифференцироваться в остеогенном направлении культуру клеток на третьем пассаже инкубировали в среде DMEM с 10-7М дексаметазона, 10 мМ β-глицерофосфата и 0,1 мМ аскорбат-2-фосфата в течение 21 сут. Минерализованный матрикс проявляли окрашиванием 1% раствором ализаринового красного (Alizarine Red S).

Для адипогенной дифференцировки клетки культивировали в среде DMEM с добавлением 10% ФБС, 1 мкМ дексаметазона, 0,5 мМ изобутил-метилксантина (Sigma, США), 0,1 мМ индометацина (Sigma, США) и 10 нг/мл инсулина в течение 21 сут. Жировые включения проявляли окраской масляным красным (Sigma, США).

Хондрогенную дифференцировку индуцировали в среде DMEM с 6,25 мкг/мл инсулин-трансферрин-селенита, 0,1 мкМ дексаметазона, 0,1 мМ аскорбат-2-фосфата и 10 нг/мл TGF-β3 в течение 21 сут. Детерминацию дифференцировки проводили при формировании клетками локального скопления в капле питательной среды объемом 5мкл с концентрацией 1,6×107кл/мл. Для подтверждения хондрогенной дифференцировки проводили количественную оценку экспрессии мРНК коллагена 2-го типа с помощью ПЦР в реальном времени. Контролем служили клетки, которые культивировались в течение тех же сроков в питательной среде без индуцирующих факторов.

Выделение РНК и проведение ПЦР

Выделение РНК проводили с использованием Триреагента (Sigma, США). Полученную тотальную РНК обрабатывали ДНКазой и использовали для постановки синтеза кДНК по методике производителя (Fermentas, Германия). Для определения экспрессии генов использовали специальные праймеры (табл.).

Специфичность праймеров и размеры ампликона оценивали с помощью программ Primer-3 с использованием базы данных NCBI. Размер ампликона для гена ppar-γ2 – 257 н, spp1 – 331 н, col2a1 – 441 н, oct-4 – 163 н, nkx2-5 – 236 н, actb – 234 н.

Цитогенетический анализ

Осадок клеток добавляли в заранее подогретый цитрат натрия с колхицином. Инкубировали при 37°С 50–60 мин, после чего центрифугировали с трехкратной сменой метанол-уксусного фиксатора. После фиксации осадок капали на обезжиренные охлажденные стекла, выдерживали при 37°С минимум 48 ч и дифференциально окрашивали красителем Гимза с трипсином. Анализ метафазных пластинок проводили с использованием масляной иммерсии при увеличении ×1000 с использованием программы для кариотипирования Ikaros. Записывали результат согласно Международной системе классификации хромосом человека.

FISH анализ

Для проведения FISH анализа использовали криоконсервированные ММСК, полученные из плаценты новорожденных мужского пола, на третьем пассаже в количестве 200 тыс. клеток. Приготовление препаратов для гибридизации проводили по стандартной методике. Для гибридизации использовали зонды CEPХ SpectrumGreen probe и CEPY SpectrumOrange probe (Abbot Molecular, США). Ядра окрашивали с использованием DAPI (Abbot Molecular, США). Микрохимеризм материнских клеток определяли как процент ядер с сигналами двух Х хромосом, для анализа подсчитывали 500 ядер. Визуализацию проводили на флуоресцентном инвертированном микроскопе Olympus IX71.

Иммуноцитохимическое иследование

Для проведения иммуноцитохимического анализа клетки высевали в 4-луночные планшеты с площадью лунки 1,9 см2 (Nunclon™ Surface, США), фиксировали и пермеабилизировали смесью метанол-ацетон в соотношении 1:1. Эндогенную пероксидазную активность ингибировали 0,3% раствором H2О2 в течение 5 мин. Неспецифическое связывание блокировали в течение 30 мин. при комнатной температуре с помощью 0,1 М фосфатного буфера, содержащего 0,5% сывороточного альбумина быков. Для детекции маркерных белков использовали мышиные моноклональные антитела к цитокератину-7 (Dako, Дания), виментину (Dako, Дания) и поликлональные кроличьи антитела к щелочной фосфатазе (Abcam, USA). Визуализацию иммунных комплексов проводили с использованием Mouse/Rabbit PolyVue HPR/DAB Detection System (DBS, США).

Статистическая обработка данных

Уровень экспрессии поверхностных маркеров измеряли в процентах. Статистическую обработку проводили с использованием U-критерия Манна – Уитни.

Результаты и обсуждение

При культивировании клеток плаценты на 8–12 сут. появлялись клоны эпителиальных клеток. Кроме того, было отмечено присутствие большого количества небольших клеток с множеством отростков, экспрессирующих щелочную фосфатазу (рис. 1А). При дальнейшем культивировании образовывались клоны фибробластоподобных клеток, некоторые из которых характеризовались слабоположительной реакцией на щелочную фосфатазу (рис. 1Б).

Стромальные клетки плаценты на третьем пассаже in vitro продуцировали виментин. При инкубировании в течение трех пассажей содержание цитокератин-7+-клеток достоверно уменьшалось и составило 37,6% (26,6–49,4%) на 1 и 13,44% (2,5–31,1%) на 3 пассаже (n=6, p<0,05) (рис. 2).

Методом РТ-ПЦР анализа в культуре плацентарных ММСК в течение трех пассажей была выявлена экспрессия таких генов, как spp1, ppar-γ2, col2a1, nkx2-5 и oct-4 (рис. 3).

Присутствие в популяции клеток, продуцирующих виментин и цитокератин-7, вместе с экспрессией spp1 и ppar-γ2 может свидетельствовать о наличии клеток трофобласта в культуре ММСК плаценты. Также известно, что ММСК, полученные из яичника, экспрессируют цитокератин-7, и при культивировании в среде для эпителиальных клеток наблюдается увеличение его экспрессии, а при культивировании в среде для мезенхимальных – уменьшение, что, возможно, указывает на способность этих клеток к мезенхимально-эпителиальной трансформации [3]. Учитывая сказанное выше, можно предположить возможность мезенхимальной трансформации клеток трофобласта с образованием клонов фибробластоподобных клеток в культуре клеток плаценты человека.

Цитофлуориметрический анализ стромальных клеток выявил высокий уровень экспрессии поверхностных маркеров CD105, CD73, CD90, низкий – HLA-ABC и отсутствие гемопоэтических маркеров CD34, CD133, CD45, CD14, что подтверждает данные, приведенные в литературе [4, 5]. Популяция клеток с фенотипом CD90+/CD73+/CD105+/CD34-/ CD45- на 3 пассаже составила 94,7% (85,5–100%) (рис. 4).

Цитогенетический анализ показал, что ММСК, полученные из плаценты новорожденных мужского пола, имели нормальный кариотип (46, XY) с присутствием в среднем 1,2% материнских клеток (46, XХ) (рис. 5), что противоречит данным O.V. Semenov с соавт. (2010), постулировавшим, что культуры ММСК плаценты представлены клетками только материнского происхождения [6].

Согласно литературным данным, остеопонтин экспрессируется в клетках цитотрофобласта плаценты человека. Остеопонтин, совместно с карциномоэмбриональным антигеном (CAM-1), играет важную роль в регулировании инвазивности ворсинок хориона [7]. PPAR-γ в гетеродимерном комплексе с ретиноид-Х-рецептором альфа (RXR-α) продуцируется во вневорсинчастном трофобласте и участвует в регуляции его инвазивности. При действии агонистов PPAR-γ и RXR-α наблюдается ингибирование инвазии цитотрофобласта in vitro [8].

Полученные нами результаты по экспрессии nkx25 и oct-4, характерных для эмбриональных и сердечных стволовых клеток, согласуются с приведенными в литературе данными, где показано, что ММСК плаценты, помимо указанных выше генов, продуцируют также сердечный транскрипционный фактор GATA-4 и белки сократительной системы MLC-2α, cTnT [9]. Установленный нами сравнительно высокий уровень экспрессии гена col2a1 в стромальных клетках плаценты in vitro не описан в литературе, хотя известно, что плацентарные клетки in vivo экспрессируют мРНК этого гена [10].

На 21-е сут. после начала индукции в остеогенном и адипогенном направлениях, при окраске ализариновым красным и масляным красным культуры плацентарных клеток были обнаружены минерализованный матрикс и жировые включения, подтверждающие дифференцировку клеток в остеогенном и адипогенном направлениях, соответственно (рис. 6).

В присутствии индукторов хондрогенеза наблюдали изменение морфологии стромальных клеток плаценты: приобретение ими формы эпителиальных клеток, формирование агрегатов (рис. 7), двухкратное увеличение уровня экспрессии col2a1 (рис. 8), что может свидетельствовать о хондрогенной дифференцировке.

Также при культивировании плацентарных ММСК в средах с индукторами адипогенной дифференцировки было отмечено увеличение уровня экспрессии ppar-γ2 почти в 100 раз, по сравнению с контролем (рис. 9).

Заметим, что увеличение экспрессии остеопонтина (SPP1) не наблюдали, возможно, в связи с его высоким исходным уровнем. Учитывая этот факт, можно считать, что остеопонтин не может быть избран в качестве маркера остеогенной дифференцировки для плацентарных ММСК. Полученные результаты наглядно демонстрируют необходимость индивидуального подбора генов-маркеров дифференцировки для ММСК разного происхождения в зависимости от исходного уровня их экспрессии.

Таким образом, стромальные клетки плаценты при культивировании в присутствии индукторов адипо-, остео- и хондрогенеза дифференцируются в этих направлениях, однако остеогенный потенциал in vitro относительно низкий, что согласуется с данными G.A. Pilz с соавт. (2011).

Проведенные нами исследования показали, что из плаценты человека можно выделить ММСК, которые способны к адипогенной, остеогенной и хондрогенной дифференцировке in vitro, имеют поверхностный иммунофенотип CD90+/CD73+/CD105+/HLA-ABClow/ CD34-/CD45-/CD133-/CD14-, экспрессируют виментин и содержат минорную популяцию цитокератин-7+клеток.

Выводы

Из плаценты человека получены стромальные клетки, которые на основе их способности к адипогенной, остеогенной и хондрогенной дифференцировке, одновременной экспрессии виментина, CD90, CD73, CD105, HLA-ABC и отсутствия маркеров CD34, CD45, CD133, CD14 отнесены к ММСК.

Показано, что популяция плацентарных ММСК отличается наличием фракции клеток, продуцирующих виментин и цитокератин-7, содержание которых уменьшается по мере культивирования (от 37,6 до 13 % к третьему пассажу в культуре).

Обнаружена экспрессия генов транскрипционных факторов OСТ-4 и NKX2-5 плацентарными ММСК, характерных для эмбриональных и сердечных стволовых клеток.

Впервые выявлена экспрессия генов spp1, col2a1 и ppar-γ2 в культуре плацентарных ММСК.

Подняться вверх сайта