Поиск Кабинет

Гидрогелевый матрикс на основе биосовместимых карбомеров для восполнения дефектов нервной ткани

Гены & Клетки: Том III, №4, 2007 год, стр.: 63-69

 

Авторы

Фомина ГА., Масгутов Р.Ф., Штырлин В.Г., Зявкина Ю.И., Челышев Ю.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

На моделях формирования диастаза седалищного нерва крысы и последующего его преодоления при помощи кондуита нерва, а также полной перерезки спинного мозга мыши на уровне T9 исследовано влияние гидрогелевого матрикса из синтетических биосовместимых материалов на эффективность регенерации нервных волокон. Матрикс на основе полиакриловой кислоты [ПАК] поддерживает восстановление двигательной функции седалищного нерва. К 30 суткам эксперимента посттравматическое выживание нейронов спинального ганглия L5, по сравнению с контролем [пустая трубка), увеличивается в случае применения Carbopol® 971Р NF на 12,3%, а при введении в трубку ПАК - на 202%. К этому сроку в группе с ПАК количество средних нейронов на 10,8% больше, чем в группе с Carbopol. При этом количество регенерирующих миелиновых волокон в группе с ПАК на 10,3% превышает их количество в группе с Carbopol. Введение запатентованной композиции М4 из аминокислот и микроэлементов в гидрогелевый матрикс на основе ПАК или Carbopol изменяет характер его влияния на восстановление чувствительности кожи конечности в пользу Carbopol и не влияет на восстановление двигательной функции. Включение композиции М4 в гидрогелевый матрикс на основе ПАК или Carbopol в одинаковой мере поддерживает выживание больших нейронов и не влияет на количество выживающих нейронов других популяций в спинальном ганглии. В присутствии М4 ПАК более эффективно стимулирует регенерацию миелиновых волокон, чем Carbopol. Введение в разрыв спинного мозга мыши Carbopol с композицией М4 улучшает восстановление двигательной функции. Полученные результаты свидетельствуют о том, что синтетические биосовместимые материалы ПАК и Carbopol по-разному влияют на регенерацию нервных волокон в центральной и периферической нервной системе. Они могут найти применения для улучшения результатов посттравматической регенерации периферического нерва и спинного мозга.

ля эффективной посттравматической нейрорегенера ции представляется актуальной реконструкция тканевого матрикса в потенциальном пространстве роста аксонов [1]. Этот подход активно разрабатывается как для ЦНС [2, 3], так и для периферического нерва [4]. Для подобных задач наиболее исследованы природные биоматериалы, такие как коллаген [5], фибрин [6, 7], фибронектин [8]. В последнее время особое внимание уделяется гидрогелевым матриксам на основе синтетических биосовместимых и биодегради руемых материалов, таких как полиэфиры полилактид ко гликолид [9], полиметакрилаты [10, 11] и др. Поиск синте тических биоматериалов для поддержания процесса нейрорегенерации активно продолжается. К подобным материалам стали предъявлять дополнительные требования. Для более эффективной нейропротекции и стимулирования регенерации нервных волокон имплантируемый биоматрикс на основе синтетических биоматериалов должен сочетаться с нейротрофическими факторами [12, 13], фармакологи ческими нейропротекторами и стимуляторами нейрореге нерации [14, 15].

В работе проведена оценка эффективности посттравма тической регенерации нервных волокон в периферическом нерве и спинном мозге в условиях имплантации в разрыв нервной ткани гидрогеля на основе биосовместимых кар бомеров - полиакриловой кислоты (ПАК) и Carbopol® 971Р NF ПАК образует высоковязкие, кристаллические гидрогели [16], которые хорошо сочетаются с лекарственными, физио логически активными веществами и ферментами [17]. Кар бомеры Carbopol являются полимерами акриловой кислоты, сшитой с алильными эфирами пентаэритритола или дивинил гликоля, образуют гелевую матрицу, обеспечивающую пролон гацию действия активных фармацевтических субстанций [18], и превосходят часто используемый для этой цели полимер — натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) [18].

В работе проведено сравнение эффективности регене рации нервных волокон при использовании этих биомате риалов и КМЦ, положительно зарекомендовавшей себя как поддерживающая среда для фармакологических нейропро текторов и стимуляторов регенерации периферического нерва [19, 20].

В эксперименте и клинике на сегодняшний день остается практически нереализованным подход с локальным приме нением фармакологических нейропротекторов и стимулято ров роста нервных волокон, подводимых к месту повреждения нервной ткани. Между тем, наши предыдущие исследова ния с прицельной доставкой к шванновским клеткам, рас положенным в области травмы нервных проводников, фарма кологического стимулятора регенерации нерва ксимедона указывают на перспективность подобного подхода [19]. В качестве отдельной задачи в работе исследовано влия ние композиции аминокислот и микроэлементов (М4), вве денной в гидрогелевый матрикс на основе ПАК или Carbopol. Композиция М4 включает десять природных аминокислот [валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, триптофан, мети онин, лизин, серин, гистидин и глутаминовая кислота) и ряд микроэлементов (медь [II), марганец (II), кобальт (II), кальций (II), литий (I)), является малотоксичной и запатентована на предмет возможного применения в медицине [21]. Широ кий спектр биологического действия композиций аминокис лот и олигопептидов с микроэлементами [21, 22] даёт осно вание полагать, что их системное воздействие на организм осуществляется через ЦНС в тесной взаимосвязи с иммун ной системой. Эта проблема интенсивно разрабатывается в отношении нейропептидов [23], но не аминокислот самих по себе.

Материал и методы

Эксперименты на седалищном нерве проведены на бе лых беспородных крысах самцах весом 150-200 г (п = 32). Для опытов со спинным мозгом использовали белых беспо родных мышей самок весом 30-50 г (п=27). Животных содержали в пластмассовых клетках при температуре 18— 20°С со свободным доступом к воде и пище.

Тубуляция седалищного нерва крысы. У животных под уретановым наркозом (600 мг/кг, внутрибрюшинно) в ле вом седалищном нерве на уровне середины бедра формиро вали диастаз длиной 5 мм. Центральный и периферический концы нерва соединяли силиконовой трубкой (НИИРП, Рос сия) длиной 7 мм и внутренним диаметром 2,2 мм. Трубку фиксировали при помощи четырех эпиневральных швов мононитью 8.0 с атравматической иглой (Целита, Россия). Непосредственно перед фиксацией в трубку вводили геле вый матрикс на основе натриевой соли 1,8% Carbopol® 971Р NF (Noveon), натриевой соли 2% ПАК (Aldrich, м.в. 3000000) или 8% натриевой соли КМЦ (Pierre Fabre). Значения pH для гидрогелей Carbopol и ПАК поддерживали в пределах pH 6,3-7,3 путём добавления к растворам на бухших полимеров гидроксида натрия (Sigma), контроль pH осуществляли на pH метре Thermo Orion 420А+. У живот ных опытных групп в гидрогелевый матрикс на основе ПАК или Carbopol вводили композицию аминокислот и микро элементов М4 с общим содержанием аминокислот 9%. Первым контролем служили животные с введением в трубку только ПАК или Carbopol без композиции М4. Во второй кон трольной группе животные были прооперированы в тех же условиях, но тубуляцию нерва проводили при помощи пустой трубки.

О восстановлении функции двигательных нервных во локон судили по функциональному индексу седалищного нерва [24]. Восстановление функции афферентных нервных волокон определяли, тестируя чувствительность кожи конеч ности [25]. Функциональные тесты во всех группах проводили на 2, 7, 11, 14, 18, 21, 25 и 28 е сут. после операции. Дос товерность различий оценивали по Стьюденту.

Через 30 суток после операции под уретановым нарко зом (600 мг/кг) после ламинэктомии выделяли спинальные ганглии L5 на стороне операции, фиксировали в 10% нейт ральном формалине, обезвоживали и заключали в парафин по стандартной методике. Одновременно забирали 5 мм фрагмент периферического отрезка нерва дистальнее места травмы, фиксировали в 2,5% глутаральдегиде и 2% растворе четырехокиси осмия и заливали в эпон аралдит. Полутонкие срезы, окрашенные метиленовым синим, использовали для подсчета количества миелиновых волокон. На парафиновых срезах спинального ганглия толщиной 7 мкм подсчитывали количество выживающих нейронов [26]. Оценивали коли чество малых (< 30 мкма), средних (30-50 мкма) и больших (> 50 мкма) нейронов с видимыми ядрышками [26, 27].

У мышей под уретановым наркозом (600 мг/кг, внутри брюшинно) после ламинэктомии производили полную пере резку спинного мозга на уровне T9. Животным опытной группы в разрыв спинного мозга вводили гель на основе ПАК или Carbopol в количестве 0,0036-0,0040 г, содержащий композицию М4. Контролем служили животные без введения в разрыв спинного мозга гидрогелевого матрикса, а также мыши, которым в гидрогелевый матрикс не вводили компо зицию М4. В течение пяти дней после операции животные получали 1 % раствор цефазолина (6 мг/кг) для предотвра щения послеоперационных осложнений. Ежедневно прину дительно опорожняли мочевой пузырь. Восстановление ло комоторной функции оценивали при помощи теста в открытом поле [28] на 2, 7, 11, 14, 18, 21, 25 и 28 е сут. после опера ции. Статистическую обработку результатов проводили мето дом AN0VA, а также с использованием непараметрического критерия Манна Уитни.

Результаты и обсуждение

Во всех экспериментальных группах с тубуляцией функ циональный индекс седалищного нерва возрастает к 7 м сут. после операции. В группе животных с введением в трубку гидрогелевого матрикса на основе ПАК этот показатель, по сравнению с животными из группы с пустой трубкой увели чивается на 21, 25 и 28 и суг. после операции соответственно на 25,1 %, 20,4% и 20,9% (Р < 0,05). На 21 сут. после опера ции функциональный индекс седалищного нерва в группе животных с ПАК на 27,2% больше (Р < 0,05), чем у животных с КМЦ. Carbopol и КМЦ не влияли на восстановление дви гательной функции нерва.

Различия по показателю восстановления чувствитель ности кожи конечности в сравнении с контролем (группа с пустой трубкой) зарегистрированы только в случае с ПАК. При этом данный показатель на сроках 11, 14, 18 и 28 сут. возрастает соответственно на 17,3%, 18,7%, 11,2% и 13% (Р < 0,05). В экспериментальной группе с ПАК на 21, 25 и 28 е сутки после операции зарегистрировано увеличение по казателя восстановления чувствительной функции нерва соответственно на 30,1%, 40,1%, 40,2% (Р<0,05), по сравнению с одноименным показателями у животных в группе с Carbopol.

Анализ функциональных тестов свидетельствует, во первых, о том, что включение в состав кондуита нерва гид рогелевого матрикса оказывает стимулирующее влияние на рост нервных волокон. Во вторых, из протестированных биосовместимых материалов по критериям восстановления двигательной и чувствительной функции более эффектив ным оказался матрикс на основе ПАК.

Гелевый матрикс на основе Carbopol и ПАК (в большей степени) оказывает нейропротекторное действие в отно шении чувствительных нейронов. Посттравматическое выжи вание этих нейронов в спинальном ганглии L5, по сравне нию с контролем (пустая трубка), увеличивается на 12,3% (Р < 0,05), в случае введения в трубку Carbopol, а при введе нии ПАК — на 20,2% (Р < 0,05), различий в сравнении с КМЦ зарегистрировано не было.

Количество выживающих после травмы нерва больших нейронов в группе с ПАК по сравнению с группой животных с пластикой нерва при помощи пустой трубки, увеличивается на 9,4% (Р<0,05). Различия в количестве больших нейро нов при формировании кондуита нерва с Carbopol или КМЦ не выявлены. Количество средних нейронов при введении в трубку геля на основе Carbopol и ПАК превышает данный показатель у животных с пластикой нерва пустой трубкой соответственно на 22,2% (Р < 0,05) и 29,7% (Р < 0,05). Различия при сравнении групп с КМЦ не зарегистриро ваны. Количество средних нейронов в группе ПАК на 10,8% (Р < 0,05) превышает количество этих нейронов у животных с содержанием в трубке Carbopol. Различия в ко личестве малых нейронов не зарегистрированы.

Количество миелиновых волокон к 30 суткам, в группах (ПАК, Carbopol и КМЦ) не отличается от контроля (пустая трубка). При этом количество регенерирующих миелиновых волокон в группе с ПАК на 10,3% (Р < 0,05) превышает их количество в группе с Carbopol.

Введение композиции М4 в гидрогелевый матрикс на основе ПАК или Carbopol не изменяет показатель двига тельной функции седалищного нерва, однако при этом улуч шается показатель восстановления чувствительности кожи конечности в случае использования Carbopol. На 21, 25 и 28 е сут. после тубуляции седалищного нерва данный по казатель в группе с Carbopol+M4 увеличивается соответ ственно на 21,7%, 15,6% и 14,9% (Р < 0,05), по сравнению с контролем (матрикс на основе Carbopol без композиции).

Введение композиции М4 в гидрогелевый матрикс на основе ПАК не оказывает положительного влияния на вое становление чувствительности. Практически на всех сроках тестирования ПАК без добавления композиции М4 в боль шей мере поддерживает восстановление чувствительности нерва, чем ПАК+М4 (в среднем на 36,6%, Р < 0,05).

После травмы нерва количество выживающих больших нейронов в группе Carbopol+M4 увеличивается на 13,8% (Р < 0,05), по сравнению с контролем (Carbopol), и на 14,2% (Р < 0,05) в группе с ПАК+М4, по сравнению с контролем (ПАК). По критерию посттравматического выживания этих нейронов ПАК на 14,9% (Р < 0,05) более эффективен, чем Carbopol. Композиция М4, введенная в состав гидрогелей, не оказывает влияния на количество средних нейронов. Ко личество малых нейронов в группе с ПАК на 15,8% (Р < 0,05) больше по сравнению с ПАК+М4.

Подсчет миелиновых волокон в периферическом отрез ке нерва крысы показывает более эффективное влияние композиции в случае применения ПАК. Так, в группе ПАК+М4 данный показатель на 8,6% (Р < 0,05) больше, чем в группе Carbopol+M4.

У мышей после полной перерезки спинного мозга на уровне T9 восстановление локомоторной функции начина ется к концу первой недели в виде незначительных движений конечностей и к 30 м сут. характеризуется подвижностью в голеностопном и коленном суставах. Наибольшие значения показателя локомоторной активности зарегистрированы при введении в разрыв спинного мозга Carbopol с композицией М4 и на 7, 11 и 14 е сут. после операции данный показа тель выше соответственно на 52,6%, 46,6% и 50,9% (Р< 0,05), по сравнению с животными контрольной группы (перерезка спинного мозга без введения гидрогеля в разрыв). В группе животных с введением в разрыв Carbopol+M4 на тех же сро ках выявлено увеличение показателя локомоторной актив ности соответственно на 47,2%, 55,6% и 47,1% (Р < 0,05) по сравнению с животными контрольной группы с введени ем в разрыв только Carbopol.

Из всех протестированных в настоящей работе биосов местимых материалов ПАК проявила себя как наиболее эффективная среда для поддержания посттравматической регенерации периферического нерва. Под влиянием ПАК показано более динамичное восстановление двигательной и чувствительной функции нерва. Последний показатель коррелирует с наиболее выраженным позитивным влияни ем ПАК на посттравматическое выживание чувствительных нейронов. Однако, введение композиции в состав данного гидрогеля, по видимому изменяет его структуру и не позво ляет волокнам регенерировать. С другой стороны, компози ции несут противоположный эффект при использовании с Carbopol, что хорошо прослеживается при травме спинного мозга на ранних сроках тестирования. Отсутствие сдвигов в количестве миелиновых волокон в периферическом отрез ке нерва на фоне положительной динамики показателей функциональных тестов и количества выживающих чувстви тельных нейронов можно объяснить тем, что к 30 м суг. после травмы нерва и формирования его кондуита из централь ного в периферический отрезок прорастают преимуще ственно безмиелиновые волокна.

Достаточно велика вероятность того, что аминокислоты из применённой нами композиции способны участвовать в сборке олигопептидов, которые служат молекулярными «строительными лесами» в составе гидрогелевого матрик са и формируют направляющие пути в пределах тканевых дефектов. Подобные самособирающие системы из олиго пептидов могут не только формировать тканевый матрикс, но и позитивно влиять на внутриклеточные сигнальные пути, поддерживая выживание нейронов и рост аксонов в цент ральной и периферической нервной системе. Это предполо жение согласуется с данными, представленными в работе Ellis Behnke et al. [29], в которой даны обнадёживающие результаты по регенерации аксонов ЦНС и восстановлению функции при формировании в области разрыва зрительно го тракта специального матрикса из самособирающихся нановолокон, состоящих из олигопептида с последователь ностью аргинин - аланин - аспартат - аланин.

Подняться вверх сайта