Поиск Кабинет

Генный перенос в опухолевые клетки с помощью новых комплексов кардиолипиноподобных дикатионных липидов и плазмидной ДНК

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 57-61

 

Авторы

Жданов Р.И., Московцев А.А., Блохин Д.Ю., Дойникова А.Н., Шакирова Р.И., Себякин Ю.Л.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Липидные везикулы бисамфифилов кардиолипиноподобных дикатионных липидов (КДЛ) I-IV исследованы для получения липоплексов с плазмидными ДНК разных размеров для генного переноса в целях генотерапии. Размеры (300±100 нм) и стабильность (> 2 ч) липоплексов КДЛ оказались достаточны для использования в переносе генов в монослойные и суспензионные культуры клеток. Общая цитотоксичность по МТТ-тесту КДЛ оказалась ниже, чем у контрольной группы (липофектин). Оптимизированы условия трансфекции линий опухолевых клеток липоплексами бисамфифилов КДЛ и плазмидных ДНК. Наиболее эффективной трансфекция для липоплексов «КДЛ – плазмидная ДНК» оказалась при соотношении липид-ДНК (L/D) равном 5 (для липофектина при 2). Для монослойных культур клеток липоплексы КДЛ-I сравнимы по эффективности трансфекции с липофектином, а в случае суспензионной культуры их эффективность на 50% ниже. Это позволяет использовать их в качестве медиаторов для переноса генетических конструкций в опухолевые клетки человека.

Одной из наиболее распространенных невирусных систем переноса терапевтических генов в целях генотерапии являются катионные (фосфо)липидные везикулы (липосомы) [1–4]. ДНК спонтанно связывается с катионными липосомами, нейтрализуя свой отрицательный заряд, а образующиеся при этом комплексы – липоплексы – взаимодействуют с клеточной мембраной, интернализуются в клетку [5, 6]. Таким способом – липофекцией – могут быть трансфицированы большинство клеточных линий. Наиболее важен для интернализации липоплексов (геносом) в клетку процесс адсорбционного эндоцитоза [7, 8]. В экспериментах in vitro показано, что чем больше размер геносом (200–400 нм), тем выше эффективность трансфекции. Для экспериментов in vivo имеет место обратная ситуация [9–11]. Необходимо, чтобы липоплексы были стабильны в биологических средах, поскольку нестабильность комплексов in vivo могла бы приводить к закупорке капилляров. Возрастающий интерес к активности липоплексов на основе дикатионных поверхностных агентов обусловлен их необычными физико-химическими свойствами, отличающимися от мономерных аналогов [12–14].

Целью работы являлось создание липоплексов на основе бисамфифилов кардиолипиноподобных дикатионных липидов (КДЛ) и плазмидной ДНК, анализ их размеров и стабильности, а также эффективности генного переноса в монослойные и суспезионную культуры клеток. Описанные в работе липидные везикулы и липоплексы характеризовались устойчивостью к агрегации, субмикронными размерами и относительной нетоксичностью КДЛ в экспериментах in vitro, что позволит использовать их для переноса терапевтических генов в опухолевые клетки человека. Трансфекция линий клеток 293, MCF7 и Jurkat липоплексами КДЛ достаточна эффективна и зависит от длины алифатического спейсера катионных бисамфифилов, определяющего морфологию липоплексов.

Материал и методы

Все использованные в работе реагенты были химически чистые или чистые для анализа, растворители – свежеперегнанные, а вода – деионизованная, чистоты милли-Q.

КДЛ синтезированы как описано ранее [15] и их строение подтверждено совокупностью данных элементного анализа, 1Н-ЯМР- и ИК-спектроскопии, а также масс-спектрометрии.

Культуры клеток. Исследования проводились in vitro на культурах клеток MCF7, HEK293 и Jurkat. Клетки получены из Российской коллекции культур клеток позвоночных (Институт цитологии РАН). Все клетки паспортизованы, прошли контроль видовой специфичности (во всех случаях проведен кариотипический анализ) и контроль контаминации (бактерии, грибы и микоплазма не обнаружены) [16, 17].

Плазмидные ДНК pCMV-SPORT-β-gGal (7,2 kb) и pEGFP-N1 (4,7 kb) (обе – под контролем immediate early CMV promoter) наращивались в препаративном количестве в культуре Echerichia coli, были очищены и проанализированы согласно общепринятым протоколам [18].

Липосомы. Липидные везикулы получали согласно стандартным протоколам [2, 19]. Липиды КДЛ I-IV растворяли в хлороформе, липидную пленку получали выпариванием растворителя в роторном испарителе, затем сушили в вакууме. Далее ее снимали добавлением в колбу испарителя 130 мМ раствора NaCl при встряхивании на вортексе. К полученной суспензии больших мультиламеллярных липосом применяли последовательно диспергирование на ультразвуковой бане (Avanti Polar Lipids) 10 мин при 60°С и экструзию (экструдер LiposoFast, Avestin) через поликарбонатные фильтры 100–400 нм при 50°С. Устойчивость и размеры везикул определяли методом динамического лазерного светорассеяния, (ДЛС) на приборе NICOMP 380 (Submicron Particle Sizer Nicomp Model 370, Santa Barbara, USA), оборудованном He-Ne лазером с длиной волны 632,8 нм. Липоплексы. Комплексы ДНК:липид получали смешиванием растворов ДНК и везикул КДЛ I-IV с весовыми соотношениями 1:0,5; 1:1; 1:2,5;1:5; 1:7,5; 1:10 с последующей 30 мин. инкубацией. Комплексы ДНК: LipofectinR (Invitrogen, США) готовили согласно инструкции производителя с теми же весовыми соотношениями [2].

Культуры клеток и определение цитотоксичности липидов. Адгезионные клетки MCF7, HEK293 культивировали в среде DMEM (Gibco TM Invitrogen Corporation, США) c 10% FBS (Gibco TM Invitrogen Corporation, США) в атмосфере 5% СО2, суспензионные Jurkat – RPMI (Gibco TM Invitrogen Corporation, США) c 10% FBS (Gibco TM Invitrogen Corporation, США) в атмосфере 5% СО2. Цитотоксичность липосом КДЛ, LipofectinR и всех видов липоплексов, а также чистых плазмидных ДНК определяли с помощью MTT-теста [2, 16, 20].

Трансфекция. Свежеприготовленные липоплексы добавляли к клеткам в бессывороточной среде без антибиотиков и инкубировали в стандартных условиях культивирования в течение 2 ч. После этого клетки отмывали от липоплексов и среду заменяли на полную ростовую. Эффективность трансфекции оценивали с помощью световой и флуоресцентной микроскопии (в случае pEGFP-N1 и pCMV-SPORTβ-gal) с последующим цифровым анализом изображений с помощью программ Image Pro Plus (Media Cybernetics, США), а также посредством проточной цитометрии (pEGFP-N1) через 24 ч после липофекции по экспрессии репортерных белков и количественно рассчитывали как долю клеток, экспрессирующих ген к общему числу клеток в процентах [2, 19].

Проточная цитометрия. Для подсчета трансфицированных клеток использовали метод проточной цитометрии (pEGFP-N1) через 24 ч после липофекции по экспрессии репортерных белков. Эффективность трансфекции рассчитывали как долю клеток, экспрессирующих ген, к общему числу клеток в процентах. Анализ клеточных суспензий осуществлялся на проточном цитометре «Partec Pas» (Partec, Германия), оснащенном лазером с длиной волны 488 нм [2, 16].

Результаты и обсуждение

Химический дизайн и синтез КДЛ был проведен в МИТХТ с использованием блоков на основе пальмитоил-производных глутаминовой кислоты с заместителями при атомах азота [15]. Характерными особенностями химического строения молекул таких бисамфифилов являются гидрофобная часть, две четвертичные аммониевые группы, а также алифатический мостик (спейсер), соединяющий эти две полярные группы (рис. 1). Физико-химические свойства этих бисамфифилов являются перспективными для направленного формирования липоплексов в целях генного переноса в клетки-мишени [21].

Анализ размеров липидных везикул КДЛ I-IV и морфологии их липоплексов. В результате исследования размеров везикул обнаружено, что везикулы как КДЛ, так и DOTMA-DOPE (контроль) относительно устойчивы во времени в условиях полярного растворителя (вода) и постоянства pH (7,4), поддерживаемого буферной системой PBS при 37°C. Везикулы сохраняли свои размеры 50–70 нм (DOTMEDOPE) или 300±100 (КДЛ) в течение достаточно длительного времени (6 ч). Липоплексы КДЛ III и IV и pEGFP-N1 агрегировали с неравновесной кинетикой, приведшей к большим размерам и значительной ошибке определения. Катионный димер КДЛ II образовывал с плазмидной ДНК pEGFP-N1 две фракции липоплексов с исходными размерами 210 и 360 нм, последняя агрегировала интенсивнее. Полидисперсность размеров была выше у липоплексов, чем у липосомных препаратов. Липоплексы КДЛ-I и II характеризуются достаточной устойчивостью (> 2 ч) и имеют заряд, близкий к нейтральному.

Методом атомно-силовой микроскопии изучена пространственная структура комплексов, образующихся при смешении катионных липосом на основе димерных амфифилов с ДНК (данные не представлены). Так, для липоплексов катионных липосом КДЛ-I со спейсером m = 3 основной геометрической формой являлся тороид, тогда как для липоплексов КДЛ-II со спейсером m = 7 реализуется стержневидная структура, хотя присутствовало небольшое количество сферических частиц [21].

Цитотоксичность катионных димеров КДЛ. Общая низкая токсичность комплексов «катионный липид – плазмидная ДНК» является одним из основных условий использования в протоколах генной терапии [5, 9]. Для определения общей цитотоксичности КДЛ был использован МТТ-тест [20]. МТТ-тест был проведен на клетках HEK293, MCF7, Jurkat в двух временных интервалах – 12 и 24 ч для диапазона концентраций КДЛ, верхний предел которого более чем в 10 раз превышает рабочую концентрацию липидов (данные не представлены). Показано, что общая цитотоксичность КДЛ достоверно ниже, чем у липофектина; в диапазоне концентраций и при временах экспозиции, соответствующих условиям трансфекции, токсичность всех соединений незначительна, что делает возможным их применение в качестве агентов для переноса генов [16].

Эффективность трансфекции клеточных культур. Преимуществом невирусных систем трансфекции по сравнению с вирусными является, в частности, отсутствие жестких ограничений на размер генетических конструкций, что делает возможным применение сравнительно больших и сложных плазмидных ДНК. Для исследования влияния на эффективность трансфекции размеров КДЛ и генетических конструкций и оценки возможности применения их липоплексов использовали два вида репортерных систем: а) основанная на экспрессии в трансфицированных клетках фермента β-галактозидазы, идентифицируемой по хромогенной реакции с субстратом X-Gal; и б) основанная на экспрессии в транфицированных клетках мутантной формы зеленого флуоресцентного белка с оптимизированными спектральными свойствами (EGFP). Плазмидные ДНК перед образованием липоплексов находились преимущественно в суперскрученной форме (электрофоретическая подвижность).

В оценке эффективности трансфекции методами светлопольной и флуоресцентной микроскопии с прямым подсчетом клеток, экспрессирующих репортерный ген, статистически достоверных отличий между репортерными системами обнаружено не было (табл. 1). Наиболее эффективной трансфекция для липоплексов КДЛ-pEGFP-N1 оказалась при соотношении липид/ДНК (L/D) равном 5, для DOTMADOPE/ pEGFP-N1 – при 2. Для данных генетических конструкций влияния их размеров на эффективность трансфекции не выявлено. Доля трансфицированных клеток для липоплексов КДЛ I, II, III и IV была в случае монослойных культур MCF7 (39,20; 21,20; 3,27; и 1,52) и HEK293 (40,23; 25,40; 1,91; и 1,98), соответственно (табл. 1). В случае липофектина эта величина была 40,12 и 43,32 для MCF7 и HEK293, соответственно. Эффективность липоплексов в случае суспензионной культуры Jurkat была на порядок ниже (2,23 у КДЛ-I и 1,78 у КДЛ-II), как для липофектина (4,12). Наибольшая трансфицирующая способность была отмечена у липоплексов КДЛ-I в адгезионных культурах MCF7 и HEK293. Для суспензионной культуры Jurkat ни одна из предложенных невирусных систем не оказалась эффективной.

Метод проточной цитометрии по флуоресценции EGFP с применением репортерной системы pEGFPN1 был использован для определения различий в эффективности трансфекции среди катионных липидов (КДЛ I-IV и DOTMA/DOPE) и между клеточными культурами (MCF7, HEK293, Jurkat). Наиболь шая эффективность трансфекции была отмечена нами у липоплексов на основе КДЛ-1 и липофектина на культурах клеток MCF-7 (≈39% для КДЛ-I) и HEK293 (≈40% для КДЛ-I). Для суспензионной культуры Jurkat ни одна из изученных невирусных систем не оказалась эффективной (рис. 2).

Выводы

1. Размеры (300±100 нм) и стабильность (> 2 ч) липоплексов КДЛ оказались достаточны для использования в переносе генов против монослойных и суспензионных клеточных культур. Общая цитотоксичность липидов КДЛ по МТТ-тесту оказалась ниже, чем у контольной группы (липофектин).

2. Оптимизированы условия трансфекции линий опухолевых клеток липоплексами бисамфифилов КДЛ и плазмидных ДНК. Для монослойных культур клеток липоплексы КДЛ I сравнимы по эффективности трансфекции с липофектином, а в случае суспензионной культуры их эффективность значительно ниже.

Подняться вверх сайта