Поиск Кабинет

Генно-клеточная терапия наследственных заболеваний мышечной системы: современное состояние вопроса.

Гены & Клетки: Том IX, №4, 2014 год, стр.: 6-33

 

Авторы

Деев Р.В., Мавликеев М.О., Бозо И.Я., Пулин А.А., Еремин И.И.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Генетические заболевания, приводящие к первичному поражению скелетной мышечной ткани, могут быть обусловлены дисфункцией более чем 30 генов. Сегодня не существует эффективных способов их этиотропного и патогенетического лечения. Исследователи сосредотачивают свои усилия на поиске новых терапевтических средств, относящихся к генным и клеточным технологиям, а также использованию малых молекул. В мире проведен большой пул доклинических исследований, а также выполнены несколько десятков клинических исследований. К сожалению, испытанные технологии пока не привели к существенному прогрессу в лечении пациентов с данными заболеваниями. Вместе с тем, полученные данные позволяют определить наиболее целесообразные направления дальнейших разработок – совмещение методик коррекции генома с клеточной доставкой исправленного генома в скелетную мышечную ткань. Настоящий обзор призван дать общие представления об этиологии генетических заболеваний мышц скелета, основных направлениях биотехнологических разработок и результатах выполненных клинических исследований.

1. Проблема наследственных заболеваний мышечной системы

Как правило, значительный вклад в актуальность той или иной проблемы для медицинской науки привносят ее недостаточная изученность – несовершенство наших исследовательских инструментов для вскрытия генетической и молекулярной сущности этиологии и патоморфогенеза; неспособность современных лечебно-диагностических технологий к своевременному распознаванию, точной идентификации, этиотропному лечению болезней и эффективной профилактике их причины. Все это в полной мере справедливо в отношении наследственных заболеваний мышечной системы – группы болезней, характеризующихся непрерывно-прогредиентным поражением мышечной ткани (скелетной поперечно-полосатой, сердечной и др.).

Наследственные заболевания мышечной системы относятся к миопатиям – сборной когорте болезней, характеризующейся первичным поражением скелетной мышечной ткани [1]. В настоящее время отсутствует общеупотребимая универсальная классификация этих болезней. Условно их подразделяют на врожденные миопатии, миодистрофии – заболевания, сопровождающиеся некрозом мышечной ткани и развивающиеся после рождения, миотоническую дистрофию и др. Одновременное использование нескольких классификационных критериев позволяет выделить: а) по времени дебюта – врожденные болезни и развивающиеся после рождения; б) по типу наследования – для заболеваний с менделевским типом наследования – аутосомнодоминантные, аутосомно-рецессивные, Х-сцепленные; в) по топографии пораженных мышц – поясноконечностные, лице-плече-лопаточные, орофарингиальные и др., которые в совокупности составляют группу прогрессирующих мышечных дистрофий [2].

По мере расшифровки молекулярной и генетической природы этих болезней все прочнее в практику входят классификации, базирующиеся на знании генов, чья функция нарушена в результате спонтанных и унаследованных мутаций. Важно отметить, что в группу врожденных миопатий помимо заболеваний, связанных с нарушением синтеза структурных белков мышечной ткани (миодистрофии) входят некоторые митохондриальные болезни (дефекты в генах генах митохондриальной ДНК) и «болезни накопления», связанные с нарушением ферментов мышечного волокна (напр. болезнь Помпе). В зависимости от локализации (по отношению к мышечному волокну) белков, чьи гены подверглись повреждению, целесообразно выделить 7 групп таких заболеваний, связанных с повреждением: 1) белков внеклеточного матрикса (коллаген VI типа, мерозин – α-субъединица ламинина и др.); 2) белков базальной мембраны и сарколеммы (интегрины α7, -α9); 3) белков сарколеммы (дистрофин, дисферлин, саркогликан и др.); 4) ферментов саркоплазмы (гликозилтрансферазы и др.); 5) эндоплазматической сети мышечного волокна (селенопротеин N1); 6) кариолеммы (ламины А/С, эмерин и др.); 7) митохондрий (холинкиназа β) [1, 3–6]. Нарушения в структуре этих генов (миссенсмутации, нонсенс-мутации, триплетные повторы и др.) приводят к нарушению синтеза белков – преждевременной остановке рамки считывания (короткий и нефункциональный белок), изменению нуклеотидной последовательности и др., что в фенотипе пациента проявляется нарушением или полным выпадением функции, выполняемой данной молекулой; наличие некоторых «мышечных» белков не только в мышечной ткани, но и в других часто обусловливает полиморфную клиническую картину с немышечными клиническими проявлениями – кардиомиопатия, энцефалопатия, поражение кожи и др. (рис. 1, табл. 1). Развивающиеся вслед за этим патоморфологические и патофизиологические сдвиги приводят к формированию закономерной гистологической и клинической картины при том или ином заболевании. Иными словами, в основе патоморфогенеза при данных болезнях лежит цепь: «ген-белок-функция-болезнь».

По данным 2014 г. описано не менее 31 гена, мутации в которых приводят к развитию миодистрофий, 8 из них наследуются по аутосомно-доминантному принципу и 23 – по аутосомно-рецессивному [3–5]. Эти заболевания характеризуются чрезвычайно пестрой клинической картиной, разными сроками клинической манифестации, различной степенью тяжести, зачастую нестандартными полиорганными проявлениями, которые не пока еще далеко не изучены с точки зрения надежных корреляций не только между геном/белком и проявлением в фенотипе, но и, что оказалось важным, между экзоном, в котором произошла та или иная мутация, и типом мутации. Вышеперечисленные причины, наряду с низкой информированностью об этих болезнях медицинских работников, приводят к поздней диагностике, сложностям в проведении дифференциально-диагностических мероприятий, а, следовательно, несвоевременному и низкому качеству оказания лечебной и профилактической помощи семьям с такими заболеваниями. Одной из граней этой проблемы является и малое количество современных биотехнологических разработок, в том числе предполагающих таргетное использование генных и (или) клеточных технологий для коррекции состояния мышечной ткани у пациентов. Безусловным «флагманским направлением» в изучении и поиске средств решения проблемы остается Х-сцепленная прогрессирующая мышечная дистрофия Дюшенна (МДД), что объясняется высокой частотой заболевания – 1:3500–5000 мальчиков, драматическим течением – редкое дожитие до 25 лет. Так, по данным базы PubMed.com из 22 840 статей по запросу «muscular dystrophies» треть (7196) посвящены МДД. Похожая ситуация в мире и с клиническими исследованиями. Из 275 зарегистрированных клинических протоколов (включающих не только исследования безопасности и эффективности новых средств лечения, но и методы диагностики, наблюдательные программы, статистические и популяционные исследования с вовлечением пациентов и др.) 159 выполняется с участием пациентов, страдающих миодистрофией Дюшенна. Важно отметить, что протоколов, призванных изучить биотехнологические подходы к лечению наследственных заболеваний мышечной системы – генные и клеточные технологии, применение малых молекул – всего около трех десятков вне зависимости от нозологии. Таким образом, проблема своевременной диагностики и поисков эффективных средств борьбы с генетически обусловленными поражениями мышечной системы остается высокоактуальной и, безусловно, нерешенной.

2. Основные биофармацевтические подходы к коррекции наследственных заболеваний мышечной системы

Основные биофармацевтические подходы к лечению данной группы пациентов связаны с попыткой остановить развитие основных этапов патоморфогенеза заболевания. В общей и очень приблизительной схеме структурные и функциональные нарушения в мышцах включают несколько этапов: гибель дискретных мышечных волокон (некротическая стадия), что связывают с повреждением мембраны волокна, и выходом протеолитических ферментов (например, кальпаина) [43]; воспаление – как ответ организма на некроз; реактивная репаративная регенерация – постнатальный рабдомиогистогенез; замещение погибших объемов мышечного органа соединительной и жировой тканями, что в некоторых случаях приводит к визуальному увеличению мышц – ложной или истинной гипертрофии, а позднее – к их атрофии и субтотальной утрате функций [8, 44]; вовлечение в этот процесс дыхательной и глоточной мускулатуры, а также миокарда является предиктором фатального исхода болезни. Клиническую, лучевую и патоморфологическую диагностику существенно усложняет то, что данные процессы после определенного возрастного рубежа, характерного для каждого заболевания, являются не просто стадиями развития болезни, но параллельно происходящими в тканях явлениями, часто наслаивающимися друг на друга (рис. 2).

Знания об основных этапах патоморфогенеза необходимы исследователям и разработчикам лекарственных или иных средств лечения для определения потенциально эффективных мишеней – звеньев и этапов патоморфогенеза для коррекции конкретного заболевания.

Примером рационального поиска молекулярных и клеточных таргетов для современных биотехнологических разработок может являться схема, предложенная Jain Foundation Inc. для изучения терапевтических эффектов различных агентов при коррекции поясно-конечностной мышечной дистрофии, связанной с мутацией в гене белка дисферлина (рис. 3).

Данная схема предполагает разработку лечебных средств как в зависимости от типа мутации (миссенсмутации – посттрансляционная коррекция дефектного белка белками-шаперонами; заместительная клеточная терапия для выработки полноценного белка и др.; при нонсенc-мутациях – пропуск экзона и др.). В случаях, когда мутацию нельзя скоррегировать на этапах молекулярной реализации программы гена и деградация мышечных волокон уже проявляется в фенотипе, то для замедления этого процесса, а также воспаления и последующего фиброза могут быть применены способы их замедления, например, гормонотерапия, а также способы умеренной индукции репаративного рабдомиогистогенеза. В последние несколько лет существенное развитие получили экспериментальные способы коррекции генома, которые, несомненно, являются наиболее приближенными в настоящем контексте к понятию «этиотропного» лечения.

Таким образом, все методы могут быть разделены на три группы: предотвращающие синтез дефектного белка и деградацию мышечного волокна; стимулирующие репаративную регенерацию мышечной ткани; и – воздействующие на сопутствующие процессы – воспаление, фиброз и проч. Две последние группы могут быть объединены под общим заголовком «средства, снижающие проявления миодистрофического фенотипа».

2.1. Биофармацевтические технологии, предотвращающие синтез дефектного белка и деградацию мышечного волокна

В качестве терапевтических агентов могут быть использованы рекомбинантные протеины, терапевтические гены, доставленные вирусными и невирусными векторами, средства коррекции генома, антисмысловые олигонуклеотиды, малые интерферирующие РНК (siRNA) и др. Кроме этого, ранее в качестве перспективных терапевтических агентов рассматривались и различные виды клеток, некоторые авторы до сих пор склонны расценивать их как самостоятельные терапевтические агенты [46, 47]. Однако, накопленная информация позволяет расценивать различные популяции эукариотических клеток лишь как средства доставки исправленного генетического материала в мышечную ткань и непосредственно в мышечные волокна. Потенциально возможным исключением в этом смысле может являться трансплантация in utero [48, 49]. Скелетная мышечная ткань является одной из наиболее сложных мишеней для клеточной и генной терапии. Исследователи отмечают, что 640 мышц человеческого организма составляют около 40% массы взрослого человека. В этой связи доставка биофармацевтического средства в каждое пораженное волокно становится едва ли не самой сложной задачей этиотропного лечения наследственных поражений мышечной системы [50, 51], особенно, если учесть, что по оценкам специалистов ожидание успешного терапевтического эффекта возможно при трансфекции (для генной терапии) не менее 20–40% всех мышечных волокон [46]. Таким образом, биофармацевтические агенты нуждаются в эффективной доставке, для которой безопасно могут быть использованы, например, клетки, обладающие тропностью к мышечной ткани.

2.1.1. Рекомбинантные протеины и индукторы их выработки

Ввиду того, что большая часть белков мышечного волокна имеет сложную пространственную конформацию и несколько функциональных доменов, рекомбинантные протеины, как правило, оказываются неэффективны с точки зрения замещения функции поврежденных молекул. Вместе с тем, имеются примеры потенциально возможного дублирования структуры и функции неполноценного продукта. В частности, небесперспективным для пациентов с МДД является увеличение уровня ортолога дистрофина утрофина (utrophin1) в мышечных волокнах больных пациентов, чтобы компенсировать отсутствие дистрофина [52, 53]. Данный белок выполняет функции дистрофина в пренатальном развитии, а после рождения замещается им, хотя в некоторых количествах остается в области моторных бляшек и мышечно-сухожильных переходов и у взрослых. Механизмы переключения с фетального белка на дефинитивный не известны в полной мере, вместе с тем этот процесс сам по себе является важной мишенью для коррекции многих наследственных болезней. У mdx-мышей (модель МДД) показано, что повышение уровня утрофина в дистрофичных мышечных волокнах может восстановить присутствие на сарколемме участников дистрофин-ассоциированного белкового комплекса и снизить фенотипическое выражение миодистрофии [54, 55]. Исследователи оценили в эксперименте эффективность внутрибрюшинного введения рекомбинантных молекул утрофина и мини-утрофина [56].

Изучение механизма транскрипционного контроля утрофина позволило выявить новые мишени для фармакологического воздействия [57]. В частности, выявление промотора утрофина-А инициировало поиск малых молекул, которые могут стимулировать транскрипцию гена утрофина. Высокопроизводительный скрининг позволил идентифицировать ряд таких малых молекул – BMN195, SMT C1100 и др., которые сейчас исследуются на ранних фазах в клинике.

Некоторые авторы сообщают об иных подходах для увеличения уровня утрофина, основанных на применении RhoA, херегулина и L-аргинина и ингибирование кальпаина [57, 58], хотя не один из этих способов и не привел в эксперименте к существенному увеличению уровня утрофина.

Были изучены и другие соединения, относящиеся к категории малых молекул, однако их потенциальная эффективность для коррекции дефицита определенных белков остается дискуссионной [59].

2.1.2. Генная терапия

Генная терапия остается одним из немногих способов потенциально возможной коррекции состояния больных. В узком смысле она подразумевает использование вирусного и невирусного трансфера полноразмерных или мини-генов белков мышечной ткани, который приведет к выработке полноценного в структурно-функциональном смысле трансгена, способного компенсировать утраченную функцию мышечного органа. В широком смысле, к этиотропным способам коррекции также следует отнести методы пропуска экзонов (экзон-скиппинг), способы коррекции генома.

Невирусный генный трансфер (плазмидный вектор) несмотря на известную низкую эффективность, при внутривенном введении приводил к 10% увеличению синтеза дистрофина у mdx-мышей, с продолжительностью эффекта не менее 6 мес.[60]. В клинике проведено исследование по программе 1 фазы с включением 9 человек. Терапевтическую плазмиду вводили в m. radialis (принцип «лечение одной мышцы») в дозе от 200 до 600 мкг, однократно или двукратно с двухнедельным перерывом. Результат оценивали через 3 нед. Установлено, что местное введение плазмиды безопасно. Кроме того, показана трансфекция и синтез дистрофина частью мышечных волокон – 6% волокон имели восстановленный дистрофин в сарколемме, 26% волокон продемонстрировали частичное восстановление [61].

Вирусный генный трансфер, особенно с применением интегрирующихся в геном векторов, приводит к длительной или постоянной экспрессии трансгена, что наиболее предпочтительно в ситуации с наследственными заболеваниями [62]. Однако эта группа способов сопряжена с известными рисками, включая инсерционный мутагенез – например, в случае применения лентивирусных конструкций. Кроме этого, конструкций с учетом объема мышечной ткани в организме ассоциирована с недопустимой вирусной нагрузкой, которую пришлось бы достичь при реализации этого подхода.

Имеются многочисленные сведения об успешной коррекции нарушений функции дистрофина у модельных животных при использовании генотерапевтических конструкций, изготовленных на платформе аденовирусов, аденоассоциированных вирусов (ААВ) [2, 6, 63, 64]. Последние характеризуются недостаточной для больших генов (дистрофин, дисферлин) емкостью капсида, что вынуждает исследователей оптимизировать технологию изготовления генотерапевтического препарата. Так, для коррекции миопатии Дюшенна в эксперименте применён оптимизированный ген дистрофина – «мини-дистрофин» («микро-дистрофин») [65–67]. Авторы получили устойчивую экспрессию белка у модельных животных в длительные сроки. В частности у приматов – от 5 мес. до 7 лет, причем при таргетном эндоваскулярном введении на ранних этапах дистрофин экспрессировали более 80% волокон [67–69].

У животных не было отмечено иммунных реакций ни на вирусную нагрузку, ни на трансген. Полученные результаты позволили перейти к клиническим исследованиям данной технологии.

В 2010 г. научная группа Изабель Ришар применила другой подход. В результате естественной способности ААВ векторов к конкатемеризации происходит объединение двух частей кДНК и экспрессия полноразмерного белка дисферлина [70]. Внутримышечная инъекция двух рекомбинантных ААВ в мышцу модельным мышам линии A/J привела к экспрессии полноразмерного дисферлина, продолжающейся, по крайней мере, в течение одного года. Важно, что системная инъекция в хвостовую вену мышей этих двух векторов привела к системной, хотя и слабой, экспрессии белка. Оптимизировав данную технологию, авторы считают ее готовой для апробации в клинических исследованиях [71]. Показана краткосрочная и долгосрочная безопасность системного введения ААВ, а также определенная тропность некоторых их серотипов к мышечной и другим тканям [72, 73]. Продемонстрировано, что доставка ААВ активатора промотора атрофина (artificial zinc finger transcription factor «Jazz») способствует компенсации состояния мышечной ткани в эксперименте [74].

2.1.3. Малые интерферирующие РНК

Применение малых интерфрирующих РНК для предотвращения синтеза дефектных белков считается целесообразным у пациентов с доминантными формами миопатий [75]. Эту технологию начали активно разрабатывать в последние 5 лет. В ее основе лежит возможность создавать олигонуклеотидные последовательности РНК, которые связываются с комплементарными участками мутантного гена и предотвращают считывание патологической информации. Одним из ее очевидных преимуществ является возможность системного введения и одновременная коррекция состояния всех мышц, без превышения допустимой вирусной нагрузки. В случае доминантных заболеваний siRNA потребуют постоянного применения, т.к. весьма неустойчивы внутри клетки и оказывают лишь временный эффект.

2.1.4. Экзон-скиппинг

Метод пропуска поврежденных экзонов (exon skipping) предполагает «достройку» обходного параллельного пути для рамки считывания, минуя поврежденный экзон, что приводит к синтезу укороченного белка, который тем не менее может сохранить свою функциональность [76, 77]. Разработана технология создания и введения антисмысловых нуклеотидов, комплементарных пре-мРНК [77, 78]. Технически это достигается созданием: а) альтернативного экзона из антисмысловых олигонуклеотидов; б) псевдоэкзона и др. (рис. 4). Некоторые конструкции для экзон-скиппинга нуждаются в вирусной доставке; однако продвинутых фаз клинических исследований достигли безвирусные конструкции, чью химическую устойчивость в крови и связь с альбуминами обес-печивают при помощи связывания терапевтических олигонуклеатидов с морфолинами или другими агентами.

Подход к лечению с помощью экзон-скиппинга можно назвать полуперсонифицированным, ведь созданная молекула обеспечит пропуск целого экзона вне зависимости от нуклеотида в его составе, в котором произошла мутация, а значит будет подходить большему числу пациентов, чье заболевание вызвано мутацией в конкретном экзоне.

В экспериментах с животными была показана потенциальная эффективность такого подхода для коррекции мутаций в гене дистрофина. Так, у mdxмышей, золотистых ретриверов и спаниелей с миопатией Дюшенна/Беккера была продемонстрирована эффективность экзон-скиппинга при прямом внутривенном введении терапевтической конструкции [79-82]. Для предотвращения быстрого выведения из кровотока, конструкции наделяют способностью образовывать комплексы с альбуминами плазмы крови [83]. Полученные данные стали обоснованием проведения 1 фазы клинических исследований с конструкцией, имеющей название Drisapersen (PRO051, GSK2402968), разрабатываемый компанией Prosensa/BioMarin/GlaxoSmithKleine, который в настоящее время находится на III фазе клинических исследований и Eteplirsen (AVI-4658) компании AVI BioPharma/Sarepta Therapeutics (II и III фазы клинических исследований). Оба препарата обеспечивают пропуск 51-го экзона гена дистрофина, обусловливающего заболевание у 13% больных. Несмотря на схожесть механизма действия, судя по всему Drisapersen не подтвердил высоких ожиданий в клинических исследованиях [84].

Интересной находкой стало то, что антибиотики группы аминогликозидов, в частности – гентамицин, показали в экспериментах на mdx-мышах свойство снижать проявления миодистрофического фенотипа. Было показано, что он обладает способностью парировать преждевременную остановку трансляции в случаях нонсенс-мутаций (досрочный стоп-кодон). Потенциально этот эффект может оказаться полезным около 15% пациентов с миопатией Дюшенна, у которых заболевание связано именно с таким типом повреждения гена. На основе этого эффекта был создан прототип препарата PTC124 (химически отличный от аминогликозидов), позже получивший название Аталурен. Несмотря на доказанную в экспериментах эффективность, в ходе клинических исследований результаты оказались неубедительными, хотя положительный эффект и был показан у 1/3 пациентов [84–86].

2.1.5. Коррекция генома

Известно несколько технологий коррекции генома, которые имеют потенциальные медицинские аппликации [87]. Так, в 1996 г. была предложен способ точечного разрыва связей в ДНК (in vitro) при помощи т.н. Zn-фингерных эндонуклеаз (Zn-finger nuclease, ZFN), представляющих собой химерные белки, состоящие из двух частей – сайтспецифичной нуклеазы и «цинковых пальцев», узнающих один конкретный триплет нуклеотидов. Помимо значительного вклада в биоинженерию бактерий, растений и др. организмов, конструкции были испытаны в клинических исследованиях у пациентов с ВИЧ, являющихся гетерозиготами по мутации Δ32 в гене белка-рецептора CCR5 [88, 89]. Опубликованные результаты свидетельствуют о безопасности методики и потенциальной пользе, приносимой пациентам [90]. В настоящее время исследования продолжаются уже по программе I / II фазы [91– 93]. Созданы конструкции, обеспечивающие синтез функционального дистрофина в клетках, полученных от пациентов с мутацией в 51 экзоне [94]; в доклинической стадии исследования установлена их безопасность и потенциальная эффективность.

Технология TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases, эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции) имеющая ряд преимуществ перед ZFN [87], в частности – TALENs показывают меньшую неспецифичность к последовательностям ДНК и цитотоксичность по сравнению с ZFNs [95]. Разработана конструкция для таргетной коррекции у пациентов с мутацией в 51 экзоне [96], однако о дальнейших исследованиях с ней пока не сообщается.

Более эффективная техника прицельного двуцепочечного разрыва ДНК и сшивки их со свободными фрагментами при помощи CRISPR/Cas9 (узнавание системой CRISPR/Cas осуществляется за счет комплементарного взаимодействия между некодирующей РНК и ДНК целевых сайтов; данный молекулярный инструмент состоит из некодирующей РНК и белка Cas, обладающего нуклеазной активностью) позволило начать широко отрабатывать в доклинических исследованиях возможности коррекции болезней, в первую очередь предполагающих клеточную форму доставки исправленного генома путем трансплантации при гематологических (включая онкогематологические осложнения при HIV-инфекции) и метаболических заболеваниях [97–100]. Применение данной технологии в доклинических моделях для коррекции мышечных заболеваний пока еще не стало очевидным трендом, в значительной степени из за того, что не решены технологические проблемы доставки исправленного генома в мышечную ткань реципиента. Коррекция мутации на уровне зиготы приводила к рождению различных по степени экспрессии дистрофина mdx-мышей – от 2 до 100% мышечных волокон экспрессировали белок [101, 102]. Перспективными для одновременной коррекции и доставки исследователи считают клетки с индуцированной плюрипотентностью (индуцированные плюрипотентные клетки, Induced pluripotent stem cells, iPS) [103].

2.1.6. Искусственные хромосомы

Создание искусственных хромосом человека (Human Artificial Chromosome, HAC) по методике «Top-down» [104] или «Bottom-up» [105] стало существенной вехой в разработке способов коррекции генома. В данном случае в лабораторных условиях изготавливается носитель генетической информации, обладающий всеми необходимыми свойствами хромосомы живой клетки – центромерой и теломерами, но несущей информационную кассету, содержащую терапевтические гены и гены, необходимые для регулирования HAC. При попадании в клетку она способна к репликации и передаче в дочерние клетки в случае деления [106].

М. Oshimura и G. Cossu (2009–2012) адаптировали данную технологию для коррекции патологии у mdx-мышей и др. моделей [107–109]. Авторы показали реализуемость коррекции ex vivo мышиных «миобластов» с дефицитом дистрофина и удовлетворительную эффективность при обратной трансплантации исправленных клеток в мышцы [108]. Также установлено, что аналогичным методом удается скоррегировать клетки, полученные от пациентов с саркогликанопатией, а после индукции в них фенотипа iPS и трансплантации иммунодефицитным мышам они способны к нормальному рабдомиогистогенезу с полноценной экспрессией саркогликана [109].

По методике V. Larionov [101] был создан прототип HAC, несущей ген дисферлина [110, 111]. После перенесения генной конструкции в клетки китайского хомячка был констатирован синтез целевого белка. Дальнейшее развитие этого направления должно показать возможность коррекции патологического мышечного фенотипа in vitro и in vivo.

Одним из наиболее труднореализуемых этапов данной технологии является эффективная доставка сконструированной хромосомы с терапевтической кассетой в необходимый тип клеток [106]. Для этого используется метод создания микровезикул (микроклеток) – microcell-mediated chromosome transfer.

Однако, после генной коррекции in vitro исправленная популяция клеток должна обладать как свойством клоногенности – для эффективной экспансии ex vivo, таргетингом к скелетным мышцам, так и способностью к дифференцировке в миогенном направлении и (или) высокоактивным слиянием (fusion) со скелетными мышечными волокнами.

Таким образом, разнообразные методы лечебных манипуляций с геномом обладают потенциально различной реализуемостью и, что особенно важно, различными показаниями к применению того или иного метода. Так методы экзон-скиппинга могут быть реализованы только у тех пациентов, у которых мутации произошли в экзонах, для которых созданы или создаются коррегирующие конструкции. По-видимому, для пациентов с редкими мутациями могут быть применимы остальные виды генной терапии. У пациентов с нонсенс-мутациями, средства переноса через стоп-кодон.

2.2. Коррекция миодистрофического фенотипа ткани (патогенетическая терапия; средства, оптимизирующие процесс регенерации)

2.2.1. Клеточная терапия

Несмотря на выдающиеся успехи тканевой инженерии в отношении мышц, в настоящее время клеточная терапия рассматривается не как самостоятельный способ лечения, способный существенно корригировать заболевание остановкой процесса деструкций мышечной ткани, а скорее как неспецифический индуктор регенерации [2], или как способ введения (вектор) для генетических конструкций, а также средство доставки исправленного генома в мышечные волокна, после генной модификации ex vivo.

Спектр клеток в тканевой нише поперечно-полосатого мышечного волокна весьма широк, особенно когда ткань находится в состоянии реактивных изменений – после начала процесса деградации или после травмы [112, 113]. Среди клеточных элементов в этом тканевом регионе могут быть обнаружены: одноядерные клетки рабдомиогенной линии – гетерогенная линия миосателлитоцитов; клетки, мигрирующие с током крови; циркулирующие стволовые клетки – производные стромы костного мозга; интерстициальные клетки-предшественницы скелетной мышечной ткани; клетки-предшественницы, ассоциированные с сосудистой стенкой – «миогенные эндотелиальные клетки» – SK-34, перициты и др. [64, 113–115].

Опыт применения клеточной трансплантации как в доклинических, так и в клинических исследованиях, включал в себя эмпирические попытки стабилизировать процесс миодеградации без надлежащего теоретического обоснования – с использованием клеток немиогенной линии; клеток миогенной линии – аллогенных и аутогенных одноядерных предшественников мышечных волокон («миобластов» – в терминологии зарубежных исследователей), гетерогенного фетального клеточного материала [116].

Следовательно, клетки, применяемые для коррекции системного поражения мышечной ткани, должны обладать рядом свойств, включающих потенциальную возможность мигрировать через сосудистую стенку после системного введения; способность к рабдомиогенной дифференцировке или, как минимум к феномену слияния (fusion) с существующими мышечными волокнами. После генерации новых мышечных волокон последние должны вступать в закономерные взаимодействия с двигательными нервными окончаниями и формированием нервномышечных соединений с функциональными ацетилхолиновыми рецепторами [117].

А) Немиогенные клетки

Гемопоэтические клетки (гемопоэтические стволовые клетки, ГСК). Несмотря на то, что убедительных данных в пользу участия гемопоэтических клеток в эмбриональном и постнатальном рабдомиогистогенезе нет, часть исследований была выполнена с этим клеточным материалом, полученным как из костного мозга, так и из пуповинной крови. А.П. Киясов и соавт. в 1990 г., трансплантировав летально облученным мышам клеточную взвесь, полученную из скелетной мышечной ткани, установил феномен восстановления кроветворения у экспериментальных животных [118]. Эта находка позволила предположить, что среди одноядерных клеток мышечной тканевой ниши имеются клетки, обладающие или гемопоэтическими дифференцировочными потенциями или бипотентные клетки-спутники, способные при определенных условиях к кроветворению, что в дальнейшем было подтверждено экспериментами с радиационными химерами [120, 121], и к рабдомиогистогенезу.

В период 1998–1999 гг несколько научных групп показали, что местное введение неадгезивной фракции клеток костного мозга мышей доноров приводит к тому, что часть из них участвует в рабдомиогистогенезе [122, 123]. Однако это явление регистрируется с очень низкой частотой – до 1%. Аналогичная тенденция подтверждается и клинической практикой – при выполнении аллогенной трансплантации ребенку с сочетанным Х-сцепленным иммунодефицитом и миопатией Дюшенна через 13 лет среди ядер мышечных волокон обнаружены донорские в количестве 0,5–0,9% [123]. Анализ экспрессии дистрофина через 2,5 года после аллогенной трансплантации ГСК пуповинной крови показал, что без дополнительных лечебных мероприятий, обеспечивающих репопуляцию мышечной тканевой ниши или слияние с мышечными волокнами, данная методика неэффективна [124].

Исследование на большой группе пациентов с миодистрофией Дюшенна доказало, что у них среди циркулирующих клеток крови существенно повышен уровень CD133+CXCR4+CD34-, причем наблюдалась обратная корреляция с возрастом больного, а значит и степенью тяжести заболевания (декомпенсация) [125, 126]. Эта находка позволила предположить существенный вклад CD133+ популяции клеток, являющихся, как известно, чрезвычайно близкими к гемопоэтическим предшественникам, в тканевый гомеостаз мышцы и предложить проверить их эффективность в клинических исследованиях [127].

Б) «Условномиогенные» клетки

Одним из самых активно исследуемых направлений остается применение мультипотетных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК; стромальные клетки) для коррекции различных заболеваний, включая поражения скелетных мышц [114, 128]. Имеются данные экспериментов iv vitro о возможностях их дифференцировки в миогенном направлении [129].

Мезоангиобласты – относительно недавно описанный вид клеток мезодермального происхождения, который впервые был выделен как особая субпопуляция в парааортальных тканях у мышей [130]. Установлено, что они не только обладают рабдомиогенным дифференцировочным потенциалом, но и характеризуются свойством самоподдержания и клоногенности в культуре, экспрессируют Sca-1, Flk-1, CD34, Mif-5, M-кадгерин [131, 132]. Последнее обстоятельство сделало их одним из основных кандидатов для трансплантационного лечения миопатий. В экспериментах у животных показано, что после системных и местных трансплантаций они сливаются с мышечными волокнами, причем это явление описано даже для аллогенных генномодифицированных мезоангиобластов. Привнесение таким образом в мышечные волокна генетического материала дало возможность корригировать клинические проявления миодистрофии как у мелких лабораторных животных, так и у собак [133, 134]. Важно, что эти клетки могут быть выделены не только из тканей здоровых животных, но и из образцов с генетическими моделями миопатий, что делает возможным их использование для генетической коррекции с целью последующей трансплантации [134]. На мышах с моделью саркогликанопатии показано, что модифицированные лентивирусом мезоангиобласты, будучи введёнными интраартериально, обладают хомингом в мышечную ткань в состоянии деструкции и воспаления, способны интегрироваться в нее и после дифференцировки продуцировать полноценный саркогликан. Регулярные введения таких мезоангиобластов привело через 4 мес. к образованию до 50% положительных на саркогликан мышечных волокон [133]. Полученные результаты стали обоснованием начала соответствующего клинического исследования [136].

Небезосновательной представляется точка зрения о том, что мезоангиобласты на самом деле, по крайней мере у человека, тождественны перицитам3 [137]. Последние, как показано, склонны к рабдомиогенной дифференцировке in vivo в реактивно измененном микроокружении [137–139].

В) Миогенные клетки

В зарубежной научной литературе под термином «миобласты» подразумевают малодифференцированные коммитированные в рабдомиогенном направлении клетки-предшественницы, являющиеся в нативной ткани следующей ступенью дифференцировки после миосателлитоцитов. Впервые наличие последних могло быть предположено после знаменитых опытов А.Н. Студицкого (1953) по ортотопической пересадке гомогенизированных аутоэксплантатов скелетной мышечной ткани у птиц [140]. Дальнейшие исследования привели к формированию современных представлений о существовании в поперечно-полосатой скелетной мышечной ткани камбиального резерва, тесно ассоциированного с дефинитивными мышечными волокнами. Считается, что приоритет в описании миосателлитоцитов принадлежит А. Мауро (1961), который впервые описал эти клетки после электронномикроскопического изучения у амфибий между сарколеммой и базальной мембраной мышечного волокна; в дальнейшем эти клетки были подробно охарактеризованы как in vivo, так in vitro [113, 141, 142]. Поскольку давно показано их участие в репаративном процессе, были разработаны протоколы их выделения из мышечной ткани, в том числе с использованием селективных маркеров – Рах7 (помимо М-кадгерина, CD34, α7β1-интегрина, CXCR4, синдекана-3, -4), а также протоколы экспансии in vitro и обратной трансплантации [143, 144]. Следует отметить, что маркеры этих клеток у лабораторных животных и человека различаются, так для человеческих «миобластов» характерна экспрессия N-CAM [145–147]. Установлено, что после возвращения в тканевую нишу, они способны как включаться в рабдомиогистогенез, так и самоподдерживать свою популяцию [148, 149]. В экспериментах «миобласты» трансплантировали животным с генетическими моделями различных миопатий: МДД [150–152], дисферлинопатией [153] саркогликанопатией [154] др. На сегодняшний день не вызывает сомнений низкая эффективность трансплантационного лечения аллогенными или ауто«миобластами» без генетической модификации последних. Так, до 90% клеток при внутримышечном введении mdx-мышам погибает в первые 24 ч., около 5% остаются в покоящемся состоянии, и только оставшиеся 5% сливаются с мышечными волокнами, что может приводить к экспрессии дистрофина [155, 156]. Несмотря на весьма скромные результаты таких манипуляций в эксперименте, полученные результаты о потенциальной возможности хоминга и ортодоксальной дифференцировки стали обоснованием начала клинических исследований по применению этих клеток у пациентов с миодистрофиями. Однако и они в полной мере доказали, что свойства данного вида клеток, а именно их неспособность преодолевать сосудистую стенку при системном введении, низкая миграционная способность при внутримышечном введении, иммунногенность при аллогенном введении ограничивает их применение. «Стволовые клетки, полученные из мышц» (Muscle-Derived Stem Cells, MDSCs, интерстициальные стволовые клетки мышц) считаются менее дифференцированными клетками чем миосателлитоциты; они локализованы в межмышечной соединительной ткани – эндомизии [112, 114, 157, 158].

Впервые были описаны у мышей, показано, что они могут быть поддержаны in vitro с сохранением миогенного дифференцировочного потенциала не менее 30 пассажей. Указывается, что они выживают после местной и внутриартериальной трансплантаций, причем во втором случае способны мигрировать через сосудистую стенку в поврежденные мышцы, что в итоге приводит к экспрессии дистрофина в 12% волокон у mdx-мышей [159, 160]. В научной литературе имеются сведения об экспрессии ими недостаточно специфичных молекул-маркеров – CD34, Sca-1, что не позволяет достоверно убедиться в самом факте существования данной группы клеток. Часть специалистов закономерно относятся к ее существованию весьма скептически, указывая, что протоколы их выделения не обеспечивают должную чистоту эксперимента и не исключают попадания в культуру миосателлитоцитов, а, следовательно, и надежных данных об их потенциальной клинической пригодности нет [160, 161].

Миогенные клетки слизистой оболочки десны.

Мультипотентные клетки стромального ряда из тканей десны были выделены относительно недавно – в 2010 г. [162–165]. Вскоре был показан их миогенный дифференцировочный потенциал. Так, В.Л. Зорин и соавт. (2014) продемонстрировали на клеточном материале от доноров-добровольцев, что данная субпопуляция дифференцируется с образованием мышечных трубочек при культивировании в монослое с высокой плотностью в среде DMEM/F12 с 20% FBS после смены ее на DMEM с низким содержанием глюкозы и 2% лошадиной сыворотки [165]. Авторы установили, что такая индукция миогенной дифференцировки результативна не только на первом, но и пятом или десятом пассажах. Причем, эффективность дифференцировки при пассировании сохранялась – площадь занимаемая миотубами всегда составляла около 20%, причем мышечные трубочки экспрессировали MyoD1, скелетный миозин, скелетный актин. В последнем случае визуализировалась даже поперечная исчерченность. Дальнейшие исследования должны позволить точнее охарактеризовать иммунофенотипический профиль миогенных предшественников в десне, изучить их отличия от других популяций клеток-предшественниц, склонных к рабдомиогенной дифференцировке – в частности, перицитов, мезангиобластов и др., а также их потенциальную пригодность для целей клеточной или генно-клеточной терапии заболеваний мышечной системы.

Г) Клетки с индуцированной плюрипотентностью

Получение из плюрипотентных клеток, в частности, эмбриональных стволовых клеток, миогенных предшественников долгое время оставалось нерешенной задачей. Недавно показана такая возможность, причем полученные in vitro Pax7+миосателлитоподобные клетки были способны выживать после пересадки в мышцах mdx-мышей и участвовать в гистогенетических процессах [166]. Однако этические проблемы, неизбежно возникающие при трансляции этой методики в клинику, и иммунологический барьер обусловили бурное развитие другой технологии – использования индуцированных плюрипотентных клеток.

Как известно, технология получения клеток с индуцированной плюрипотентностью была разработана Синья Яманака (2006–2008) и обеспечила получение клоногенных клеток с дифференцировочным потенциалом, близким к таковому у эмбриональных стволовых клеток, что позволило при создании новых лечебных стратегий, основанных на клеточной трансплантации, переориентироваться с использования эмбриональных стволовых клеток на iPS. Именно iPS стали рассматриваться как наиболее удобный кандидат для получения пациентспецифичных линий клеток.

В отношении лечения генетических заболеваний мышечной системы они также чрезвычайно привлекательны в связи с тем, что могут быть подвергнуты генетической коррекции ex vivo и после этого пересажены пациенту-донору без опасности развития иммунных осложнений. Кроме того, имея широкий дифференцировочный потенциал, они могут быть после исправления мутации искусственно коммитированы по рабдомиогенному пути дифференцировки, в частности через индукцию Pax7 [167]. Более того, после трансплантации иммунодефицитным животным с моделью миопатии Дюшенна они интегрировались с мышечными волокнами, что приводило к частичной остановке процесса деградации волокон и функциональному восстановлению мышц [168]. Другим примером экспериментальной отработки данной технологии стала коррекция дефекта в гене дистрофина при помощи двойного нокаута и трансфекции iPS геном утрофина [169]. Сходный опыт был выполнен научной группой F.S. Tedesco (2012) получившей клетки подобные мезоангиобластам из iPS у пациентов с саркогликанопатией. Пересадка клеток в мышечную ткань соответствующих нокаутных мышей привела к рабдомиоцитарной дифференцировке трансплантированных клеток и выработке необходимого белка [170].

Кроме описанных популяций клеток, имеющих по мнению исследователей потенциал участия в рабдомиогистогенезе, выделяют также несколько минорных клеточных групп: Sk-34 «миоэндотелиальные прогениторные клетки», миогенные эндотелиальные клетки (MECs), адвентициальные клетки (ACs) и др. [112, 114].

Таким образом, к сегодняшнему дню накоплены данные, позволяющие заключить, что трансплантация аллогенных и, вероятно, аутогенных «миобластов» после генетической коррекции вне организма является неэффективной процедурой для пациентов с системным поражением мышечной системы. Судя по всему наиболее «удобными» клетками для системного введения, в том числе после генетической коррекции ex vivo, являются мезоангиобласты, либо иные виды клеток, у которых удастся подтвердить свойства дифференцировки по рабдомиогенному пути, способность преодолевать сосудистую стенку и возможность слияния с существующими мышечными волокнами.

Миостатин (семейство костных морфогенетических белков, надсемейство трансформирующих факторов роста) – белок, подавляющий рабдомиогистогенез; вырабатывается непосредственно мышечной тканью, а опосредует свое действие через связывание с мембранным рецептором ACVR2B (activin type II receptor). Мутации в гене MSTN, кодирующем миостатин, приводят к развитию миопатии с гипертрофией и гиперплазией скелетной мышечной ткани [171]; мальчик-гомозигота с такой патологией описан в 2004 г. в Германии [172]. Также врачи не исключают возможности мутации в гене рецептора к миостатину, имеющей похожие фенотипические проявления.

Известно, что при нокауте гена MSTN животные развиваются нормально, их вес при рождении несколько меньше среднего, но к моменту полового созревания они вдвое превосходят по массе особи дикого типа, что установлено при изучении лабораторных грызунов, гончих собак, коров и овец [173]. Помимо изменений мышечной массы и структуры скелетных мышц (превалируют быстрые волокна, медленных почти нет) у нокаутных по миостатину животных повышается содержание инсулиноподобного гормона роста (IGF-1). Физиологическая функция самого IGF-1 заключается в дополнительном анаболическом эффекте.

Биофармацевтические стратегии использования эффектов ингибирования миостатина востребованы не только для поддержания регенерации мышечной ткани у больных с миодистрофиями, но прежде всего для коррекции раковой кахексии, саркопении и др. Эти технологии связаны с воспроизводством нейтрализующих моноклональных антител как к самому миостатину (молекула MYO-029), так и к его рецептору (молекула BYM338), а также создание растворимых рецепторов к миостатину (молекула ACE-031). В экспериментах с mdx-мышами антитела к миостатину приводили к 30% увеличению мышечной массы за 3 мес. [174]. Сопоставимую эффективность в эксперименте показал и ACE-031 даже у здоровых животных [175]. Полученные данные позволили перевести исследования в клинику, где, однако не была подтверждена эффективность данного метода у больных с миодистрофией Дюшенна [176]. Применение аденоассоциированного вируса для трансфера гена, ингибирующего миостатин пропептида у мышей с моделью саркогликанопатии и кальпаинопатии, показало неэффективность методики в первом случае и увеличение мышечной массы, силы мышц и улучшение гистологического строения мышц во втором [177].

Использование естественного антагониста миостатина – фоллистатина показало хороший эффект в эксперименте (молекула SF-344). Так, гиперэкспрессия фоллистатина, обеспеченная нокаутом гена миостатина, плазмидным генным трансфером с электропорацией, или трансфекцией при помощи ААВ приводила к увеличению мышечной массы, активации репаративного рабдомиогистогенеза, а также выживанию трансплантированных миобластов у mdx-мышей [178–181]. Эффективность однократного курса при использовании местного генного трансфера с помощью ААВ сохранялась до 2 лет [182]. Двойной генный трансфер с введением генов минидистрофина и фоллистатина за счет воздействия на разные звенья патоморфогенеза болезни позволяет добиться более выраженных результатов [183]. Вместе с тем, высказывается суждение об опасности такой терапии в связи с преждевременным истощением пула миогенных клеток-предшественниц и лавинообразным течением болезни после периода некоторого благополучия.

Кроме перечисленных способов коррекции миодистрофического фенотипа скелетной мышечной ткани, исследователи разрабатывают и ряд других, которые представляются на сегодняшний день менее перспективными и имеют скорее вспомогательное значение [2]: применение инсулиноподобного фактора роста; средств снижающих фиброз – TGFb; ингибиторов активных форм кислорода и перекисного окисления липидов – ингибиторов NF-κB; средств, улучшающих кровоснабжение мышц, включая индукторы NO и NOS, VEGF (Vascular endothelial growth factor, эндотелиального сосудистого фактора роста) и др. [176, 184].

3. Клинические исследования

Количество потенциальных лечебных агентов генной и клеточной терапии, покинувших стены лаборатории и перешедших на этап клинических исследований, весьма невелико. Такое положение дел связано с несколькими причинами. С одной стороны значимые успехи экспериментальной генной терапии и коррекции генома – достояние последнего десятилетия, их отличает технологическая сложность, особенно с учетом особенностей мышечной ткани. С другой – генетические заболевания мышечной системы относятся к категории орфанных, разработка способов лечения которых, как правило, без серьезной поддержки государства невозможна ввиду узости в понимании фармкомпаниями потенциального рынка.

Объем зарегистрированных клинических исследований генной и клеточной терапии исчисляется не более чем тремя десятками; причем 2/3 из них уже прекращены. Наиболее значимые из них приведены в табл. 3. Все исследования относятся к 1 и, в самом оптимистическом случае – к 2 фазе исследований (без учета исследования малых молекул и антисмысловых олигонуклеотидов для экзон-скиппинга). Исходя из этого, врачи в качестве ожидаемых результатов применения данных лечебных средств испытывают пока весьма скромные ожидания и определяют мягкие критерии эффективности. В исследованиях оцениваются: выживание пересаженных популяций клеток, гистологические изменения обработанной мышечной ткани, сила сокращения отдельных единичных мышц, результаты адаптированного теста 6-минутный ходьбы и т.п. Иными словами, даже при экспериментальном лечении такого грозного заболевания как МДД, жесткие критерии эффективности в виде увеличения продолжительности жизни и т.п. пока не выдвигаются; статус создаваемых технологий пока не предполагает даже формулировать задачу на излечение от данных болезней.

Анализ результатов применения клеточной терапии во всех ее вариантах показывает незначительную эффективность вне зависимости от типа использованных клеток и пути их введения. Считается, что пионером клеточной терапии мышечных дистрофий был Питер Лоу (Peter Low), который в 1990 г. осуществил трансплантацию миосателлитоцитов 9-летнему мальчику с миодистрофией Дюшенна, доказав тем самым безопасность и техническую выполнимость методики [185]. Это послужило толчком к началу нескольких клинических исследований по программе I фазы, в которых предусматривалось местное введение миосателлитоцитов («миобластов») в режиме «лечение 1 мышцы» пациентам с миодистрофией Дюшенна. Все исследования оказались безопасными для пациента, в большинстве из них были получены признаки некоторого улучшения сократительной способности мышцы (у 15% пациентов), но клинически значимых сдвигов в состоянии здоровья пациентов отмечено не было нигде. Этот результат следует признать вполне закономерным, в связи с тем, что местная трансплантация не может решить проблему системного заболевания; кроме того, после введения клетки подвергались быстрой массированной гибели (в течение 72 ч.), также были зафиксированы и иммунологические реакции на введенные клетки, даже в тех случаях, где имелась HLAтождественность клеточного препарата [186]. В клинических исследования первой волны, как правило, включали от 3 до 21 пациентов со средним возрастом около 10 лет. Чаще всего количество вводимых аллогенных культивированных «миобластов» составляло около 100 млн, хотя в одном из исследований P. Low (1992) фигурирует цифра 5 млрд. Важно отметить, что введение клеток всегда осуществлялось на фоне базовой терапии иммунодепрессантами – циклоспорином, циклофосфамидом, что могло влиять в т.ч. на выживаемость клеток.

Полученный опыт позволил заключить, что подобная техника вполне осуществима и безопасна, однако приводит к низкой выживаемости пересаженных клеток, низкой экспрессии дистрофина и небольшому изменению силы одной единственной мышцы. В связи с этим в протоколах нового поколения предусмотрен ряд общих корректировок. В первую очередь они связаны с методикой введения – не менее 30 млн аллогенных «миобластов» на 1 см3 мышечной ткани через 25–100 отдельных вколов (инъекции высокой плотности, «high-density injections») на фоне применения иммуносупрессии (Такролимус, FK506) [187]. Использование такой методики по мнению авторов дает возможность повысить количество химерных мышечных волокон, вырабатывающих дистрофин. Позволим себе выразить скепсис по отношению к разрабатываемой методике, поскольку вполне очевидно, что «лечение одной мышцы» не в состояние повлиять на продолжительность жизни и даже ее качество у пациентов с МДД, в связи с этим, и этический аспект таких протоколов небесспорен. В том числе и в связи с этим существенное внимание сосредоточено на методиках системного введения других клеток; мезоангиобластов, CD133+ и др.

Первое клиническое исследование по применению мезоангиобластов проводится в Европе по программе 1–2 фазы [136]. Несмотря на то, что доклиническая проработка использования других клеток существенно уступает перечисленным, в клинике апробируются и они (табл. 3), в частности различные предшественники клеток стромального ряда. В качестве единичных кейсов имеются описания применение ядросодержащих клеток пуповинной крови после иммуноабляции; в таких случаях показана активация выработки дистрофина [227].

Параллельно клеточной терапии успешно развиваются подходы, связанные с воздействием на первопричину заболевания, тем более, что генотерапевтический препарат может изготавливаться и применяться подобно обычным лекарственным средствам, не нуждающимся в сложной производственной и клинической инфраструктуре. Среди всех вариантов генной терапии наиболее отвечает особенностям заболевания применение терапевтических конструкций на основе ААВ. Однако в клинической практике опробованы и другие методы. Так, в частности, проверена безопасность и тенденции эффективности плазмидной доставки гена дистрофина при внутримышечных инъекциях [228, 229]. Доказана безопасность данного метода и иммунологическое безразличие организма к трансгену, однако с точки зрения эффективности плазмидные векторы остаются малоэффективными. Тем не менее, было показано, что через три недели до 6% мышечных волокон в месте введения вырабатывали дистрофин, и до 26% делали это частично. К сожалению, о стойкости достигнутых эффектов не сообщается. Существенным фактом, ограничивающим этот подход является теоретически малая полезность системного введения плазмиды, ввиду ее нестойкости в крови и большого размера релаксированной молекулы, что резко снизит эффективность проникновения внутриклеточно.

Вместе с тем, имеется понимание того, что эффективно доставить в большие объемы мышечной ткани вирусную генную конструкцию пока не представляется возможным вследствие большой вирусной нагрузки. В связи с этим, а также в связи с совершенствованием техники коррекции генов все больше внимания уделяется потенциальной возможности генно-клеточной терапии, при которой в качестве клеточного компонента используются или аутогенные клетки, способные к эффективному слиянию с волокнами поперечно-полосатой мышечной ткани, или пациентспецифические клетки с индуцированной плюрипотентностью, позволяющие после коррекции мутации индуцировать направленный рабдомиогистогенез (рис. 5).

Существенные надежды дает метод пропуска экзонов, однако нужно понимать, что для каждого экзона в том или ином гене необходимо создать собственный антисмысловой олигонуклеотид и провести с ним весь многолетний комплекс исследований как с кандидатом в активные вещества лекарственного средства. Для примера, в 12% случаев миодистрофия Дюшенна обусловлена мутациями в 51 экзоне; кроме этого выявлены еще 2–3 экзона, близкие по частоте локализации мутаций. Таким образом разработка антисмысловых нуклетотидов для остальных 80 экзонов становится экономически непосильной. Для ряда других генов наиболее частые мутации отсутствуют, они равновероятно распределены по всему гену. Это означает, что данная технология оказывается бесполезной для большого числа пациентов, и лечебная стратегия в отношении них неизбежно будет базироваться на создании персонифицированных, не требующих иммуносупрессивной терапии, генно-клеточных препаратов, в которых генная коррекция может быть достигнута плазмидными или вирусными векторами, либо современными молекулярными инструментами коррекции генома.

Таким образом, несмотря на большой объем проделанной в мире работы, существенного прогресса на пути радикального лечения наследственных заболеваний мышечной системы пока нет. Вместе с тем, созданы и в большом числе случаев отработаны прототипы технологий, способных изменить ситуацию. Наиболее перспективными в этом плане представляются способы вирусного трансфера на платформе ААВ, методики экзон-скиппинга и коррекции генов с клеточной формой доставки исправленного генома в мышечные волокна.

Подняться вверх сайта