Поиск Кабинет

Генно-клеточная терапия бокового амиотрофического склероза мононуклеарными клетками пуповинной крови человека, сверхэкспрессирующими гены нейронной молекулы адгезии Llcam и сосудистого эндотелиального фактора роста vegf

Гены & Клетки: Том V, №4, 2010 год, стр.: 55-65

 

Авторы

Ризванов АА, Гусева Д.С., Салафутдинов И.И., Кудряшова Н.В., Шафигуллина А.К., Баширов Ф.В., Газизов И.М., Калигин М.С., Мухамедьяров М.А., Киясов А.П., Исламов Р.Р.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Трансплантацию генетически модифицированных клеток (стволовых, предшественниц, дифференцированных) активно исследуют как способ доставки ростовых факторов и молекул адгезии в поврежденную нервную ткань для поддержания жизнеспособности нейронов, обеспечения регенерации нервных отростков и восстановления утраченных межклеточных контактов. В настоящем исследовании для лечения бокового амиотрофического склероза на модели трансгенных мышей G93A мы сконструировали плазмидный вектор pBud-VEGF-L1 САМ, одновременно экспрессирующий молекулы сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и нейронной молекулы адгезии L1 (L1CAM). Для доставки вектора в спинной мозг мышей использовали мононуклеар-ные клетки пуповинной крови человека. Трансплантация генетически модифицированных клеток, трансфицированных плазмидными векторами pBud-VEGF-L1 САМ, pBud-VEGF-EGFP и pBud-EGFP-L 7 САМ, выполнена путём инъекции (1x10е клеток) в ретроорбитальное пространство мышей. Через две недели после трансплантации для идентификации и феноти-пирования генетически модифицированных мононуклеарных клеток проводили двойное иммунофлуоресцентное окрашивание срезов спинного мозга мышей с помощью антител к ядерному антигену человека (HNA) и одному из клеточных маркёров (эндотелиоцитов — CD34, астроцитов — S100, оли-годендроцитов — OSP, микроглии — IbaD. При исследовании гистологических срезов спинного мозга мы обнаружили HNA+CD34+-клетки как в белом, так и в сером веществе во всех экспериментальных группах. Маркёры макро- и микроглии в HNA +-клетках не выявлены. Таким образом, сверхэкспрессия генов VEGF и/или L1CAM в монононукле-арных клетках пуповинной крови человека не влияет на их способность дифференцироваться в эндотелиоциты в спинном мозге трансгенных мышей G93A. Целесообразность генетической модификации мононуклеарных клеток пуповинной крови геном молекулы адгезии L1cam подтверждена повышенной жизнеспособностью трансплантированных клеток, а геном сосудистого эндотелиального фактора роста vegf — поддержанием дифференцировки эндотелиоцитов и нейро-протекторным действием на повреждённые нейроны.

Введение

Генная терапия нейродегенеративных заболеваний, обусловленных наследственными или приобретёнными генными мутациями, a priori основана на патогенезе заболевания. Прямая генная терапия или генно-клеточная терапия (трансплантация генетически модифицированных клеток) нацелены на коррекцию функции мутированного гена с помощью соответствующего клонированного терапевтического гена. Другим важным направлением генной терапии в невропатологии является увеличение уровня экспрессии генов, кодирующих нейротрофические факторы, факторы роста и молекулы адгезии, поддерживающих выживание нервных клеток и стимулирующих нейрорегенерацию.

Боковой амиотрофический склероз принадлежит к группе нейродегенеративных заболеваний с прогрессирующей гибелью двигательных нейронов головного и спинного мозга. Этиология и патогенез гибели нейронов при наиболее частой (спорадической) форме заболевания не известны, но часть случаев семейной формы заболевания обусловлена доминантными мутациями гена sod1 (21q22.1^q22.2), кодирующего Cu/Zn—супероксиддисмутазу[1]. Значительный прогресс в понимании патогенеза и методов лечения заболевания был получен в экспериментах на трансгенных мышах G93A, экспрессирующих мутированный ген sod1 человека. У таких мышей развивается прогрессирующая дегенерация двигательных нейронов (как и при семейной форме бокового амиотрофического склероза у человека)[2—4]. Поддержание жизни нейронов, вовлеченных в патологический процесс, и восстановление утраченных межклеточных связей в нейронных сетях с помощью нейротрофических факторов, факторов роста и молекул адгезии могут существенно повысить качество и продолжительность жизни больных. В этой связи одним из перспективных методов лечения бокового амиотрофического склероза считается генная терапия или сочетание генной и клеточной терапии — трансплантация генетически модифицированных клеток, сверхэкспрессирующих факторы для поддержания выживания нейронов.

В этом отношении сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) обоснованно считается одним из наиболее перспективных нейротрофических факторов. Линия мышей Vegf>h>, у которых в промоторе гена vegf отсутствует чувствительный элемент к фактору гипоксии (HIF-1—)[5—6], характеризуется прогрессирующей дегенерацией мотонейронов, напоминающей таковую при боковом амиотрофическом склерозе. У трансгенных мышей G93A, экспрессирующих мутантный ген супероксиддисмутазы sod1 (при мутации гена развивается наследственная форма бокового амиотрофического склероза), показана ослабленная индуцированная гипоксией экспрессия гена vegf[7]. При скрещивании Vegf>h> и мышей G93A полученное потомство погибает в раннем возрасте в результате выраженной дегенерации мотонейронов[6]. In vitro VEGF способствует выживанию мотонейронов, экспрессирующих мутантный ген sod1[8]. Однократная инъекция мышам G93A лентивирусного вектора, экспрессирующего ген vegf, позволяла отсрочить начало заболевания и увеличивала продолжительность жизни мышей[9]. В клинической же практике применение лентивирусного вектора имеет ограничения, связанные с его выраженными иммуногенными и онкогенными свойствами[10]. Более безопасными для генной терапии считают плазмидные векторы.

Доставка в организм терапевтического гена с помощью плазмидного вектора осуществляется путем инъекции и/или путем трансплантации клеток, трансфицированных плазмидным вектором. Последний способ генно-клеточной терапии более эффективен, поскольку позволяет контролировать уровень экспрессии терапевтического гена в клетках. Трансфекция клеток двухкассетными плазмидными векторами позволяет одновременную экспрессию двух терапевтических генов.

Ранее нами была выдвинута гипотеза, что эффективность доставки терапевтического гена в нервную ткань можно увеличить путём трансфекции клеток двухкассетными плазмидными векторами, экспрессирующими терапевтический ген VEGF и нейронную молекулу адгезии Исат. Можно предположить, что одновременная сверхэкспрессия генов нейропротектор-ного фактора и нейронной молекулы адгезии в моно-нуклеарных клетках пуповинной крови позволит облегчить миграцию генетически модифицированных клеток через гематоэнцефалический барьер, повысить выживаемость клеток и увеличить продолжительность действия нейротрофического фактора на клетки-мишени. Таким образом, создание двухкассетного плазмидного вектора, экспрессирующего терапевтический ген и тканеспецифичную молекулу адгезии, представляет собой перспективное направление генной терапии. Модифицирование трансплантируемых клеток двухкассетными плазмидными векторами позволит получить более выраженный ней-ропротекторный эффект, однако неизвестно, как трансфицированные гены могут повлиять на фенотип мононуклеарных клеток.

В настоящем исследовании для лечения бокового амиотрофического склероза у трансгенных мышей G93A нами был сконструирован плазмидный вектор pBud-VEGF-L1 САМ, одновременно экспрессирующий vegf и Исат. Для доставки плазмидного вектора в спинной мозг мышей были использованы мононук-леарные клетки пуповинной крови человека. Имму-нофлуоресцентным методом были изучены хоуминг, выживание и фенотипические характеристики трансплантированных клеток.

Материал и методы

Создание экспрессионных плазмидных векторов

Клонирование гена vegf (изоформа 165) человека и создание экспрессионного плазмидного вектора pBud-VEGF-EGFP описано в предыдущей работе[11]. Специфические праймеры для ПЦР-амплификации полной открытой рамки считывания гена Исат созданы на основе нуклеотидных последовательностей, полученных из базы данных GenBank (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) (табл. 1). Концы праймеров содержат адаптерные участки с уникальными сайтами рестрикции для Hindlll и Xbal, по которым проводили клонирование генов в экспрессионный плазмидный вектор pcDNA 3.1 + (Invitrogen). Клонирование проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). В качестве матрицы для ПЦР-амплификации использовали плазмиду pcDNA3-hL1 А-4А (Addgene, plasmid 13268)[12]. Ко-экспрессирующие векторы собраны на основе pBudCE4.1 (Invitrogen) путём субклонирования кДНК гена Исат (под контролем промотора CMV) по сайтам рестрикции Hind\\\ и ХЬа\ в полученные ранее плазмидные конструкции pBud-VEGF или pBud-EGFP, содержащие гены vegf или egfp соответственно (под контролем промотора EF-1 —). Конечное подтверждение получения экспрессионных плазмид pBud-VEGF-L1 САМ и pBud-EGFP-L1 САМ провели методом ДНК-секвенирования с помощью стандартных вектор-специфичных и L1 САМ-специфичных праймеров на автоматическом секвенаторе ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

Выделение и трансфекция мононуклеарных клеток

пуповинной крови человека

Заготовку пуповинной крови человека проводили после получения информированного согласия у беременной и после тщательного дородового скрининга на наличие противопоказаний к донорству пуповинных клеток. Пуповинную кровь забирал специально обученный персонал роддома по инструкции Банка стволовых клеток Казанского государственного медицинского университета. Сразу после рождения ребёнка и отсечения пуповины кровь собирали в стандартную систему для взятия донорской крови (контейнеры пластиковые обыкновенные CPDA-1 250 GG, Terumo). Пуповинную кровь в изотермическом контейнере в течение 12ч после забора доставляли в Банк стволовых клеток, где из неё выделяли моно-нуклеарную фракцию с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла[13].

Мононуклеарные клетки пуповинной крови человека после выделения ресуспензировали в среде RPMI 1640 (Sigma), смешивали с очищенной плазмидной ДНК и подвергали воздействию электрического импульса (300V, ЮОО/uF) на приборе Gene Pulser Xcell Total System (BioRad, США) в фирменных кюветах с зазором электродов 0,4 см. После воздействия электрического импульса клетки переносили в лунку культурального планшета и добавляли 400 мкл среды RPMI 1640, содержащей эмбриональную телячью сыворотку (Sigma) в конечной концентрации 10%. Клетки восстанавливали в течение 10—12 ч в инкубаторе при 37°С, во влажной атмосфере, содержащей 5% С02.

Анализ экспрессии мРНК генов vegf и L1 cam

Общую РНК из клеточных осадков выделяли с помощью набора High Pure RNA Isolation Kit (Roche), согласно инструкции фирмы-производителя. Синтез кДНК осуществляли с помощью набора Omniscript Reverse Transcriptase Kit (Qiagen). Для количественной оценки экспрессии генов-мишеней применяли ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) по технологии TaqMan. Поиск комбинаций праймеров и проб для ПЦР-РВ проводили с помощью программного пакета PrimerExpress (Applied Biosystems, США) на основании нуклеотидных последовательностей генов-мишеней, полученных из базы данных GeneBank.

Пробы для ПЦР-РВ содержали 5'-концевую флуоресцентную метку FAM и З'-концевой гаситель RTQ-1. Синтез праймеров и проб осуществляла фирма Синтол (г. Москва) (табл. 2). В качестве контроля количества наносимого образца применяли комбинации праймеров, специфичных к гену р-актина человека. Для ПЦР-РВ по технологии TaqMan применяли «Реакционную смесь 2,5х для проведения ПЦР-РВ» (Синтол, Москва) в соответствии с инструкциями производителя.

ПЦР-РВ проводили на приборе iQ5 Multicolor RealTime PCR Detection system (BioRad, США). Количественный анализ уровня экспрессии осуществляли с помощью стандартной прямой, построенной на основе серийного разведения кДНК клеток пуповинной крови, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-L1CAM. Реакции ПЦР-РВ выполняли в дубликатах. Статистический анализ проводили методом t-критерия Стьюдента в программе Excel 2002.

Трансгенные мыши G93A

Трансгенные мыши B6SJL-Tg(SOD1-G93A)dl1Gur/J, экспрессирующие мутантный ген человека — Cu/Zn-супероксиддисмутазу sod1 (Gly93—>Ala; глицин замещён на аланин в позиции 93), приобретены из питомника лабораторных животных «Пущино» при филиале института биоорганической химии им. академика М.М. Шемякина и академика Ю.А. Овчинникова РАН (филиал ИБХ РАН). В виварии Казанского государственного медицинского университета половозрелых мышей G93A содержали в стандартных лабораторных условиях. В возрасте 24—28 нед. самцы и самки были разделены на три группы по 3^4 мыши для трансплантации генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, трансфицированных плазмидными векторами (1) pBud-VEGF-LICAM, (2) pBud-VEGF-EGFP и (3) pBud-EGFP-L1CAM. Трансплантацию выполняли путём инъекции 1x108 генетически модифицированных клеток в ретроорбитальное пространство мышей G93A. Через 2 нед. после трансплантации животных наркотизировали, через большой круг кровообращения транскардиально перфузировали сначала холодным фосфатносолевым буфером (ФС) буфере (рН = 7,4), затем — холодным 4% раствором параформальдегида (рН = 7,4). Спинной мозг извлекали из позвоночного столба, постфиксировали в растворе параформальдегида в течение 4 ч на ротационном столике. В целях криопротекции фиксированную ткань насыщали 30% раствором сахарозы на ФС буфере (pH = 7,4).

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Для приготовления криостатных срезов сегменты спинного мозга помещали в заливочную среду TBS (Triangle Biomedical Science, Durham, NC) и замораживали в течение 2 минут в 2-метил-бутане (изопентан), предварительно охлаждённом до -30°С. Серийные продольные срезы толщиной 20 мкм монтировали на предметные стёкла SuperFrostOPIus, подсушивали не менее одного часа при комнатной температуре и подвергали двойному иммунофлуоресцентному окрашиванию. С целью оптимизации связывания антител с антигенами срезы обрабатывали 0,01 М раствором цитрата натрия (pH 9,0) при 70°С на водяной бане в течение 30 мин[14]. После охлаждения срезов до комнатной температуры и промывки в ФС буфере, блокировали неспецифические места связывания в ФС буфере, содержащем 0,2% Тритон Х-100, 0,02% азид натрия и 5% сыворотку осла, в течение 1 ч при комнатной температуре. Для идентификации антигена (АГ) срезы инкубировали с первичными антителами (АТ) (табл. 3) в течение 3 сут. при 4°С, промывали в ФС буфере, и затем инкубировали со вторичными АТ осла, конъюгированными с флуоресцентными красителями Alexa 594 или Dy Light 649 (разведение 1:200), в течение 2 ч при комнатной температуре. Для визуализации клеточных ядер срезы дополнительно окрашивали в течение 20 мин при комнатной температуре раствором бис-бензимида (краситель Hoechst 33258, 5 мкг/мл в ФС буфере, Sigma). Окрашенные срезы заключали в среду, поддерживающую флуоресценцию, и изучали при помощи лазерного сканирующего микроскопа (Zeiss Axiovert 200М).

Для систематизации результатов иммунофлуорес-центного окрашивания номера рисунков с визуализированными АГ в каждой экспериментальной группе мышей помещены в таблицу 4.

Результаты исследования

Экспрессия egfp, vegf и L1 cam в трансфицированных мононуклеарных клетках пуповинной крови человека

Мононуклеарные клетки выделяли из свежей пуповинной крови человека с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла. Полученные клетки трансфицировали плазмидными векторами pBud-VEGF-L1 САМ, pBud-VEGF-EGFP и pBud-EGFP-L1CAM методом электропорации. Уровень мРНК в мононуклеарных клетках пуповинной крови человека определяли через 24 часа после трансфекции плазмидой pBud-VEGF-L1 САМ с помощью ПЦР-РВ (рис. 1). Результаты анализа показали, что уровень мРНК генов vegf и L1cam в трансфицированных клетках превысил уровень соответствующих мРНК в нетрансфи-цированных клетках в 197 и 5681 раз соответственно, что свидетельствует об эффективной экспрессии рекомбинантных генов в мононуклеарных клетках in vitro.

Анализ иммунофлуоресцентного окрашивания генетически модифицированных мононукпеарных клеток пуповинной крови человека в спинном мозге мышей G93A

Для идентификации и фенотипирования генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови человека было проведено двой- ное иммунофлуоресцентное окрашивание срезов спинного мозга мышей с помощью АТ к ядерному АГ человека (HNA) и АТ к одному из клеточных маркёров (эндотелиальных клеток — CD34, астроцитов — S100, олигодендроцитов — OSP и микроглии — Ibai). Исследование срезов спинного мозга выявило HNA-позитивные клетки как в белом, так и сером веществе спинного мозга во всех экспериментальных группах.

Фенотипирование мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, трансфицированных плазмидным вектором pBud-VEGF-L1 САМ, после 14 сут. трансплантации мышам G93A.

Согласно нашим предыдущим исследованиям[15], в спинном мозге данной подопытной группы мышей мы идентифицировали мононуклеарные клетки пуповинной крови человека, экспрессирующие маркёр эндотелиальных клеток (НЫА+С034+-клетки) (рис. 2A-D, A’-D’). Важно отметить, что часть HNA+-клеток не экспрессировала молекулу CD34 (НЫА+С034~-клетки). Такие клетки в большинстве случаев находились в непосредственной близости от мышиных Сй34+-клеток (рис. 2Е-Н, Е’-Н’). Все выявленные НЫА+-клетки не реагировали с АТ к маркёру микроглии 1Ьа1 (HNA+lbal^-клетки) (рис. 3), с АТ к маркёру олигодендроцитов OSP (HNA+OSP^-клет-ки) (рис. 4) и с АТ к белку S-100, который является маркёром астроцитов в центральной нервной системе (HNA+S-100_-клетки) (рис. 5).

Фенотипирование мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, трансфицированных плазмид-ным вектором pBud-VEGF-EGFP, после 14 сут. трансплантации мышам G93A.

Как и в предыдущей подопытной группе (трансплантация клеток трансфицированных плазмидным вектором pBud-VEGF-L1 САМ) в спинном мозге мышей были обнаружены мононуклеарные клетки пуповинной крови человека, экспрессирующие маркёр эндотелиальных клеток молекулу CD34 (рис. 6А-Н, А’—Н’). Рядом с Н1МА+С034+-клетками часто присутствуют С034-негативные мононуклеарные клетки человека (Н1МА+С034~-клетки) (рис. 6I-L, Г-Н’). При иммунофлуоресцентном окрашивании срезов спинного мозга мышей с АТ к маркёру клеток микроглии 1Ьа1 мы не зарегистрировали 1Ьа1-позитивных мононуклеарных клеток пуповинной крови человека (Н1\1А+1Ьа1~-клетки). Н1\1А+1Ьа1~-клетки находились в тесном контакте с 1Ьа1-позитивными микроглиаль-ными клетками мыши (рис. 7А-В, A’-D’) или были расположены обособленно от них (рис. 7Е-Н, Е‘-Н’).

Аналогичный результат мы получили, анализируя срезы мозга, окрашенные с АТ к маркёрам астроци-тов. Мы не зарегистрировали ни OSP-, ни S-100-по-зитивных мононуклеарных клеток пуповинной крови человека. Часть HNA+OSP^-клеток и HNA+S-10Ch-клеток располагалась вблизи олигодендроцитов и астроцитов мыши (рис. 8—9).

Фенотипирование мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, трансфицированных плазмидным вектором pBud-EGFP-L1 САМ, после 14 сут. трансплантации мышам G93A.

В результате двойного иммунофлуоресцентного окрашивания в спинном мозге мышей были обнаружены мононуклеарные клетки пуповинной крови человека, экспрессирующие маркёр эндотелиальных клеток — молекулу CD34 (рис. 10А-В, A’-D’). При этом, как и в двух предыдущих экспериментальных группах животных, в данной подопытной группе мышей среди Н1МА+-клеток не выявлены клетки, экспрессирующие маркёры клеток макро- (OSP и S-100) или микроглии (1Ьа1) (рис. 11—13).

Обсуждение

Ранее нами была выдвинута гипотеза, что генетически модифицированные стволовые клетки пуповинной крови человека, трансфицированные плазмидным вектором, одновременно экспрессирующим клонированные нейронную молекулу адгезии L1 САМ и сосудистый эндотелиальный фактор роста VEGF, значительно усилят терапевтический эффект стволовых клеток пуповинной крови у трансгенных мышей G93A с фенотипом бокового амиотрофического склероза[16-17]. Такая генетическая модификация стволовых клеток пуповинной крови может быть полезна в трёх аспектах. Во-первых, для повышения жизнеспособности трансплантированных клеток в тканях реципиента. Во-вторых, для доставки специфических ростовых и трофических факторов в область поражённых нейронов. В-третьих, для направленной дифференцировки трансплантированных клеток в разные паренхиматозные клетки ЦНС[астроциты, макрофаги, эндотелиальные клетки). Важно заметить, что мононуклеарные клетки пуповинной крови способны проникать через гематоэнцефалический барьер, а сигнальные молекулы, секретируемые погибающими нервными клетками, могут усиливать хоуминг мононуклеаров в ЦНС.

В наших предыдущих исследованиях мононуклеарные клетки пуповинной крови человека, трансфицированные плазмидными векторами pcDNA-hVEGF и pcDNA-mL1 САМ, после трансплантации мышам G93A были обнаружены в сосудах спинного мозга. Трансплантированные клетки экспрессировали ядерный АГ человека и маркёр эндотелиальных клеток CD34. Другими словами, мононуклеарные клетки пуповинной крови человека, сверхэкспрессирующие VEGF человека и нейронную молекулу адгезии L1 мыши, в спинном мозге мышей G93A дифференцировались в эндотелиальные клетки[15].

В настоящем исследовании для генетической модификации мононуклеарных клеток пуповинной крови человека были применены двухкассетные плазмид-ные векторы pBud-VEGF-L1 САМ, pBud-VEGF-EGFP и pBud-EGFP-L1 САМ. Для идентификации и фенотипи-рования клеток было применён метод двойного им-мунофлуоресцентного окрашивания с АТ к ядерному АГ человека и маркёров эндотелиальных клеток (CD34), астроцитов (S100), олигодендроцитов (OSP) и клеток микроглии (1Ьа1). Через две недели после трансплантации во всех сериях эксперимента в спинном мозге мышей G93A были обнаружены генетически модифицированные мононуклеарные клетки пуповинной крови человека. Трансплантированные клетки экспрессировали маркёр эндотелиальных клеток — молекулу CD34, но не экспрессировали маркёры клеток макро- и микроглии ЦНС. Из полученных в данном исследовании результатов следует, что диф-ференцировка мононуклеарных клеток пуповинной крови человека в эндотелиальные клетки происходит независимо от сверхэкспрессии клетками сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF и нейронной молекулы адгезии L1CAM. При этом ранее нами было установлено, что естественные мононуклеарные клетки пуповинной крови человека (без генетической модификации) также способны к дифференцировке в эндотелиальные клетки, что подтверждает известный факт присутствия в пуповинной крови предшественников эндотелиальных клеток[16-17]. Таким образом, сверхэкспрессия VEGF и/или L1CAM в монононукле-арных клетках пуповинной крови человека не влияет на их дифференцировку в эндотелиальные клетки в спинном мозге мышей G93A. Целесообразность генетической модификации мононуклеарных клеток пуповинной крови человека геном нейронной молекулы адгезии L1 подтверждается повышенной жизнеспособностью трансплантированных клеток[15], а геном сосудистого эндотелиального фактора роста vegf— поддержанием дифференцировки эндотелиальных клеток и его нейропротекторным действием на повреждённые нейроны.

Работа частично профинансирована грантами: РФФИ № 08-04-01680 и №10-04-01423, ФЦП ГК № 02.740.11.0302, Фонда содействия развития малых форм предприятий в научно-технической сфере ГК № 7858р/10398, Президента РФ «Ведущая научная школа» НШ-64631.2010.7. Работа А.А. Ризванова финансировалась реинтеграционным грантом НАТО NR.RIG.983007. Работа частично выполнена на оборудовании Регионального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов (РЦКП ФХИ) Казанского (Приволжского) федерального университета. Авторы выражают благодарность проф. Р.И. Жданову (КФУ) за помощь в подготовке экспериментов.

Подняться вверх сайта