Поиск Кабинет

Генная и клеточная терапия нейродегенеративных заболеваний

Гены & Клетки: Том II, №3, 2007 год, стр.: 29-39

 

Авторы

Исламов Р.Р., Ризванов А.А., Гусева Д.С., Киясов А.П.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Эффективных методов лечения нейродегенеративных заболеваний на сегодняшний день не существует. В эксперименте потеря нейронов, вызванная мутациями известных генов, может быть остановлена путём введения в геном клетки-мишени терапевтического гена с целью повышения жизненной стойкости нейрона, или путём замены погибших нейронов на молодые здоровые нервные клетки путём нейротрансплантации стволовых клеток или их потомков, пре-дифференцированных в нейрональном направлении. В настоящем обзоре представлены модели нейродегенеративных заболеваний на животных и новые направления в терапии нейродегенерации разной этиологии, основанные на генетической модификации нейронов в очаге дегенерации, а также стволовых клеток перед нейротрансплантацией. Нами обобщены результаты по генной терапии с помощью антисмысловых олигонуклеотидов, РНК-интерференции и вирусных систем. Рассмотрены преимущества и недостатки нейротрансплантации эмбриональных и разных стволовых клеток взрослого организма. До настоящего времени в мировой научной литературе отсутствовали прямые указания на возможность применения генетически модифицированных клеток пуповинной крови для клеточной терапии нейродегенеративных заболеваний. На основании чего представлена гипотеза о том, что генетически модифицированные стволовые клетки пуповинной крови, трансфицированные плазмид-ным вектором, одновременно экспрессирующим клонированные нейрональную молекулу адгезии Ни сосудистый эндотелиальный фактор роста [VEGF], значительно усилят терапевтический эффект стволовых клеток пуповинной крови у трансгенных G93A мышей с фенотипом бокового амиотрофического склероза.

Введение

Нейродегенеративные заболевания характеризуются прогрессирующей гибелью нервных клеток головного и спинного мозга. Начиная с работ Сантьяго Рамон и Каха ля [1], проблема регенерации нейронов остаётся одной из важнейших в нейробиологии. До сих пор в научной литера туре резонирует пророческое высказывание С. Рамон и Кахаля: «...в конце развития родники роста и регенерации аксонов и дендритов высыхают безвозвратно. Посередине взрослости нервные пути — нечто фиксированное, закончен ное и неизменное. Всё может погибнуть, ничто не может ре генерировать. Науке будущего предписано изменить, если возможно, это суровое правило» (2). Сегодня процесс клеточ ной регенерации в центральной нервной системе (ЦНС) не считается нереализованным. Вместе с открытием нейрональ ной стволовой клетки, опровергнувшим догму о нереальности

клеточного механизма регенерации нейронов в ЦНС, в на стоящее время рушится и представление о невозможности синтеза белка в аксоне. Функциональная значимость нервных клеток для организма предусматривает их потенциальную возможность к регенерации за счёт стволовых клеток, а зна чительная протяжённость аксонов в составе периферических нервов предполагает существование в аксоплазме локаль ных биохимических процессов жизнеобеспечения. Очевидно, что подобные открытия в нейробиологии вместе с прогрес сом молекулярных и клеточных технологий открывают ши рокие перспективы разработки новых способов лечения неврологических болезней.

Нейродегенеративные заболевания затрагивают разные структуры ЦНС и разные типы нервных клеток. Необрати мой дегенерации подвергаются холинергические нейроны спинного мозга и ствола головного мозга при боковом ами строфическом склерозе и спинальной мышечной атрофии, дофаминергические нейроны чёрного вещества [substantia nigra) при болезни Паркинсона, GABA ергические нейроны базальных ганглиев при хорее Хантингтона, нейроны голов ного мозга при болезни Альцгеймера. Поддержание жизни нейронов, вступивших в патологический процесс, и вое становление утраченных межклеточных связей в нервной ткани могут существенно повысить качество и продолжитель ность жизни больных. Перспективными методами лечения больных, страдающих нейродегенеративными заболевания ми, считаются коррекция экспрессии гена, ответственного за развитие заболевания, трансплантация стволовых кле ток, а также сочетание генной инженерии с клеточной тера пией — трансплантация генетически модифицированных стволовых клеток.

Моделирование нейродегенеративных заболеваний

Для изучения влияния конкретных генов на развитие за болевания широко применяют мутантные линии животных, в первую очередь генетически модифицированных мышей. Мышь относится к наиболее изученной разновидностью млекопитающих. На сегодняшний день имеется полная рас шифровка генома мыши (30 тыс. генов), который на 80% гомологичен геному человека (35-40 тыс. генов). Поэтому мыши, полученные с помощью генной инженерии, являются удобной биологической моделью для изучения механизмов патогенеза заболеваний, связанных с мутацией известного гена, а также разработки методов лечения заболевания, вызванного мутацией данного гена.

Болезнь Альцгеймера — первичное дегенеративное заболевание головного мозга, характеризующееся про грессирующей гибелью нервных клеток гиппокампа и коры больших полушарий. Гистологическое исследование нервной ткани выявляет отложения р амилоидного белка в виде сенильных бляшек и агрегаты фосфорилирован ной формы tau-белкэ в составе нейрофибриллярных клубков. В патогенезе заболевания основное значение имеет генетическая предрасположенность. При болезни Альцгеймера найдены дефекты генов АРР (21q21.3— q22.05), АРОЕ (19q13.2), AD2 (19cen-q13.2), PSEN1 (14q24.3) и PSEN2 (1q31—q42). Модели болезни Альцгеймера на мышах основаны на экспрессии одного из дефектных генов человека. У трансгенных мышей отложе ние аберрантного белка сопровождается дегенерацией нервных клеток головного мозга и нарушениями памяти, как у человека. Например, мыши APPswe экспрессируют ген, кортрансгенные мыши APPswe, PSEN1dE9 экспрессируютри пресенилина 1 (4).

Болезнь Паркинсона — идиопатическое и медленно прогрессирующее дегенеративное заболевание ЦНС, занимающее второе место по частоте встречаемости сре ди нейродегенеративных заболеваний. Характеризуется за медленностью движений, ригидностью мышц, тремором в покое и нарушением позных рефлексов. В основе заболе вания— поражение дофаминергических нейронов чёрного вещества и других содержащих дофамин нейронов ствола головного мозга. Причины гибели нейронов при споради ческой форме неизвестны. Менделевское наследование встречается в 5% случаев этого заболевания. Семейная бо лезнь Паркинсона 1 типа возникает вследствие мутаций гена асинуклеина [SNCA 4q21 q23), кодирующего преси наптический белок. Выявлены также мутации генов parkin, DJ-1, NR4A2. У гомозиготных мышей, экспрессирующих ана треонин в позиции 53), развиваются двигательные рас стройства, приводящие к параличу скелетных мышц и, как следствие, к смертельному исходу (5).

Боковой амиотрофический склероз принадлежит к груп пе нейродегенеративных заболеваний с прогрессирующей гибелью двигательных нейронов головного и спинного моз га. Наиболее выраженные изменения происходят в передних рогах спинного мозга в шейных и поясничных сегментах, в двигательных ядрах ствола мозга, в двигательной зоне коры головного мозга. Причины гибели нейронов при наиболее частой (спорадической) форме заболевания неизвестны, но часть случаев семейной формы заболевания обусловлена доминантными мутациями гена S0D1 (21q22.1-q22.2), ко дирующего Cu/Zn-супероксиддисмутазу. S0D1 — главный фермент антиоксидантной защиты клетки. Локализуется в ядре, цитозоле и митохондриях. Гомодимер состоит из двух субъединиц, каждая из которых содержит один Си связываю щий домен, один Zn связывающий домен и дисульфидный мостик. Известно более 100 мутаций гена S0D1. Преиму щественно это точечные мутации, характеризующиеся заме ной одной аминокислоты из 153 аминокислотных остатков белка. Трансгенные мыши G93A, экспрессирующие мутант ный S0D1 (Gly93®Ala; глицин замещён на аланин в пози ции 93), характеризуются прогрессирующей дегенерацией мотонейронов, как при боковом амиотрофическом склерозе человека. Гомозиготные G93A мыши на фоне прогресси рования паралича скелетных мышц умирают в возрасте 4 5 месяцев (6).

Хорея Хантингтона — наследственное (аутосомно доми нантное) нейродегенеративное заболевание, характеризую щееся прогрессирующей гибелью GABA ергических нервных клеток в базальных ганглиях, особенно в хвостатом ядре и скорлупе. Патогенез заболевания связан с мутацией гена хантингтина HD (4р16—3). Мутантный ген содержит увели ченное число повторов CAG-кодонов и экспрессирует бе лок, полиглутаминовый трек которого содержит более 40 остатков глутамина при нормальной длине 20-25 остатков. Модель заболевания — трансгенные мыши R6/2; мутиро ванный HD содержит более 150 повторов CAG кодонов и кодирует аберрантный белок с увеличенным полиглутами новым треком (7).

Спинальная мышечная атрофия — аутосомное рецес сивное заболевание, характеризующееся дегенерацией двигательных нейронов передних рогов спинного мозга и ствола мозга. Спинальная мышечная атрофия — самая час тая причина смертности в раннем детском возрасте в ре зультате мутации гена выживания мотонейронов Smn (5q13). Трансгенные мыши, экспрессирующие дефектный ген Smn1 и дикий тип гена Smn2, после рождения выживают в течение 4 6 суток. Дрожащие мыши не способны передви гаться, у них нарушен сосательный рефлекс, затруднено дыхание. Клинические и гистологические характеристики заболевания соответствуют типу III спинальной мышечной атрофии человека. У мышей, экспрессирущих только дефект ный ген Smn1 (без трансгена Smn2), смерть наступает во внутриутробном периоде [8].

Генная инженерия в лечении нейродегенеративных заболеваний

Лечение нейродегенеративных заболеваний, патогенез которых обусловлен мутациями конкретных генов, безуслов но, требует вмешательства в организм больного на генном уровне. Генная терапия позволяет как подавить, так и уси лить экспрессию гена мишени. В настоящее время для кор рекции экспрессии гена мишени существует ряд подходов, некоторые из которых находятся в экспериментальном ста тусе, тогда как другие уже проходят клинические испытания.

Антисмысловые олигонуклеотиды. Одним из первых ме тодов вмешательства в экспрессию гена является приме нение антисмысловых олигонуклеотидов — одноцепочечных ДНК или РНК, комплементарно взаимодействующих с мРНК мишенью. Антисмысловая РНК при связывании с комплементарной последовательностью мРНК препятствует трансляции белка, тогда как антисмысловая ДНК образует гибрид ДНК/РНК, который разрушается РНКазой Н. Созда ние антисмысловых олигонуклеотидов первоначально было направлено на блокирование мРНКтеломеразы, имеющей высокую активность в трансформированных опухолевых клетках. Применительно к нейродегенеративным заболева ниям, технология антисмысловых олигонуклеотидов имеет практическое значение при заболеваниях, вызванных му тациями конкретных генов. Так, при введении антисмысловых олигонуклеотидов, комплементарных мРНК супероксиддис мутазы SOD1, трансгенным мышам G93A, экспрессирую щим фенотип бокового амиотрофического склероза, было установлено значительное снижение содержания мРНК SOD1 и белка SOD1 в тканях головного и спинного мозга. Кроме того, у таких мышей наблюдалось замедленное раз витие симптомов заболевания [9].

РНК-интерференция. В 2006 году за открытие РНК интерференции Andrew Z. Fire из Станфордского универ ситета и Craig С. Mello из Массачусетского университета были удостоены Нобелевской премии в номинации «Физи ология и медицина». РНК интерференция — эволюционно консервативный механизм посттранскрипционной блокады синтеза белка. Комплементарное взаимодействие короткой интерферирующей РНК (siRNA) с мРНК-мишенью закан чивается деградацией мРНК, и— как следствие — прекра щением синтеза белка. Способность siRNA инициировать посттранскрипционное «молчание» генов, ассоциированных с конкретными заболеваниями, в культуре клеток и на мо делях болезней человека у животных определила новое на правление в генной терапии. Совершенствование способов доставки молекулы siRNA в клетку и потенциальная возмож ность лабораторного синтеза siRNA, комплементарной любой известной мРНК, открывает широкие перспективы приме нения РНК-интерференции в лечении инфекционных, он кологических и нейродегенеративных заболеваний (боковой амиотрофический склероз, хорея Хантингтона, болезнь Альцгеймера). У трансгенных мышей SCA1 со спиномозжеч ковой атаксией после внутримозжечковой инъекции вирус ного вектора, экспрессирующего siRNA, комплементарной мутантному гену АТХ1 (атаксин 1), значительно улучшалась координация движений и восстанавливалась цитоархитек тоника мозжечка [10]. В другом случае при скрещивании трансгенных S0D1 -мышей с мышами, экспрессирующими анти-SODI siRNA, у полученного потомства транскрип ция siRNA, комплементарной мРНК мутированного гена, предотвращала дегенерацию мотонейронов [11]. Внугримы шечная [12] или интраспинальная [13] инъекция вирусного вектора, экспрессирующего siRNA (комплементарной мРНК мутированного S0D1) трансгенным 093А-мышам отодви гала начало заболевания и значительно увеличивала время жизни 093А-мышей. В настоящее время ведётся интенсив ная подготовка к клиническим испытаниям модифицированной молекулы siRNA у пожилых больных, страдающих дегене рацией жёлтого пятна сетчатки [14]. Введение в стекловид ное тело глаза siRNA (комплементарной мРНК сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF) прекращает рост со судов из хориокапиллярной пластинки в сетчатку через разрушенную лазером мембрану Бруха у приматов [15]. Полученные нами результаты свидетельствуют, что siRNA путём интернализации попадает в аксоны мотонейронов и может селективно заблокировать экспрессию белка-мише ни [16]. Для большей эффективности захвата и ретроград ного транспорта siRNA может быть конъюгирована, напри мер, с нейротрофином-3 или С-фрагментом столбнячного токсина. Далее путём инъекции в органы конъюгированная siRNA может быть целенаправленно доставлена в перика рионы нейронов, иннервирующих эти органы, что является альтернативой векторной трансфекции нервных клеток [17].

Вирусная трансфекция. Одним из перспективных мето дов доставки генетического материала в органы и клетки мишени являются вирусные векторы. С помощью методов генной инженерии в геном вирусов встраивают экспресси онные конструкции, несущие один или более рекомбинант ных генов. Подобные конструкции состоят из промотора, рекомбинантного гена и сигнала для полиаденилирования мРНК. В настоящее время используются экспрессионные векторы, основанные на различных вирусах.

Аденовирусные векторы — безоболочечные вирионы, не сущие двухцепочечный вирусный геном [18]. Аденовирус ные векторы способны инфицировать широкий спектр как делящихся, так и неделящихся клеток. Вирусный геном мо жет принять трансгенные вставки до 8 тыс. пар нуклеотидов (т.п.н.). Существенным недостатком данной системы являет ся нежелательные взаимодействие с иммунной и гумораль ной системами организма и, как следствие, осложнения при первоначальном инфицировании и невозможность (при не обходимости) повторного использования данной вирусной системы [19]. Из за отсутствия способности к интеграции в геном хозяина аденовирусная система позволяет добить ся лишь временной экспрессии трансгенов. Несмотря на то, что аденовирусы не инфицируют ЦНС, показано, что адено вирусные векторы способны к ретроградному аксонному транспорту [20, 21 ]. Эти векторы, экспрессирующие различ ные терапевтические нейротрофические факторы, успеш но применяли на различных моделях животных [22 24]. Проблемы иммунологической памяти и использования аде новирусных векторов в клинической генной терапии также рассмотрены [25].

Адено-ассоциированный вирус. Ещё одним перспектив ным вирусным вектором для генной терапии нейродегене ративных заболеваний является рекомбинантный адено ассоциированный вирус (recombinant adeno associated virus, rAAV) [26]. Это непатогенный парвовирус человека нуждается в коинфекции хелперным вирусом для реплика ции [27]. Было показано, что rAAV эффективен в нервной системе и инфицирует преимущественно нейроны [28, 29]. Несмотря на то, что AAV дикого типа интегрируется в хро мосому хозяина, рекомбинантный rAAV потерял данную спо собность и присутствует в клетке хозяина в виде эписомы. Одним из недостатков rAAV является ограничение на размер вставки трансгенной конструкции (менее 5 т.п.н.). Использо вание rAAV позволяет достичь долговременной экспрессии трансгенов. rAAV поддерживали экспрессию трансгенов в мозге крыс до 19 месяцев.

Вирусные векторы на основе герпесвирусов (herpes simplex viruses, HSV) обладают высокой инфекционностью по отношению к нервным клеткам в связи с природным тро пизмом данных вирусов. Эти вирусы также участвуют в эф фективном антеро и ретроградном транспорте в нервной системе. Модифицированные герпесвирусные векторы ус танавливают эписомную репликацию в клетке хозяина и способны нести значительные трансгенные вставки (менее 50 т.п.н.) (30]. Основными недостатками данной вирусной системы являются иммунный ответ организма на вирус ные белки и кратковременная экспрессия трансгенов. Ис пользование вирусных векторов на основе герпесвирусов подробно рассмотрено (31].

Ретровирусы также рассматривают как векторы для ге нетической терапии нейродегенеративных заболеваний. Создаются рекомбинантные вирусные системы, лишённые значительной части генетической информации вируса, что увеличивает их безопасность при клиническом применении. Успешно ведутся работы по псевдотипированию ретрови русов, когда гликопротеины вирусной оболочки ретровиру сов заменяют на гликопротеины других вирусов (например, VSV G, vesicular stomatitis virus), что придаёт рекомбинант ным ретровирусам способность инфицировать широкий спектр клеток (32]. Ретровирусы способны нести до 10 т.п.н. трансгенной информации и вызывают долговременную экспрессию трансгенов. Применение ретровирусов для генной терапии нейродегенеративных заболеваний рас сматривается с целью доставки разных факторов роста и нейротрофических факторов в ЦНС (33]. При нейродеге нерации снижается экспрессия нейротрофических факторов, поэтому считается перспективной доставка нейротрофинов с помощью вирусных векторов (например, при болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Хантингтона и боковом амиотрофическом склерозе). В эксперименте инфицирование трансгенных G93A мышей вирусным век тором, экспрессирующим VEGF (34], или IGF 1 (17] суще ственно отодвигало начало заболевания и значительно увеличивало время жизни G93A мышей. Однако, начатые клинические испытания не выявили положительного эф фекта (35, 36].

Клеточная терапия нейродегенеративных заболеваний

Травмы головного и спинного мозга, ишемические ин сульты и нейродегенеративные заболевания сопровожда ются гибелью нейронов, дегенерацией аксонов, нарушением коммуникаций в нейронных сетях и контролируемых ими функций. Для предотвращения вторичной дегенерации и поддержания роста нервных волокон одним из перспектив ных подходов представляется применение клеточных тех нологий, нейротрансплантация эмбриональных стволовых клеток, предифференцированных в нейральном направле нии прогениторных клеток и нейральных стволовых клеток. Аллотрансплантация (например, сердца, почек, печени) вошла в широкую практику клиницистов. В то же время лечение нейродегенерации путём трансплантации эмбрио нальной ткани и/или клеток остаётся пока на уровне экс периментов в лабораториях или (в лучшем случае) начаты клинические испытания. Возможности клеточной терапии в ЦНС интенсивно изучаются для преодоления посттравма тических и постишемических дефектов нервной ткани, а так же для лечения нейродегенеративных заболеваний. Вместе с тем клиницисты сталкиваются с этическими проблемами (например, возможность применения ткани плода, высокая ве роятность опухолевой трансформации трансплантированных клеток). Подготовленные для трансплантации стволовые клетки должны иметь предсказуемые и воспроизводимые характеристики, а именно:

- сохранять жизнеспособность;

- активно размножаться с образованием достаточного для восстановления утраченной ткани количества клеток;

- интегрироваться с клетками органа реципиента;

- дифференцироваться в требуемые клеточные типы;

- восстанавливать тканевый матрикс и формировать направляющие пути для роста аксонов;

- участвовать в процессе миелинизации;

- оказывать трофическое и нейропротекторное дей ствие;

- стимулировать рост аксонов.

При этом вряд ли можно рассчитывать на замещение погибших нейронов трансплантированными клетками. Ре зультаты клеточной терапии при нейродегенерации указы вают на восстановление чувствительной и (в меньшей мере) двигательной функции, но выраженность положительного эффекта в большинстве случаев незначительна. Для транс плантации в головной или спинной мозг применяют:

- эмбриональные стволовые клетки;

- стволовые мезенхимные клетки костного мозга (муль типотентные мезенхимальные стромальные клетки);

- стволовые клетки пуповинной крови.

Эмбриональные стволовые клетки получают из внутрен

ней клеточной массы бластоцисты. Из бластоцисты 4-5 су ток развития методом иммунохирургии (при помощи анти тел, вызывающих повреждение клеток трофобласта) внутреннюю клеточную массу отделяют от трофэктодермы. Полученные клетки культивируют in vitro с целью выделе ния чистой клеточной линии, способной формировать ша рообразные скопления — эмбриоидные тела. К характерным маркёрам эмбриональных стволовых клеток относятся: SSEA 3, SSEA 4, TRA 1 60, TRA 1 81, Oct 4. С помощью специфических факторов роста можно направлять диффе ренцировку диссоциированных клеток эмбриоидных тел. Фактор роста гепатоцитов (HGF) и фактор роста нервов (NGF) стимулируют дифференцировку клеток всех трёх зародыше вых листков. Ретиноевая кислота, фактор роста эпидермиса (EGF), костный морфогенетический белок 4 (ВМР4) и ще лочный фактор роста фибробластов (FGFb) индуцируют диф ференцировку клеток, образующихся из эктодермы. Произ водные мезодермы можно получить путём воздействия на стволовые клетки трансформирующим фактором роста р1 (TGFpD и активином А.

Эмбриональные половые клетки выделяют из эмбриоид ных тел, которые формируются при культивировании примор диальных половых клеток, полученных из половых валиков эмбриона 5-9 й недели развития. Для диагностики эмбри ональных половых клеток применяют следующие маркёры: SSEA 1, SSEA 3, SSEA 4, TRA 1 60, TRA 1 81. С помо щью различных факторов роста из эмбриональных половых клеток получены специализированные клетки — производ ные всех трёх зародышевых листков.

Для нейротрансплантации применяют клетки, получен ные из эмбриоидных сфер, предифференцированные ней ральные клетки, дифференцированные нервные клетки, а также генетически модифицированные клетки, экспресси рующие нейротрофические факторы или нейральные моле кулы адгезии (37]. В эксперименте на крысах эмбриональные стволовые клетки, полученные из зародышевых клеток че ловека, после однократной инъекции в цереброспинальную жидкость восстанавливали двигательную активность пара лизованных животных, инфицированных вирусом Sindbis (38]. Вместе с тем установлено, что после трансплантации эмбриональных стволовых клеток мыши в головной мозг крыс в 20% из трансплантированных клеток возникают те ратомы [39]. Риск опухолевой трансформации эмбриональ ных стволовых клеток может быть снижен, если клетки in vitro предварительно были подвергнуты дифференцировке в нейральные предшественники. Чаще применяют эмбри ональные стволовые клетки, предифференцированные в нервные клетки, экспрессирующие фенотип дофаминергичес ких нейронов для терапии болезни Паркинсона [40, 41 ] или холинергические нейроны [42] для нейротрансплантации в спинной мозг при дегенеративных заболеваниях и травмах. Однако по причине высокой вероятности трансформации стволовых клеток в опухолевые и контаминации неизвест ными инфекционными агентами из материала животных, используемого для культивирования клеток, применение стволовых клеток человека в клеточной терапии было огра ничено лишь экспериментальными исследованиями [43]. В США 9 августа 2001 года был принят закон о финанси ровании лабораторных исследований эмбриональных ство ловых клеток человека известных линий и удовлетворяющих специфическим критериям [44].

Стволовая мезенхимная клетка красного костного мозга [мультипотентная мезенхимальная стромальная клетка, ММСК] с фенотипом CD29^, CD34^, CD44^, CD90^, CD 106^, CD105VSH2*. CD73VSH3*. Sea 1*. Thy 1*. BMPFT относит ся к самообновляющейся клеточной популяции, из которой образуются стромальные клетки Stro 1*. экспрессирующие маркёры стволовых клеток [CD34, Sea 1 и др.). ММСК, а также её дочерние стромальные клетки могут дифферен цироваться в жировые, костные, хрящевые клетки [45]. Дальнейшие исследования потенциальных возможностей ММСК обнаружили её трансдифференцировку в клетки дру гих зародышевых листков. В экспериментах in vitro и in vivo установлено, что ММСК может быть дифференцирована в нейральном и миогенном направлениях [45, 46]. ММСК че ловека, трансплантированные в головной мозг крысы, дава ли начало астроцитам [47], а в культуре клеток были получе ны нейроны, экспрессирующие фенотипы холинергических, дофаминергических, глутаматергических нейронов [48]. Доступность клеточного материала, возможность транс плантации аутогенных клеток, отсутствие признаков обра зования тератомы, а также снятие множества этических вопросов открывают широкие перспективы в применении собственных мезенхимных стволовых клеток костного моз га в клеточной терапии нейродегенеративных заболеваний. После нейротрансплантации дофаминергических нейронов, дифференцированных из ММСК, животным с моделью болез ни Паркинсона был обнаружен выраженный положительный терапевтический эффект, что и явилось отправной точкой для клинических испытаний лечения болезни Парктинсона [49]. Другим, не менее важным свойством ММСК являет ся их способность к миграции. Так, после внутривенной трансфузии ММСК выселяются не только в органы гемо поэза. Например, трансплантированные клетки мигрируют в область ишемии головного мозга при моделировании ин сульта у крыс [50]. Таким образом, ММСК красного кост ного мозга, инъецированные в кровь, целенаправленно мигрируют к месту нейродегенерации и способны диффе ренцироваться в нейроны и глиальные клетки. Отметим, что из 20-100 мл аспирата красного костного мозга через две недели экспансии из клеточной культуры можно получить 10x106 ММСК, что достаточно для нейротрансплантации человеку [48].

Стволовые клетки пуповинной крови. К настоящему вре мени охарактеризованы выделенные из пуповинной крови стволовая кроветворная клетка (CD34^, CD31^, CD59^, Sea 1*. ТИуГ, Oct 4*. Nanog^, S0X2^, FGF 4 ), ММСК, про гениторная эндотелиальная клетка (CD34^, GATA2^, Flk 1*); SP (side population) клетка, способная дифференцироваться в миогенном и кроветворном направлениях, а также клетки, экспрессирующие специфические CD-маркёры и дающие начало разным клеточным типам. После подтверждения трансдифференцировки стволовой кроветворной клетки и ММСК в нейральном направлении [46, 51 55] начались интенсивные исследования по нейротрансплантации этих клеток в эксперименте. Признанной экспериментальной моделью нейродегенерации считается модель бокового амиотрофического склероза. Трансплантация пуповинных клеток крови человека трансгенным мышам G93A продлева ла их жизнь, а терапевтический эффект зависел от количе ства трансплантированных клеток [56,57]. Было показано, что введённые внутривенно клетки пуповинной крови мигриро вали преимущественно в места дегенерации нервной ткани, хотя эти клетки также были обнаружены и в других органах [58]. Кроме того, было установлено что трансплантирован ные клетки человека экспрессировали нейрональные мар кёры (например, нестин, нейрональная форма ртубулина TuJ1, глиальный фибриллярный кислый белок GFAP). При моделировании инсульта у крыс трансплантация клеток пу повинной крови уменьшала клинические проявления ишемии мозга [59]. Таким образом, вместе с появлением доказа тельных экспериментов по эффективности трансплантации клеток пуповинной крови животным с фенотипом нейродеге неративных заболеваний человека — наряду с клиническими испытаниями по аутотрансплантации CD34 позитивных клеток периферической крови больным амиотрофическим латеральным склерозом без видимого улучшения — стано вится очевидным, что применение стволовых клеток пуповин ной крови является одним из перспективных направлений в клеточной терапии нейродегенеративных заболеваний.

Генетическая модификация стволовых клеток для клеточной терапии

Для повышения эффективности нейротрансплантации в настоящее время активно исследуются возможности при менения генетически модифицированных стволовых клеток, экспрессирующих терапевтические гены, с целью доставки в область нейродегенерации факторов, поддерживающих выживание нейронов и рост нервных волокон. Существует несколько технологий доставки генетического материала в эукариотические клетки.

Вирусные системы. Аденовирусные векторы являются одним из самых широко применяемых методов генетичес кой модификации эукариотических клеток. В одной из пер вых работ, посвящённых генетической модификации CD34 гемопоэтических клеток, S.J. Neering et al. использовали рекомбинантный аденовирусный вектор, экспрессирующий репортерные гены iacZ или щелочной фосфатазы [60]. Было показано, что после инфицирования до 45% клеток экспрес сировали репортерные гены. При этом важным наблюдени ем явилась малая токсичность аденовирусного вектора.

Другой коллектив авторов применил рекомбинантный аденовирусный вектор для экспрессии транскрипционного фактора Н0ХВ4 в CD34 клетках, выделенных из пуповин ной крови человека [61]. Основываясь на ранее опублико ванных данных о том, что экспрессия транскрипционного фактора Н0ХВ4 в стволовых кроветворных клетках мыши приводила к росту пролиферативной активности, авторы выдвинули гипотезу, что экспрессия Н0ХВ4 в инфицирован ных CD34 клетках пуповинной крови человека также усилит их пролиферацию. Был достигнут высокий уровень экспрес сии трансгенов в клетках мишенях, но вместо ожидаемого роста скорости пролиферации инфицированные CD34^ клетки преимущественно дифференцировались в миелоид ном направлении.

Лента и ретровирусные системы способны к эффектив ной генетической модификации стволовых кроветворных клеток. В 1999 году появилась серия работ, в которых ис следователи показали возможность генетической модифи кации стволовых клеток пуповинной крови рекомбинантными ретро и лентивирусами. Так было установлено, что способ ность клеток с фенотипом CD34^CD38 CD33, выделенных из пуповинной крови человека, к пролиферации — необхо димый фактор для успешного введения вирусного вектора в клеточный геном [62]. В другой лаборатории были получе ны модифицированные клетки пуповинной крови человека с фенотипом CD34^CD38 [63]. В качестве модельного век тора был применён рекомбинантный лентивирус, экспресси рующий репортерный белок EGFP. Средняя эффективность экспрессии трансгена EGFP составила 59±7%. Большинство эритроидных и миелоидных колоний, полученных из инфи цированных CD34^CD38 клеток, экспрессировали ген EGFP. Один из главных недостатков ретровирусов связан с их спо собностью к интеграции в геном хозяина в случайных сайтах, что может привести к мутагенезу и активации онкогенов. С целью повышения безопасности применения подобных вирусных векторов в клинике продолжаются интенсивные исследования по дальнейшей оптимизации данной вирус ной системы [64].

Химическая трансфекция. Одним из распространённых подходов для химической трансфекции разных эукариоти ческих клеточных линий считается применение катионных липидов или полимеров. Метод основан на образовании липосомных комплексов, способных проникать сквозь плазматическую мембрану клеток. Преимуществом метода считается его относительная простота и доступность необ ходимого оборудования. Эффективность низкомолекулярных полиэтилениминов для трансфекции невирусных систем была показана для гемопоэтических клеточных линий и CD34^ клеток пуповинной крови человека [65]. Более того, клетки, трансфецированные с помощью низкомолекулярных поли этилениминов, показали хорошую жизнеспособность. Сравнение эффективности трансфекции клеток с помощью полиэтилениминов и реагента Lipofectamine 2000 [Invitrogen, США), который применяется для химической трансфекции эукариотических клеток и используется многими научными коллективами в качестве стандарта, показало более высо кий уровень экспрессии гена EGFP (до 23 раз) в различных клеточных культурах, включая CD34^ клетки пуповинной кро ви (после трансфекции с помощью полиэтилениминов).

Электропорация является одним из самых универсаль ных методов физической доставки генетического мате риала в различные эукариотические клеточные культуры. В нескольких лабораториях успешно продемонстрировали возможность применения электропорации для генетичес кой модификации гемопоэтических клеток и CD34^ клеток пуповинной крови. Группа немецких учёных путём электро порации провела трансфекцию репортерной конструкции, содержащей ген EGFP, в свежевыделенные CD34^ клетки пуповинной крови человека [66]. Была документирована 80% ная эффективность трансфекции клеток при высоких вольт амперных параметрах эксперимента, но этот резуль тат был получен лишь с 50% ной выживаемостью клеток. Увеличение ёмкости электрического импульса и/или кон центрации ДНК приводило к повышению эффективности электропорации, но также и к понижению выживаемости клеток. Более щадящие параметры электропорации позво лили повысить жизнеспособность клеток при трансфекции. Так, была достигнута 41,2% ная эффективность электропо рации CD34^ клеток пуповинной крови без значительного сни жения жизнеспособности клеток [67]. М. Jurga et al. успешно использовали электропорацию для введения плазмиды, экспрессирующей белок EGFP, в нейральные стволовые клетки, дифференцированные при культивировании клеток пуповинной крови человека [68].

Таким образом, применение вирусов для доставки гене тического материала в геном клетки мишени ограничено возможными иммунологическими и онкогенными побочны ми эффектами. Поэтому, несмотря на относительно более низкую эффективность трансфекции, невирусные систе мы обладают высокой биобезопасностью трансгеноза, что существенно облегчает внедрение разрабатываемых генно клеточных технологий в клиническую практику.

Нейротрансплантация генетически модифицированных стволовых клеток

Стволовые клетки, экспрессирующие клонированный ген, могут значительно усилить терапевтический эффект транс плантированных клеток и регенераторный потенциал орга на мишени. Трансфекция эмбриональных стволовых клеток мыши плазмидами, экспрессирующими клонированный ген нейрональной молекулы адгезии L1, обеспечивает не только встраивание этой молекулы адгезии в клеточную мембрану стволовых клеток, но и секрецию её растворимой формы [69]. После трансплантации подобных клеток в травми рованный спинной мозг они формировали отростки и обнаруживались в ткани реципиента спустя месяц после трансплантации, тогда как аналогичные, но нетрансфеци рованные клетки выживали лишь в течение 7 суток. В еле дующих работах [70] было установлено, что экспрессия L1 направляет дифференцировку эмбриональных стволовых клеток по нейрональному пути. В настоящее время про водятся интенсивные исследования с целью получения ге нетически модифицированных стволовых мезенхимных клеток, способных дифференцироваться в заданном на правлении. Установлено, что трансфекция стволовых мезен химных клеток красного костного мозга вирусным вектором, экспрессирующим ген тирозингидроксилазы, вызывает их дифференцировку в дофаминергические нейроны [50].

В качестве дальнейшей разработки этого подхода пред ставляет интерес использование и других менее опасных в плане возможной опухолевой трансформации стволовых клеток. Более перспективными в этом смысле являются стволовые клетки пуповинной крови.

Основанием для трансплантации стволовых клеток пу повиной крови для стимуляции регенерации нервной ткани является их пригодность как для алло, так и для аутотрансп лантации у человека, их низкая иммуногенность, доступность, простота получения и хранения. Кроме того, в пуповинной крови присутствуют стволовые клетки, способные давать начало специализированным клеткам разных тканей. Так, стволовая кроветворная клетка может выходить из красно го костного мозга, находиться в общем кровотоке и заселять, например, сердце, головной мозг, печень или скелетные мышцы. Далее, в зависимости от микроокружения, стволо вая кроветворная клетка может дифференцироваться в мио бласты скелетной и сердечной мышечной ткани, гепатоциты, эндотелиальные клетки сосудов, нейроны, олигодендроци ты, астроциты. В настоящее время существуют единичные экспериментальные работы по трансплантации генетически модифицированных клеток пуповинной крови для стимуля ции регенерации сердечной мышцы и сосудов. Наибольшее внимание уделяется возможности трансплантации клеток пуповинной крови, генетически модифицированных геном VEGF. Например, трансплантация клеток пуповинной крови, трансфецированных человеческим геном VEGF, активирует ангиогенез в тканях при моделировании хронической ише мии конечностей у крысы [71 ] и инфаркта миокарда у мы шей [72]. Таким образом, для устранения дефектов нервной ткани, для нейропротекции и стимулирования регенерации нервных волокон в ЦНС получение и испытание генетичес ки модифицированных клеток пуповинной крови можно счи тать перспективным направлением клеточной терапии. При этом возможно тестирование множества конкретных под ходов (например, применение различных клеточных типов пуповинной крови, разные генетические модификации клеток перед трансплантацией, варианты по срокам, коли честву и способу введения клеток непосредственно в область травмы, в кровоток, в биоматрикс).

Заключение

В наших исследованиях планируется экспериментально обосновать целесообразность трансплантации стволовых клеток пуповинной крови при нейродегенеративных забо леваниях, в частности, при боковом амиотрофическом скле розе. Для усиления терапевтического эффекта стволовые кроветворные клетки пуповинной крови будут подвергнуты генетической модификации, трансфекции плазмидными векторами, экспрессирующими гены нейрональной молекулы адгезии L1 и сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF (рис.). Усиление экспрессии генов, кодирующих син тез подобных молекул, позволяет рассчитывать на более выраженный трофический эффект генетически модифици рованных клеток на мотонейроны головного и спинного мозга при боковом амиотрофическом склерозе.

Известно, что молекула адгезии L1 поддерживает вы живание нейронов и рост аксонов. Что касается VEGF, то его нейротрофическое действие является новым и неожидан ным открытием, а применение этого фактора обоснованно считается одним из наиболее перспективных направлений. Фактор поддерживает выживание нейронов, что, согласно нашим данным, осуществляется через рецептор Flk 1 (73). На модели экспериментальной травмы спинного мозга VEGF в гелевом носителе на основе экстракта белков базальной мембраны существенно поддерживает васкуляризацию и рост аксонов (74). Наш выбор именно этого фактора роста обусловлен также его выраженным стимулирующим влия нием на процесс неоваскуляризации, что представляется важ ным для скорейшего устранения эффекта цитотоксичности.

Решение поставленных задач в эксперименте позволит на чать клинические испытания, что ускорит внедрение в кли ническую практику трансплантацию генетически модифи цированных стволовых клеток пуповинной крови больным, страдающим нейродегенеративными заболеваниями, пос ле нейротравмы и ишемических инсультов. Анализ первых клинических испытаний по трансплантации больным боко вым амиотрофическим склерозом стволовых клеток, выде ленных из периферической крови, показал безопасность трансплантации и толерантность больного к транспланти рованным клеткам [52]. Однако клиническое применение для нейротрансплантации стволовых клеток пуповинной крови требует дополнительных экспериментальных иссле дований с учётом их трансдифференцировки в разные клеточные типы [75]. При этом генетическая модификация стволовых клеток пуповинной крови может быть полезна в двух аспектах. Во первых, для направленной дифференциров ки клеток и ограничения возможности их злокачественной трансформации. Во вторых, для доставки специфических ростовых и трофических факторов для поддержания устой чивости нервных клеток при нейропатологии.

Подняться вверх сайта