Поиск Кабинет

Генетически модифицированные мононуклеары пуповинной крови – стимуляторы нейрорегенерации при дегенеративных заболеваниях центральной нервной системы

Гены & Клетки: Том VIII, №3, 2013 год, стр: 106-112

 

Авторы

Гусева Д.С., Ризванов А.А., Киясов А.П., Исламов Р.Р.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Генно-клеточная терапия представляет собой новый этап в лечении пациентов с различными заболеваниями, связанными с патологией цетральной нервной системы. В данном обзоре мы рассматриваем последние достижения в области трансплантация мононуклеарных клеток пупо винной крови – наиболее доступного источника стволовых клеток – с целью повышения жизнеспособности нервных клеток и стимулирования нейрорегенерации. Как наиболее эффективная терапия для лечения нейродегенеративных заболеваний рассматривается генетическая модификация клеток пуповинной крови для оптимальной доставки нейро протекторных факторов и факторов роста в области нерв ной системы, подверженные дегенерации в процессе забо левания. Основным вопросом, которому посвящен данный обзор, является терапия бокового амиотрофического склероза – прогрессирующего нейродегенеративного за болевание ЦНС с выраженным поражением двигательных нейронов коры и ствола головного мозга, а также мотоней ронов спинного мозга – с использованием генетически мо дифицированных клеток пуповинной крови. Исследования последних лет указывают на возможность дифференци ровки трансплантированных модифицированных клеток пу повинной крови в макрофаги, эндотелиальные клетки или астроциты на модели бокового амиотрофического скле роза у мышей, тем самым создавая мощную платформу для поддержки дегенерирующих нейронов, структурного и функционального восстановления мозга после нейротравм, ишемических инсультов и при различных нейродегенера тивных заболеваниях.

Введение

Регенерация и методы её стимулирования для практической медицины – одна из актуальнейших проблем, этим вопросам посвящены и фундамен тальные исследования, и прикладные биомеди цинские разработки, и наблюдения клиницистов. Поскольку регенеративные способности тканей, ор ганов и организмов значительно различаются, полу чены разнообразные модельные системы, в которых изучают процессы регенерации и разрабатывают ме тоды её стимуляции на молекулярном, клеточном и тканевом уровнях.

«Регенеративная медицина» направлена на вос создание утраченных тканей и (или) органов и восстановление их функций. Один из основных методов в регенеративной медицине – трансплантация различных видов стволовых клеток. Наиболее частое применение в сфере клеточной терапии получила аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) для лечения злокачественных и доброкачественных заболеваний кроветворной системы[1, 2]. ГСК получают из красного костного мозга, периферической крови и, всё чаще и чаще, из пуповинной крови[3]. Множество исследований, посвящённых поиску доступных источников стволовых клеток, доказали целесообразность применения мононуклеарных клеток пуповинной крови (МКПК) не только для коррекции гематологических нарушений, но и для стимуляции регенерации разных тканей и органов при ишемических и дегенеративных заболеваниях.

Клетки пуповинной крови легко доступны, они наиме нее иммуногенны в сравнении со стволовыми клет ками кроветворной системы взрослого организма [4–6]. Мононуклеарная фракция крови пуповины со держит популяции разных стволовых клеток, способ ных к дифференцировке во многие клеточные типы; иными словами, они могут рассматриваться как аль тернатива эмбриональным стволовым клеткам[7], в т.ч. и при лечении постишемических, посттравма тических и дегенеративных заболеваний[8, 9]. Что немаловажно, привлекает юридическая и этическая возможность применения МКПК в клинике.

На сегодняшний день в пуповинной крови выяв лены гемопоэтические и негемопоэтические ство ловые и прогениторные клетки[11, 12]. Последние представляют собой совокупность нескольких попу ляций: мультипотентные мезенхимальные стромаль ные клетки[12], еще менее дифференцированные стволовые клетки с плюрипотентными свойствами, такие как неограниченно делящиеся соматические стволовые клетки (англ. unrestricted somatic stem cells, USSCs)[13] и «эмбриональные стволовые клетки» пуповинной крови[14, 15]. Кроме того, мо нонуклеарная фракция пуповинной крови включает ранние предшественники эндотелиальных клеток, а также клетки SP (англ. side population), способные дифференцироваться в миогенном и кроветворном направлениях. Недавние исследования указывают также на возможность выделения из пуповинной крови предшественников олигодендроцитов[16]. Отмечено, что клетки пуповинной крови в каче стве источника стволовых клеток начинают широко применяться в клинической практике. Вероятно, это связано с тем, что, во-первых, в отличие от клеток костного мозга, количество МКПК и их способность к дифференцировке не зависят от возраста донора и, во-вторых, практически исключается опухолевая трансформация МКПК в организме реципиента[17].

Кроме того, благодаря незрелости иммунной систе мы новорождённых, МКПК не требуют соответствия генов тканевой совместимости человека HLA, что подтверждается отсутствием острой или хрониче ской формы болезни «трансплантат против хозяина» [18, 19], нередко возникающей при трансплантации клеток костного мозга. В настоящее время банки клеток пуповинной крови организованы по всему миру. В таких банках персонализированные образцы могут храниться бесконечно долго, представляя со бой незаменимый клеточный материал для будущих терапевтических мероприятий. Успехи доклиниче ских и клинических исследований по трансплантации клеток пуповинной крови вселяют надежду на скорое внедрение их в клиническую практику не только для лечения гематологической патологии, но и для тера пии пациентов с негематологическими заболевания ми. Таким образом, пуповинная кровь как наиболее доступный ресурс различных популяций стволовых клеток, заслуживает особого внимания для раз работки протоколов клеточной терапии в практике регенеративной медицины.

Трансплантация МКПК для повышения жизнеспособности нервных клеток и стимулирования нейрорегенерации

Одним из важнейших направлений в регенера тивной медицине является лечение пациентов с патологией центральной нервной системы (ЦНС). Нарушение функций головного и спинного мозга после ишемического инсульта, нейротравмы или в результате нейродегенеративных заболеваний требует врачебных действий, направленных на предотвращение дальнейшей гибели нервных клеток и повышения их жизнеспособности. Нейротрофические факторы и клетки нейроглии выступают в роли главных «защитников» подверженных патологическому процессу нейронов. Тот факт, что МКПК включают стволовые клетки, способные продуцировать нейротрофические факторы, а также моноциты (клетки-предшественницы микроглии) и эндотелиальные прогениторные клетки, прямо указывает на целесообразность трансплантации МКПК для стимулирования нейрогенерации. При этом внутривенное введение МКПК отвечает условию минимальных инвазивных манипуляций на ЦНС и является целесообразным благодаря способности МКПК к миграции через гематоэнцефалический барьер.

Первая успешная трансплантация клеток пупо винной крови была выполнена у пациента с анемией Фанкони[10]. В настоящее время получены убеди тельные данные об эффективности трансплантации МКПК для терапии различных нозологических форм, в т.ч. нейродегенеративных заболеваний[20]. В мно гочисленных работах было установлено, что клетки пуповинной крови при культивировании в среде с ней рональными ростовыми факторами, γ-интерфероном [21, 22] или ретиноевой кислотой[23, 24] способ ны к дифференцировке в нейрогенном направлении [24–29]. При блокировании гемопоэтической популя ции клеток пуповинной крови была получена клеточная линия со свойствами нейральных стволовых клеток, которые при стимуляции фактором роста эпидермиса (EGF) были способны к спонтанной агрегации и диф ференцировке в клетки, по своим свойствам сходные с нейронами, астроцитами и олигодендроцитами[28]. При культивировании in vitro на биодеградируемом материале в течение трёх недель МКПК формиро вали клеточные комплексы, содержащие стволовые клетки и пролиферирующие нейробласты. Мульти электродные чипы, на которые были высажены по лученные комплексы, выявили способность МКПК дифференцироваться в нейроны, образующие функ циональные сети и генерирующие спонтанные потен циалы действия[30].

Эффективность трансплантации МКПК для сти мулирования нейрорегенерации активно исследуют в экспериментах на животных[31]. Трансплантация МКПК оказывает выраженный положительный эф фект на выживание нервных клеток ЦНС. На моде ли болезни Альцгеймера у трансгенных мышей со сверх-экспрессией предшественника β-амилоида трансплантация МКПК продлевала жизнь экспери ментальных животных[32]. После многократного внутривенного введения МКПК таким мышам про изошло уменьшение астроцитоза и образования β-амилоидных бляшек[33]. Данное улучшение было ассоциировано с активацией фагоцитарной активно сти клеток микроглии по отношению к β-амилоиду и активацией астроцитов, экспрессирующих глиаль ный фибриллярный кислый белок (GFAP)[33]. При трансплантации мышам с моделью болезни Альц геймера стволовых мезенхимных клеток, получен ных из пуповинной крови, было продемонстрирова но восстановление когнитивных функций (памяти и обучения)[34].

На модели ишемического инсульта у грызунов показано, что после внутривенного введения МКПК у животных уменьшался объём инфаркта голов ного мозга и улучшался неврологический статус. Внутрибрюшинное введение человеческих МКПК новорождённым крысятам с гипоксической ишеми ей головного мозга также приводило к облегчению симптомов центрального паралича[35]. В зоне ише мии МКПК активизируют неоангиогенез, вызывают анти-апоптозный и противовоспалительный эффект [36–39]. CD34+-клетки, полученные из пуповинной крови человека, участвуют в образовании новых со судов в зоне ишемии, обеспечивая тем самым бла гоприятные условия для нейрорегенерации[40]. Положительный эффект МКПК на восстановле ние двигательных функций установлен и при травме спинного мозга у мышей и крыс[41–43]. Введение клеток пуповинной крови человека в кровоток после травмы спинного мозга угнетает воспалительную ре акцию, оказывает нейротрофическое влияние, сти мулирует неоваскуляризацию, снижает экспрессию проапоптозных генов и поддерживает выживание нейронов[44, 45].

Другим возможным механизмом положительного эффекта МКПК на нейрорегенерацию может служить их способность дифференцироваться в нейроны, астроциты и олигодендроциты[46]. Так, в условиях культивирования в среде, содержащей фактор роста фибробластов-8 (FGF-8), МКПК могут дифференци роваться в дофаминергические нейроны[47]. При трансплантации таких клеток в полосатое тело мозга крыс (с моделью болезни Паркинсона) установлено частичное восстановление симптоматического поведения, вызванного амфетамином[47, 48].

Биологически активные молекулы, секретиру емые МКПК, также участвуют в стимулировании нейрорегенерации[49], так как МКПК продуцируют антиоксидантные, ангиогенные и нейротрофиче ские факторы[38, 50-54]. В экспериментах in vitro при ко-культивировании МКПК и нейронов гиппо кампа было показано, что МКПК экспрессировали молекулы адгезии (V-CAM-1, I-CAM-1, L-selectin, E-selectin) и факторы роста (G-CSF, GM-CSF, со судистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), мозговой нейротрофический фактор (BDNF), про исходящий из нейроглии нейротрофический фак тор (GDNF))[55]. В связи с этими наблюдениями значительное количество исследователей сфоку сировали внимание на способах доставки клетками пуповинной крови ростовых и нейротрофических факторов, таких как VEGF, BDNF и GDNF. Так, при трансплантации МКПК после травмы спинного мозга восстановление функциональных наруше ний связывают с усилением экспрессии VEGF[53], а на модели ишемического инсульта – с нейро протекторным действием BDNF[56, 57]. Уровень экспрессии GDNF возрастает после транспланта ции МКПК крысам с моделью ишемического ин сульта[57, 58]. Противовоспалительное действие МКПК может быть обусловлено лимфоцитами, которые вырабатывают значительное количество интерлейкина-10 (IL-10)[59].

Генетическая модификация клеток пуповинной крови для нейрорегенерации Клеточная терапия – один из главных «инструментов» регенеративной медицины – в последнее время активно разрабатывается. Трансплантация стволовых клеток может быть направлена как на замещение погибших клеток, так и на предотвращение дальнейшей гибели выживших клеток за счёт секретируемых биологически активных молекул. Усиление же цитопротекторного действия трансплантируемых клеток при помощи генетической модификации является сравнительно новым подходом в клеточной терапии[60–62], так как, во-первых, становится возможной адресная доставка нейропротекторных факторов (миграция трансплантированных клеток в места дегенерации) и, во-вторых, появляется возможность регулировать уровень секреции терапевтических молекул. Исходя из вышеизложенного, становится очевидным, что исследования, направленные на генетическую модификацию МКПК с целью доставки нейротрофических факторов в повреждённую область мозга, представляют собой обоснованный подход в клеточной терапии нейродегенеративных заболеваний.

Для генетической модификации транспланти руемых клеток в настоящее время существует два подхода: вирусный и невирусный. Невирусный (до ставка в клетку плазмидной ДНК) наименее без опасен, но не достигает, как правило, высокой эффективности трансфекции и длительности экс прессии трансгена. Повышение эффективности трансфекции клеток in vitro проводят физическими (путём электропорации) или химическими мето дами (с помощью катионоактивных липидов)[63, 64]. Наиболее распространенным видом транс фекции in vivo является введение очищенной «го лой» плазмидной ДНК с помощью инъекции[65]. К общепринятым вирусным векторам в исследова ниях по генной терапии относятся вирус лейкемии мышей Молони (MoMLV), аденовирус серотипа-5 (Ad5)[63], адено-ассоциированный вирус (AAV) [66-68] и лентивирусы (HIV-1 и др.)[64]. По сво ей эффективности вирусные векторы превосходят плазмидные, но для некоторых из них обнаружены проблемы безопасности применения, связанные, во-первых, с риском инсерционного мутагенеза, вызываемого итеграцией ретровирусного генома в геном реципиента и, во-вторых, индуцированием потенциального иммунного ответа к векторным ви русным антигенам[69].

В терапии ишемических заболеваний генети чески модифицированные МКПК применяют пре имущественно для стимулирования ангиогенеза. Так, положительный терапевтический эффект был достигнут на модели хронической ишемии задней конечности у крыс после трансплантации МКПК, сверх-экспрессирующих человеческий ген vegf[60]. На модели инфаркта миокарда у крыс были испы таны полученные из МКПК гемопоэтические клет ки (CD133+/CD34+), сверх-экспрессирующие два рекомбинантных гена – vegf и pdgf (ген фактора роста, полученного из тромбоцитов)[70], а так же CD34+-клетки, сверх-экспрессирующие VEGF и ангиопоэтин-1 (Ang1)[61, 71]. Терапия инфаркта миокарда с помощью генетически модифицирован ных стволовых клеток уменьшала объём некроза сердечной мышцы, сдерживала развитие сердечной недостаточности и увеличивала плотность капилля ров в миокарде.

Терапия бокового амиотрофического склероза при помощи генетически модифицированных клеток пуповинной крови

Боковой амиотрофический склероз (БАС) — про грессирующее нейродегенеративное заболевание ЦНС, обусловленное поражением двигательных ней ронов коры и ствола головного мозга, а также мо тонейронов спинного мозга. В результате паралича и последующей атрофии скелетных мышц смерть наступает от инфекций дыхательных путей или от каза дыхательной мускулатуры[72]. Гибель двига тельных нейронов происходит вследствие патоло гического влияния нейромедиатора глутамата на постсинаптические нервные клетки и последующих процессов в виде оксидативного стресса, нарушений кальциевого гомеостаза, функций митохондрий и ак сонного транспорта, а также в виде формирования белковых агрегатов в цитозоле[73–75]. Несмотря на то, что причины многих форм спорадического БАС остаются неясными, показано, что до 10% слу чаев БАС наследственны, и 20% из них – результат доминантной наследуемой мутации гена суперок сиддисмутазы-1 (SOD-1)[76]. Существует линия трансгенных мышей со сверх-экспрессией мутант ной формы SOD1 (мутация G93A), несущей замену в позиции 93 глицина на аланин. В результате про грессирующей гибели мотонейронов спинного мозга у мышей развивается заболевание, имитирующее БАС человека[77].

Многие исследования последнего времени на правлены на лечение БАС путём трансплантации стволовых клеток красного костного мозга и пупо винной крови. Так, на модели БАС у трансгенных мышей G93A при внутривенном введении МКПК развитие болезни замедляется на 2–3 нед., увели чивается продолжительность жизни животных[78]. Более того, определены оптимальные дозы клеток пуповинной крови, позволяющие как увеличить вы живаемость мышей, так и максимально уменьшить содержание провоспалительных цитокинов в спин ном и головном мозге[79]. Интраспинальное вве дение клеток пуповинной крови трансгенным мышам G93A с имитацией БАС до появления симптомов болезни сдерживает нарушения двигательной актив ности и продлевает сроки выживания эксперимен тальных животных[80]. Позитивный эффект связан с уменьшением гибели мотонейронов, снижением астроцитоза и увеличенной экспрессией белка те плового шока Hsp70[81], что расценивают как про явление противовоспалительного эффекта клеток пуповинной крови[80]. В настоящее время прово дится 2 фаза клинического исследования клеточной терапии БАС путём трансплантации больным ММСК, полученных из пуповинной крови (NCT01494480). Стратегия генной терапии БАС направлена на под держание жизнеспособности мотонейронов с помо щью нейропротекторных факторов. Одним из путей доставки нейротрофических факторов к мотонейро нам является применение вирусных векторов, несу щих рекомбинантные терапевтические гены. Внутри мышечное или интраневральное введение вирусов показало положительный эффект у мышей, но было недостаточным для доставки вектора в ЦНС более крупных видов лабораторных животных[82]. В свя зи с этим была испытана интратекальная инъекция, как наиболее прямой путь доставки гена в спинной мозг. Однако, несмотря на частично положительные результаты, внутримышечная, интраневральная или интратекальная инъекции не позволяют осуществить доставку вектора во все отделы спинного мозга. В настоящее время внимание исследователей направлено на адено-ассоциированный вирусный вектор AAV9, который способен проникать через гематоэнцефалический барьер после внутривенного или интратекального введения[83–85]. Так, при инъекции вектора AAV9 трансдукция мотонейронов отмечена и у крупных лабораторных животных[83, 86–89].

Более контролируемым процессом по сравне нию с прямой генной терапией является доставка терапевтических генов на клеточных «носителях». Метод доставки терапевтических молекул с помо щью клеточных носителей основан на транспланта ции генетически модифицированных клеток, сверх экспрессирующих рекомбинантные терапевтические гены[90]. Данный подход позволяет проследить ко нечный пункт миграции трансплантированных клеток и (при необходимости или нежелательных послед ствиях) остановить дальнейшую терапию генно-кле точным препаратом[91, 92].

К настоящему времени, однако, известно лишь не большое количество работ, в которых на модели БАС у трансгенных мышей трансплантировали генетически модифицированные стволовые или прогениторные клетки различного происхождения[90]: миобласты, экспрессирующие GDNF[93], нейрональные клетки предшественницы из коры головного мозга челове ка, генно-модифицированные для сверх-экспрессии GDNF[94, 95]; клетки почки новорождённого хомяка, содержащие вектор с геном цилиарного нейротрофи ческого фактора человека[96, 97].

В наших исследованиях мы впервые показали, что мононуклеарная фракция МКПК, трансфеци рованная геном vegf человека и геном мышиной молекулы адгезии L1 (L1CAM), введённая ретроор битально 22-25-недельным трансгенным мышам с мутацией G93A, т.е. ещё до развития признаков за болевания, успешно мигрировали в паренхиму спин ного мозга мышей, выживали более 3 мес. и диф ференцировались в эндотелиальные клетки и клетки микроглии[98]. В следующей своей работе мы по казали, что МКПК, трансфицированные двухкассет ными плазмидными векторами pBud-VEGF-L1CAM были обнаружены в спинном мозге мышей G93A и, как было показано при помощи иммуфлуоресцент ного анализа, также экспрессировали маркёры эн дотелиальных клеток и клеток микроглии[99]. Ещё более поздние эксперименты, проведённые в нашей лаборатории, указывают на возможную дифферен цировку генетически модифицированных МКПК, трансфицированных двухкассетными плазмидными векторами pBud-VEGF-FGF2, в S100+-клетки[100]. Полученные нами результаты по трансплантации генетически модифицированных монононуклеарных клеток из пуповинной крови мышам SOD1-G93A свидетельствуют о том, что трансплантированные клетки (в зависимости от типа экспрессионного век тора в спинном мозге мышей) могут дифференци роваться в макрофаги, эндотелиальные клетки или астроциты. Недавно было установлено, что генети чески модифицированные ММСК человека, одно временно сверх-экспрессирующие гены gdnf и vegf, при внутримышечной инъекции крысам с моделью БАС поддерживают структуру нервно-мышечного си напса и продлевают жизнь животных[101].

Заключение

Генно-клеточная терапия открывает новый этап терапии различных заболеваний человека. Экспери ментальные исследования показывают, что генети чески модифицированные клетки имеют огромный потенциал для доставки терапевтических генов в ЦНС с целью структурного и функционального вос становления мозга после нейротравм, ишемических инсультов и при различных нейродегенеративных заболеваниях. Клетки пуповинной крови человека представляют собой один из наиболее доступных ресурсов стволовых клеток с минимальной иммуно генной реакцией реципиента. МКПК легко поддают ся культивированию, трансфекции плазмидными и вирусными векторами и способны экспрессировать рекомбинантные гены с высокой эффективностью [98–100]. Генетическая модификация МКПК для доставки терапевтических генов, бесспорно, от крывает новые возможности для стимулирования нейрорегенерации. Полученные на сегодняшний день результаты по трансплантации генетически модифицированных мононуклеаров пуповинной крови экспериментальным животным указывают на целесообразность их применения не только как носителей терапевтических генов, но и как источника различных факторов роста и камбиальный резерв эндотелиальных и глиальных клеток на период восстановления.

Подняться вверх сайта