Поиск Кабинет

Гемопоэтические стволовые клетки с индуцированным апоптозом эффективно подавляют рост клеток глиомы in vitro, но запускают новый механизм образования опухолевых стволовых клеток.

Гены & Клетки: Том IX, №4, 2014 год, стр.: 70-75

 

Авторы

Брюховецкий И.С., Мищенко П.В., Толок Е.В., Хотимченко Ю.С., Зайцев С.В., Брюховецкий А.С.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Присутствие гемопоэтических стволовых клеток в культуре угнетает пролиферацию опухолевых клеток. Мы предположили, что предобработка стволовых клеток индукторами апоптоза повысит их противоопухолевую эффективность. Целью работы являлась характеристика способности стволовых клеток с индуцированным апоптозом эффективно подавлять рост и вызывать гибель опухолевых клеток in vitro. Использованы культуры глиомы линии С6 и гемопоэтические (CD34+/CD45+) стволовые клетки человека. В качестве индуктора апоптоза был использован дексаметазон. Доказано, что гемопоэтические стволовые клетки с индуцированным апоптозом более эффективно подавляют рост и вызывают гибель клеток глиомы С6, чем нативные стволовые клетки. В процессе межклеточного взаимодействия наблюдается феномен слияния стволовых и опухолевых клеток, который очевидно является одним из механизмов формирования новых опухолевых стволовых клеток.

Введение

Применение различных видов стволовых клеток (СК) в комплексном лечении рака и других злокачественных опухолей в 60-х годах 20-го века стало революционным научным событием. Сегодня они широко применяются для реконструкции кроветворной системы после химиотерапии, коррекции иммунодефицитных состояний, создания противоопухолевых вакцин, цитотоксических лимфоцитов и дендритных клеток. Перспективным направлением использования СК является направленный транспорт лекарственных веществ непосредственно в опухолевый очаг и создание генетически модифицированных клеток. Но чем шире становится спектр клинического применения СК, тем острее встает вопрос об их истинной роли в развитии злокачественных новообразований [1–3].

С одной стороны, роль СК в развитии злокачественных опухолей можно считать доказанной. Накоплены и систематизированы весомые аргументы в пользу развития глиом от собственных нейральных стволовых и прогениторных клеток головного мозга человека [4]. Сформулирована концепция опухолевых или раковых СК, обоснована роль СК в процессах метастазирования злокачественных опухолей. Не менее показателен тот факт, что большинство линий опухолевых клеток для экспериментальной онкологии получены путем индукции канцерогенеза именно у беременных животных [5–7].

С другой стороны, противоопухолевые свойства СК также были неоднократно доказаны. Основными механизмами их противоопухолевого действия является миграция в опухолевый очаг, межклеточные и межсистемные взаимодействия в зоне неоплазии, «by stander effect», обмен цитокинами и информационными молекулами [8–10].

Очевидно, правильный выбор вектора модификации, в ту или иную сторону, определяет информационную направленность взаимодействия СК и опухолевых клеток, что является стратегически важной задачей при создании новых антиметастатических и противораковых клеточных препаратов. В свою очередь, количество СК является одним из не менее важных параметров тканевого гомеостаза. Непрерывное образование, миграция, межклеточное взаимодействие и гибель нейробластов в мозге представляет собой одну из комплексных саногенетических программ. Интенсивность нейрогенеза в мозге ослабевает по мере старения организма, уменьшается количество здоровых нейральных СК, они накапливают мутации, снижается их регуляторный потенциал, что отчасти объясняет преобладание глиом у пожилых пациентов [12].

С этих позиций восполнение числа СК и усиление их регуляторных противоопухолевых свойств может существенно повысить эффективность лечения глиальных опухолей. Однако столь «механический» подход к решению вопроса не является продуктивным, поскольку не ясна конечная судьба СК, вводимых в организм больного. Только четкое и однозначное понимание этого вопроса позволит прогнозировать степень безопасности и эффективности потенциального клеточного препарата. Нашей научной группой была предложена идея создания систем СК с индуцированным апоптозом. В серии экспериментов предобработка СК лектинами из группы рибосом-инактивирующих белков II типа (рицин и вискумин) позволила достичь элиминации 50% клеток глиомы С6, однако их стереотаксическое введение в головной мозг животного с опухолью сопровождалось массивной гибелью нейронов, глиоцитов и опухолевых клеток с выраженной глиомезодермальной реакцией, ведущей к увеличению объема неопластического узла [13].

Массивный инструктивный апоптоз, сравнимый с внутримозговым введением рицина, запускал мощные пролиферативные процессы, которые быстро восполняли объём неопластического узла. По всей видимости, создание биопрепаратов на основе СК с индуцированным апоптозом для лечения глиальных опухолей требует еще более тонкого и сбалансированного подхода.

На сегодняшний день мы завершили первый этап исследований по сравнительному протеомному картированию и биоинформационному анализу лизатов нейральных (СD133+) СК, выделенных из обонятельной выстилки носа человека, мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК, CD29+/CD44+/CD73+/CD90+/СD34–) костного мозга человека и опухолевых СК (CD133+) глиобластомы человека линии U87 [14]. Наибольшая степень протеомных отличий свойственна ММСК костного мозга. Это позволяет предположить, что они сохранили естественный циторегуляторный потенциал.

Ряд специализированных онкологических учреждений в России и за рубежом на протяжении ряда лет успешно используют препарат мобилизованных в периферическую кровь мононуклеаров, основу которого составляют гемопоэтические СК (ГСК) [15]. Данные сравнительного исследования протеомных профилей ГСК позволяет предположить, что трансплантация этого типа клеток уже сегодня может быть инструментом повышения эффективности стандартных схем лечения глиальных опухолей головного мозга. Обработка клеток дексаметазоном – наиболее мягким, физиологическим индуктором апоптоза в клетках лейкоцитарного ряда, позволяет получить индуцированные в данном направлении «регуляторные» ГСК.

Цель работы состояла в оценке способности стволовых клеток с индуцированным апоптозом эффективно подавлять рост и вызывать гибель клеток глиальной опухоли in vitro.

Материал и методы

Культура клеток глиомы С6

Культура клеток глиомы С6 была предоставлена лабораторией фундаментальной и прикладной нейробиологии Государственного научного центра им. В.П. Сербского МЗ РФ. По спектру белков и палитре генетических нарушений она наиболее близка к мультиформной глиобластоме человека и характеризуется самым большим количеством опухолевых СК среди доступных экспериментальных моделей [7]. Клетки размораживали при 37°С в течение 10 мин. и отмывали от DMSO в среде DMEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS) и антибиотик-антимикотик «100X» (Gibco, США). Клетки осаждали центрифугированием, добавляли свежую среду, ресуспендировали и высаживали в культуральные флаконы.

Культивирование продолжали до образования монослоя, снимали с помощью ферментативной диссоциации (0,05% trypsin-EDTA, 1:4, при 37°С, 10 мин.), центрифугировали (120g, 3 мин.), добавляли свежую среду, ресуспендировали, обрабатывали маркером Vybrant® CFDA SE Cell Tracer (Molecular Probes, США) и использовали для проведения эксперимента.

Мобилизованные ГСК

Препарат ГСК предоставлен «Клиникой восстановительной и интервенционной неврологии и терапии «Нейровита» (Москва). Описание иммунологических особенностей клеточного препарата было представлено ранее [15].

Клетки получены от мужчин 46 и 52 лет, проходивших курс лечения по поводу онкологических заболеваний. С целью увеличения количества ГСК в периферической крови донор получал 8 инъекций гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ, Филграстим) с интервалом 12 ч. в течение 4 дней. В первые три дня доза Г-КСФ составляла 2,5 мкг/кг массы тела, а в последний день была удвоена.

Клетки с фенотипом CD34+/CD45+ получали из периферической крови пациента с помощью аппарата COBE® Spectra Apheresis System (Terumo, США). Содержание мононуклеарных клеток с маркером клеточной поверхности CD34+/CD45+ в препарате составляло 1,2%. Пациенты подписывали добровольное информированное согласие на использование клеток в исследовательских целях. После разморозки клетки культивировали 24 ч. в среде DMEM с 10% содержанием фетальной телячьей сыворотки, фактора роста фибробластов, эпидермального фактора роста, антибиотика-антимикотика «100Х» (10,000 уд.ед/мл пенициллина, 10,000 мкг/мл стрептомицина и 25 мкг/мл фунгизона (Gibco, США). Далее, клетки осаждали центрифурованием, окрашивали CellTracker™ Red CMTPX (Molecular Probes, США) и использовали для проведения эксперимента.

ГСК с индуцированным апоптозом

В качестве агента, индуцирующего апоптоз (пертурбогена), был использован раствор дексаметазона (KRKA, Словения). Как мы отмечали выше, дексаметазон является наиболее физиологичным индуктором апоптоза в клетках лейкоцитарного ряда. ГСК в количестве 0,5×106 инкубировали 60 мин. в двух миллилитрах бессывороточной среды DMEM (Gibco, США), содержащей 5 мкг/мл дексаметазона, при 37°С и содержании CO2 6%. После обработки клетки осаждали и отмывали 0,9% стерильным раствором хлорида натрия.

Дизайн эксперимента

Исследование одобрено Комиссией по биомедицинской этике Школы биомедицины ДВФУ (протокол № 11 от 01.08. 2014).

24-луночные планшеты (Greiner Bio-One, Австрия) заполняли средой DMEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, фактор роста фибробластов, эпидермальный фактор роста и антибиотик-антимикотик «100Х» (Gibco, США). Часть лунок планшета заполняли интактными ГСК в количестве 0,5×106, в оставшиеся лунки вносили по 0,5×106 ГСК, предобработанных дексаметазоном. Лунки второго планшета заполнялись окрашенными флуорохомным красителем клетками глиомы в количестве 0,5×106. Часть культур использовалась в качестве контроля. Нативные ГСК и клетки с индуцированным апоптозом вносили в лунки культурального планшета, формируя ко-культуры. Соотношение опухолевых клеток и ГСК в сочетанных культурах составило 1:1, 1:2 и 1:3 Клетки инкубировались при температуре 37°С и 5% СО2 в течение 120 ч. в автоматическом режиме с использованием системы непрерывного наблюдения за живыми клетками Cell-IQ (CM-Technologes, США).

Специальные методы исследований

В работе использованы: система визуализации живых клеток LSM 5 (Karl Zeiss, Германия), конфокальный лазерный сканирующий микроскоп LSM 710 (Carl Zeiss, Германия), система глубокого оптического имиджинга биоматериалов FluoView FV 1200MPE (Olympus). Определение жизнеспособности ГСК проводили методом проточной цитофлуориметрии на аппарате Cytomics FC 500 (Beckman Coulter, США) с использованием набора SYTOX® Green Dead Cell Stain (Molecular Probes, США). Для работы с изображением применялись программы 3D for LSM Version 1.4.2 и ImageJ (США). Статистическую обработку проводили с помощью программы MS Excel (2010). Оценку статистической значимости различий проводили с применением двухвыборочного t-критерия Стьюдента.

Результаты

Спустя 120 ч. наблюдения число интактных ГСК в контрольной культуре несколько возросло, что очевидно было вызвано пролиферацией. При этом некоторая часть клеток под влиянием коктейля факторов роста подвергались дифференцировке и распластывались по дну культурального планшета.

В свою очередь количество живых клеток в культуре ГСК с индуцированным апоптозом существенно уменьшилось. Анализ морфологии ГСК с использованием SYTOX® Green Dead Cell Stain подтвердил фрагментацию 34,5±15% от общего числа ядер. Клетки, предобработанные дексаметазоном, имели выраженные признаки дезорганизации цитоскелета, неровные контуры цитоплазмы, содержали фрагментированные ядра, что указывало на развитие поздней стадии апоптоза (рис. 1).

ГСК и опухолевые клетки в сочетанных культурах активно флуоресцировали в свете лазеров двух типов (рис. 2А, Б). Через 24 ч. в цитоплазме опухолевых клеток стали отмечаться накопления флуоресцентного красителя CellTracker™ Red CMTPX, который изначально был связан с цитоплазматическими белками ГСК (рис. 3А). Очевидно, что при совместном культивировании может происходить обмен внутриклеточными белками, механизм которого пока недостаточно понятен. Возможно участие в этом процессе каких-то транспортных посредников, либо белки ГСК способны выходить во внеклеточное пространство и захватываться опухолевыми клетками.

Через 48 ч. эксперимента включения красного флуорохрома содержались в цитоплазме всех опухолевых клеток, а через 72 ч. все клетки глиомы в сочетанных культурах активно флуоресцировали в полосе аргонового лазера с λ = 546 нм, что было вызвано накоплением в них белков, окрашенных CellTracker™ Red CMTPX. Данное явление было одинаково выраженным в сочетанных культурах с нативными ГСК и ко-культурах, содержащих ГСК с индуцированным апоптозом. Выраженность феномена не зависела от исходного соотношения клеток (рис. 3Б). Спустя 120 ч. опухолевые клетки в ко-культурах с нативными ГСК и клетками с индуцированным апоптозом отвечали флуоресценцией на воздействие лазеров с длиной волны 488 и 546 нм (рис. 4 А, Б).

Клетки глиомы в контрольной культуре прикреплялись по дну планшета, интенсивно пролиферировали, образовывали многочисленные отростки и формировали монослой. Напротив, в сочетанных культурах с ГСК опухолевые клетки, накопившие красный краситель, были округлой, овальной и неправильной полигональной формы, напоминающей яичницу-глазунью. Клетки практически не прикреплялись ко дну планшета, что очевидно было прямым следствием взаимодействия с ГСК.

Подсчет живых, интенсивно флуоресцирующих морфологических элементов подтвердил существенную разницу в количестве опухолевых клеток в сочетанных культурах (рис. 5 А–В).

ГСК с индуцированным апоптозом в соотношении с опухолевыми клетками 1:1 достоверно подавляли рост опухолевых клеток по сравнению с контролем (t-критерий 4,4) и нативными клетками (t-критерий 3,1). Выявленная динамика сохранялась при соотношении опухолевые клетки/ГСК с индуцированным апоптозом 1:2, но характеризовались меньшей репрезентативностью по сравнению с нативным клетками.

При совместном культивировании опухолевых клеток и ГСК в соотношении 1:3 фаза логарифмического роста опухолевых клеток смещалась во времени, но наблюдаемые различия в противоопухолевых свойствах нативных ГСК и клеток с индуцированным апоптозом нельзя назвать достоверными. Очевидно, что имеет место некий качественно-количественный переход, амортизирующий регуляторное влияние воздействующих клеток.

Обсуждение

Феномен направленной миграции СК в опухолевый очаг проливает свет на ряд важных аспектов патогенеза злокачественных новообразований. Принято считать, что высвобождение из поврежденных тканей фактора стромальных клеток (SDF-1α), фактора стволовых клеток (SCF), фактора роста гепатоцитов (HGF) и ряда других лигандов ведет к активизации соответствующих рецепторов клеточной поверхности ГСК, что стимулирует их пролиферацию, выход из депо в костном мозге и миграцию в область повреждения.

Далее, взаимодействуя с локальным микроокружением опухолевого очага, ГСК и другие регуляторные клетки угнетают пролиферацию опухолевых клеток, подавляют процессы эпителиально-мезенхимального перехода, препятствуя метастазированию, и напрямую индуцируют клеточную смерть, стимулируя рецепторные белки CD 95, DR3, DR4, RD5. Но это только один из возможных сценариев процесса межклеточной коммуникации в патологическом очаге. Как удалось установить, источником хемокинов могут быть непосредственно опухолевые клетки [16]. В этом ключе, наблюдаемый переход красителя, связанного с белками цитоплазмы ГСК, в клетки глиомы только отчасти можно объяснить формированием структурного и функционального синцития, намного вероятнее их слияние с клетками глиомы. Слияние клеток, или эффект клеточной фузии, – фундаментальный биологический процесс, который является ключевым компонентом полового размножения, наблюдается при построении костей, плаценты и мышечных волокон, описан в патогенезе ряда инфекций. Процесс состоит из трех принципиальных этапов: компетенция (клеточная индукция и дифференцировка), взаимодействие (детерминация, миграция и адгезия) и слияние мембран с цитоплазматическим смешиванием [17–19].

Поскольку спустя 120 ч. мы практически не обнаруживали ГСК, то изменение морфологии опухолевых клеток и накопление в их цитоплазме чужеродных белков, вероятно, вызвано именно слиянием взаимодействующих клеток.

С определенной долей вероятноcти можно утверждать, что посредством этого механизма происходит обмен дефектными белками, что ведет к нарушениям эпигенетической регуляции экспрессии генов. Грубые нарушения процесса метилирования ДНК резко дестабилизируют геном. В свою очередь, межклеточный обмен микроРНК в результате смешивания цитоплазмы подавляют экспрессию генов онкосупрессоров: miR-34/ инактивирует ген с-Met, miR-146a/ген Notch, miR-7/ген EGFR, miR-128/ ген Bmi1, miR-195/ген E2F3, ген СCND3 – и стимулируют активность онкогенов miR-21/ген RECK, miR-26a/ген PTEN и ген RB1, miR-221 и miR-гены 222/p27Kip1, PTPμ, PUMA [20]. В результате образуется клетка-гибрид с мощными функциями стволовой и опухолевой клеток, возможно, новая опухолевая стволовая клетка (рис. 6).

Обработка ГСК дексаметазоном индуцирует в них апоптоз, мягко модифицирует протеом путем накопления в цитоплазме специфических белков (Bcl-x-s, Bax , Bad, Bag, p53, p 21, ced-3, IL-1β), но не исключена секреция индуцированными клетками специфических лигандов. Данный эффект оптимально выражен при соотношении взаимодействующих клеток 1:1, по мере увеличения количества ГСК становится не так очевиден, что вероятно объясняется спецификой процессов межклеточных взаимодействий, либо запуском более сложных процессов, таких как слияние клеток.

Исследование позволяет сделать ряд выводов:

– обработка ГСК фенотипа CD34+\CD45+ дексаметазоном позволяет получить культуру клеток с мягко индуцированным апоптозом;

– ГСК с индуцированным апоптозом, кокультивированные с опухолевыми клетками в соотношении 1:1 и 1:2, достоверно, по сравнению контролем и нативными клетками, подавляют рост глиомы С6 и вызывают их гибель in vitro.

Безусловно, описанная технология имеет определенные клинические перспективы, но ее путь в клинику не представляется простым и очевидным. Можно предположить, что ГСК или другие регуляторные клетки, «нагруженные» индукторами апоптоза в форме нанокапсул с заданными параметрами биодеградации, будут более эффективны in vivo в отношении новообразований глиального ряда, чем просто апоптоз-индуцированные клетки. Нельзя исключить усиление противоопухолевого эффекта регуляторных клеток при комбинированном введении с модуляторами апоптоза (гифитиниб и др.). Резистентность к физиологическим регуляторным сигналам – один из важнейших признаков опухолевых клеток. Результаты эксперимента позволяют предположить, что оставаясь резистентными к ординарным, физиологическим сигналам опухолевые клетки остаются способны воспринимать сильные регуляторные воздействия. Наблюдаемый феномен слияния клеток, очевидно, представляет собой один из возможных механизмов образования новых опухолевых стволовых клеток.

Подняться вверх сайта