Поиск Кабинет

Функции культивируемых эмбриональных клеток на коллаген-хитозановой матрице

Гены & Клетки: Том IV, №2, 2009 год, стр.: 55-62

 

Авторы

Еремеев А.В., Светлаков А.В., Большаков И.Н., Власов А.А., Арапова В.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Восстановление поврежденных тканей является одной из важнейших проблем лечения пациентов с обширными и глубокими ожогами, трофическими язвами, другими травматическими повреждениями. Есть предположение, что разработанные ранее коллаген-хитозановые матрицы, содержащие гликозами-ногликаны и факторы роста, и применение их с мультипотент-ными клетками позволят создать дермально-эпидермальный эквивалент кожи. В связи с этим поставлены задачи оценить пролиферативную и метаболическую активность эмбриональных фибробластов крысы в различных условиях культивирования на раневом коллаген-хитозановом покрытии «Коллахит-бол», Iпатенты РФ № 2252787, № 2254145).

Тканевая инженерия развивается как альтернативная стратегия по отношению к ксено- и аллотрансплантатам, которые имеют естественные ограничения к использованию, например, в результате выявления различных осложнений у донора, риска передачи инфекционных заболеваний и иммунных реакций отторжения у реципиента. Основной стратегией в тканевой инженерии является использование высокопористых подложек, которые могут служить средствами доставки клеток и/или факторов роста, конечной целью которых является замещение поврежденных или патологически измененных органов и тканей. Цель тканевой инженерии — дать возможность клеткам, способным к запуску и поддержке процесса регенерации, «включиться», возможно, посредством факторов роста или специфических морфогенов таким образом, чтобы сформировать новую функциональную ткань необходимого типа. Это может быть достигнуто с помощью подложки или матрицы, создающей геометрическую архитектурную форму новой ткани, которая затем может быть внедрена в организм конкретного пациента, или, при индустриальных масштабах, ex vivo (в биореакторе), с последующим повторным внедрением реконструированной ткани пациенту. Этим характеристикам отвечает разработанная авторами настоящей работы коллаген-хитозановая конструкция «Коллахит-бол».

Работы в области создания биосовместимых матриц для культивирования и трансплантации широко ведутся по всему миру. В частности показана возможность использования полимеров гидроксимасляной кислоты для культивирования эмбриональных фибробластов мыши [1], коллагена для культивирования фибробластов человека [2]. Активно ведутся исследования и в области хитиновых полимеров для культивирования дермальных фибробластов человека [3]. Ряд зарубежных биотехнологических компаний уже выпускает коммерческие клеточные продукты для терапии повреждений кожи. В большинстве случаев используется коллагеновая подложка. Компания Genzyme Biosurgery (США) выпускает продукт Epicel, представляющий собой коллагеновую мембрану с кератиноцитами, Organogenesis Inc — выпускает Apigraft с аллогенными фибробластами и продукт VCT01 дополнительно с кератиноцитами. Более 10 компаний в Европе также производят клеточные продукты. Fidia (Италия) производит матрицу на полигиалуроно-вой основе с кератиноцитами — Hyalograft, Xcellentis (Бельгия) выпускает гидрогель с аутокератиноцитами. Как правило выпускаемые продукты выполняют функцию клеточного носителя и, по большей части, не содержат добавок в виде факторов роста и/или диффе-ренцировки.

Нет производства матриц, направленных на культивирование и дифференцировку стволовых клеток различного генеза. Наиболее близким техническим решением является матрица, которая по составу [4] представляет собой субстрат с развитой поверхностью на основе коллагена или желатина, или деминерализованного костного матрикса, который производится в форме геля, измельченной губки, пленки и трехмерной конструкции, соответствующей дефекту соединительной ткани. Дополнительно в матрицу включают адгезионные белки, выбранные из группы интегрин, фибронектин, ламинин, в концентрации от 0,1 до 100 мкг/мл, антисептики, выбранные из группы ионов металлов серебра, меди, золота, и антибиотики широкого спектра действия, факторы роста фибробластов, и/или трансформирующий фактор роста (ТФР— и ТФРр ), и/или фактор роста, выделяемый тромбоцитами, и/или фактор роста гепато-цитов в концентрации от 1 до 300 нг/мл. Кроме того, матрица содержит клеточные культуры мононуклеаров костного мозга и (или) мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, и (или) фибробластов человека. Известные матрицы из полилактата, коллагена и полиэтиленгликоля [5] не имеют высоких гидрофобных и адгезионных свойств из-за отсутствия заряженных групп на поверхности биополимерной конструкции, что снижает прикрепление клеток к поверхности матрицы, трансплантаты готовят непосредственно перед использованием путем перемешивания всех компонентов. Учитывая, что коллаген является природной матрицей для культивирования клеток и, то, что хитозан также является приемлемым субстратом мы предположили, что сочетание этих двух полимеров с включенными в него микродобавками — гликозаминогликанами и низкомолекулярным фактором роста «Адгелон», позволит культивировать дермальные эмбриональные фибробласты и дифференцировать мультипотентные стромальные клетки жировой ткани. Это может позволить создать трансплантат, который можно переносить непосредственно в качестве прямого трансплантата вместе с матрицей без процедуры обработки клеточной массы ферментами, которые повреждают поверхностные рецепторы при переносе.

В этой связи целью работы была оценка возможности стабильного культивирования и пролиферативной активности дермальных фибробластов крысы и мультипотентных клеток жировой ткани крысы на новом классе конструкций, в основе которых лежит коллаген-хитозановый комплекс, сульфатированные и несульфатированные гликозаминогликаны (хондроитинсульфат, гиалуронат, гепарин). Обязательными условиями в исследовании ставился анализ цитотоксичности материала по исследованию пролиферативной активности клеток на матрице, исследование влияния на физиологические функции обработки клеток ферментами при их пассировании в питательной среде и при дальнейшем их культивировании на коллаген-хитозановом комплексе.

Материал и методы

В качестве подложки для культивирования эмбриональных клеток и получения клеточной матрицы с целью трансплантации использовали коллаген-хитозановую конструкцию, состоящую из 2% раствора ацетата коллагена (Белкозин, РФ), 2% раствора аскорбата хитозана молекулярной массы 100^700 кДа и степенью дезаце-тилирования свыше 95%, содержащего в своем составе на 1 г сухого хитозана аскорбиновую кислоту — 1,8 г, хондроитинсерную кислоту (Sigma-Aldrich, США) — 5^ 100 мг, D-глюкуроновую кислоту (Sigma-Aldrich, США) — 10^100 мг, гепарин (Sigma-Aldrich, США) — 2,5^5 мг и сывороточный фактор роста крупного рогатого скота (Адгелон) — 11^220 мкг.

При использовании губчатых матриц «Коллахит-бол» [6, 7] последние предварительно замачивали в стерильном бикарбонатном буфере для понижения их кислотных свойств. После фазы нейтрализации покрытия промывали трижды стерильным фосфатным буфером Дульбек-ко (Биолот), помещали во флаконы, а сверху осторожно наслаивали на них суспензию клеток в среде со всеми компонентами в зависимости от типа клеток.

Эмбриональные фибробласты крысы

Первичную культуру эмбриональных фибробластов получали из кожи 19^20 дневных фетусов беспородных крыс, которую предварительно рестриктировали и помещали в питательную среду во флаконах. Культивирование клеток проводили при 37°С в среде ДМЕМ (Sigma-Aldrich, США) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки коров (ЭСК)(Sigma-Aldrich, США), 100 мкг/мл канамицина сульфата (Минмедбиопром, РФ), 1мМ L-глутамина (Sigma-Aldrich, США). Среду на 3-и сут. собирали, фильтровали через 0,22 мкм аце-тат-целлюлозный фильтр и в дальнейшем использовали в качестве кондиционированной среды. Пересев клеток на новые культуральные «матрасы» проводили с помощью раствора Версена (Биолот, РФ) при достижении клеточного монослоя. Далее клетки переносили на предварительно подготовленную коллаген-хитоза-новую конструкцию «Коллахит-бол» с вышеуказанным составом. Для оценки пролиферативной активности клетки в фазе роста переводили в состояние покоя после трехкратной отмывки чистой средой и переносом в среду, содержащую 0,2% ЭСК. В этой среде клетки находились 3 сут. [8]. Срок инкубации клеток в среде с низким содержанием сыворотки в течение 3 сут. считался достаточным для получения покоящихся клеток (за 24 ч инкубации 3^7% клеток включали 3Н-тимидин). Стимуляцию клеточной пролиферации проводили путем смены среды на свежую, содержащую 10% ЭСК и 3Н-тимидин (3,7 кБк/флакон). Клетки культивировали в течение 16 ч, после чего снимали с подложки раствором Версена, наносили на фильтры GF, последовательно промывали фосфатным буфером, 5% ТХУ, 95% этанолом. Включившуюся радиоактивность просчитывали в толуольном сцинтилляторе на счетчике «Бета-1».

Стромальные клетки жировой ткани крысы

В экспериментах по использованию стволовых (мультипотентных) клеток крысы (клетки из подкожной жировой ткани молодой крысы после ее диспергирования и обработки 0,5% раствором коллагеназы в течение 30 мин.) для наращивания клеточной биомассы использовали среду ДМЕМ с добавлением 10% ЭСК, 100 мкг/мл канамицина сульфата, 1мМ L-глутамина, в которую дополнительно добавляли еще 4 нг/мл основного фактора роста фибробластов (ФРФ), 1 мМ раствора незаменимых аминокислот (Sigma-Aldrich, США). Для дифференцировки мультипотентных клеток в дермально-эпидермальном направлении их высевали на уже предварительно посаженные на коллаген-хи-тозановую конструкцию эмбриональные фибробласты кожи крысы в кондиционированную эмбриональными фибробластами среду со всеми добавками, кроме оФРФ.

Дифференцировку стромальных клеток жировой ткани оценивали иммуноцитохимическим методом. Проводилась формальдегидная фиксация с последующей иммуноцитохимией клеток с помощью антител (все антитела от Abeam, США) против рбЗ, пан-цитокератина и цитокератина-19 (эпителиальные маркеры). Выявление маркеров осуществляли согласно инструкции производителя антител. Ядра клеток окрашивали DAPI (0,1 мкг/мл) 10 мин. Для получения изображений и анализа использовали флуоресцентный микроскоп «Olympus ВХ-51» и программные продукты «Applied Spectral Imaging» (США). Для анализа каждого маркера эксперимент повторяли трижды, наращивая по три флакона, в каждом из которых случайным образом выделяли 6 зон для проведения иммуноцитохимии. Мик-роскопирование проводили по каждой зоне в 30 полях зрения.

Оценка метаболических показателей

Для оценки физиологического состояния клеток после культивирования на матрице определяли такие параметры как содержание внутриклеточного кальция и NAD(P)H, pH и микровязкость клеточных мембран.

Для этого часть крысиных фибробластов снимали с флаконов 0,25% раствором трипсина на фосфатном буфере Дульбекко и через 24, 48, 72 ч в клетках определяли апоптоз с помощью флуоресцентных красителей Hoechst 33342 и Propidium iodide (Sigma-Aldrich, США) на микроскопе Olympus ВХ51 как описано ранее с модификацией [9, 10]. Клетки снимали с флаконов или с матрицы раствором Версена, инкубировали в течение 15 мин. с красителем Hoechst 33342 (50 мкг/мл), промывали фосфатным буфером и фиксировали 20 мин в 5% растворе формальдегида. Подсчитывали 500 клеток, количество апоптотических клеток выражали как процент от общего числа клеток. Для оценки некроза окраску клеток осуществляли пропидиум йодидом. Количество некротических клеток в 100 полях зрения подсчитывали, используя флуоресцентный микроскоп. Концентрацию ионов Са2+ [11, 12], pH [13] и микровязкость мембран [14] определяли с помощью зондов Fura-2AM (2,5 мкМ) и флуоресцеина изотиоцианата изомера I (1мг/мл), пирена (ЗмкМ) соответственно (Sigma-Aldrich, США). Содержание NAD(P)H [15] определяли по его собственной флуоресценции. Измерения проводили на спектрофлоуриметре Aminco Bowman Series 2, Thermo Spectronic.

Результаты и обсуждение

Пролиферативная активность.

Первоначально исследовали кинетику пролиферативной активности в ранние сроки культивирования фибробластов крысы на коллаген-хитозановых матрицах. Для этого покоящиеся клетки высевали в 24 луночные планшеты без матрицы или с ней в среде с 3,7 кБк/мл 3Н-тимидином. Накопление метки исследовали каждые два часа в течение 16 ч (кумулятивная метка). Изучение динамики синтеза ДНК (рис.1) при стимуляции покоящихся клеток, культивируемых на «Коллахит-бол», показало, что исследуемая полимерная композиция не подавляла пролиферативную активность клеток.

Культивирование клеток на коллаген-хитозановой матрице через 16ч инкубации приводило к достоверному увеличению пролиферативной активности культуры фибробластов (Р<0,05). Исследование пролиферативной активности фибробластов на этом материале выявило стимулирующий эффект по сравнению с культивированием на пластике, что свидетельствует о наличии благоприятных условий для пролиферации и отсутствии цитотоксичности.

Апоптоз

Посев эмбриональных фибробластов крысы на матрицы вызывал их апоптоз в культуре через 24 ч (52% апоптотических клеток). До обработки число клеток в состоянии апоптоза составляло 16% (Р<0,05). В дальнейшем происходило уменьшение числа апоптотических клеток; через 48 ч до 36%, а через 72 ч до 8% (Р<0,05) (табл. 1). Количество клеток в состоянии апоптоза на 9-е сут. при этом уменьшалось практически до 0%. Доля клеток в состоянии некроза практически не менялась на протяжении всего эксперимента и составляла в среднем 10%.

Большой процент клеток в состоянии апоптоза, вероятно, связан со стрессом при пересеве клеток из различных условий и воздействием процедуры обработки раствором Версена.

Очевидно, что динамика таких показателей как Са2+, активные формы кислорода и pHin характеризует изменение функционального состояния клеток в ходе культивирования на матрицах. Поэтому одной из вспомогательных задач нашего исследования было определение показателей клеточного метаболизма.

Уровень внутриклеточного кальция

Известно, что внутриклеточный кальций является одним из вторичных мессенджеров, регулирующих процессы пролиферации, дифференцировки, апоптоза и др. [16^23]. С другой стороны, известно, что нейтрализация кислородных радикалов подавляет пролиферацию [24]. Более того, показано, что активные формы кислорода выступают в роли посредника между внеклеточным сигналом и внутриклеточными эффекторами. Именно они определяют уровень окислительно-восстановительного потенциала в клетке, регулирующего клеточный метаболизм, в том числе, уровень экспрессии генов [25].

Важнейшим свойством двухвалентных металлов, в первую очередь, кальция и магния является их способность взаимодействовать с отрицательно заряженными фосфатными остатками ДНК. При этом наибольшей аффинностью к ДНК обладает именно Са2+ [21]. Его взаимодействие с ДНК приводит к компактизации (фол-дингу) хроматина, стабилизирует изолированные митотические хромосомы. Связывание кальция хелатными агентами приводит к нарушению прогрессии митоза, например, блокирует сепарацию сестринских хроматид в конце метафазы [19]. Увеличение концентрации внутриклеточного кальция — стимул к возобновлению клеточного цикла при оплодотворении [18, 26]. Свидетельства в пользу роли кальция в митозе получены многими исследователями [18, 22], в частности велика его роль при переходе из метафазы в анафазу [18,20, 27]. Периодические изменения концентрации кальция во время клеточного цикла стимулируются ассоциированными с клеточным циклом изменениями Са2+-мобилизирую-щего ИН03ИТ0Л-С1, 4, 5)-трифосфата [28]. Искусственно вызванное увеличение концентрации кальция ускоряет переход в митоз [29].

Было установлено, что до культивирования клеток концентрация Са2+ в фибробластах была 12,4 нМ, а через 24 ч инкубации увеличивалась до 67нМ (Р<0,01), возможно, вследствие интенсификации апоптотических процессов (табл. 2). Однако на 3-е сут., несмотря на то, что количество клеток в состоянии апоптоза все еще оставалось достаточно большим, концентрация Са2+ в клетках была сравнима с контролем и составляла 12,3 нМ. При дальнейшем инкубировании фибробластов на матрицах содержание кальция в клетках не менялось (около 5 нМ).

Внутриклеточный уровень pH

Величина pHin регулирует активность факторов, контролирующих экспрессию генов и клеточный цикл. Доказано, что снижение pHin тормозит GJM переход клеточного цикла, а его повышение, наоборот, активирует [30, 31]. №+/Н+-обменник регулирует гомеостаз внутриклеточной pH и обладает разрешающим эффектом на запуск клеточной пролиферации [21]. Активация №+/Н+-обменника и возрастание pHin — ранние универсальные механизмы, ответственные за митогенную стимуляцию [32]. Стимуляция Na+/H+ обмена всегда приводит к защелачиванию, и, как следствие, в покоящихся клетках возникают рост-индуцирующие факторы [31]. Активированный белок р21 в отличие от неактивированного вызывает в мышиных фибробластах морфологическую трансформацию и клеточную пролиферацию, сопровождающуюся увеличением pHin [33]. Имплантация иммуннодефицитным мышам клеточной линии с мутациями №+/Н+-обменника вызывает опухолевый рост [34].

Механизм, обеспечивающий внутриклеточное заще-лачивание, — ключевое событие в онкогенной трансформации, который необходим для развития и поддержания трансформированного фенотипа [30], поэтому контроль за внутриклеточной pH существенен с точки зрения возможности дальнейшего использования клеток, подвергавшихся культивированию на матрицах [35, 36].

За 24 ч культивирование на матрицах «Коллахит-бол» вызывало закисление в фибробластах, однако pH восстанавливалась до контрольного значения на 3-и сут. (табл. 3). Небольшого увеличения pHin достаточно для запуска перехода G2/M.

Уровень окислительно-восстановительных реакций

Окислительно-восстановительный статус — один из рычагов, управляющих деятельностью клетки. Его состояние быстро и обратимо меняется при действии малых окисляющих молекул, к которым относятся активные формы кислорода (АФК). АФК образуются во всех типах клеток и как побочные продукты общего метаболизма, и как продукты деятельности специализированного ферментативного комплекса NADPH-оксидаза. В малых концентрациях (мкМ) АФК модулируют те же клеточные функции, что и многие естественные активаторы (рост, пролиферация, секреция, локомоция, фагоцитоз, синтез белков). При этом АФК действуют на те же звенья каскада сигналов, что и естественные активаторы, в частности на активность тирозинкиназ, фосфолипаз, MAP-киназ, ионных каналов плазматической мембраны и саркоплазматического ретикулума, на фосфорилиро-вание белков по тирозину, концентрацию внутриклеточного Са2+, pH. Известно, что при изменении стационарных уровней АФК меняется соотношение окисленных и восстановленных форм глютатиона, NAD(P) +/NAD(P)H, FAD/FADH2, тиоредоксина и других «ред-окс»-активных соединений в клетке, при том, что многие регуляторные пути и каскады зависят от «ред-окс» потенциала цитоплазмы и окружающей клетку среды [37,38]. Сам «ред-окс» потенциал определяется балансом окислительно-восстановительных эквивалентов в динамическом равновесии, основную роль в котором играют 2 пары — NAD+/NADH и NADP+/NADPH, а метаболические волны NAD(P)H ответственны за реализацию передачи межклеточных сигналов [15] через образование АФК. Кроме того, высокий уровень АФК ответственен за активацию ядерного фактора транскрипции NF-kB [39]. Суммируя все вышесказанное, можно утверждать, что при определенных условиях АФК способствуют клеточной пролиферации и могут запускать процесс апоп-тоза, а в других — активировать пролиферативные процессы. АФК в малых концентрациях модулируют клеточные функции, они образуются в клетках как побочные продукты общего метаболизма и деятельности NADPH-оксидазы.

Исследования показали, что культивирование эмбриональных фибробластов крысы на матрицах «Коллахит-бол» в течение первых 24 ч не приводило к значительному увеличению содержания NAD(P)H в клетках (табл. 4). В течение следующих 48 ч содержание NAD(P)H практически не менялось и было сравнимо со значением в контрольных фибробластах. Однако на 4-е сут. содержание NAD(P)H уменьшалось, что указывало на увеличение количества АФК в фибробластах.

Микровязкость клеточных мембран

При инкубации фибробластов на матрицах микровязкость белок-липидных контактов была выше, чем в контроле (0,040±0,002 отн. ед. и 0,034±0,002 отн. ед. соответственно, Р<0,05), что могло приводить к ингибированию мембранных ферментов. 24- и 48-часовая инкубация фибробластов на коллаген-хитозановом комплексе приводила к сопровождающему пролиферацию уменьшению жесткости липидного бислоя мембран (0,12±0,01 отн. ед.) по сравнению с контролем (0,1 В =±= 0,01 отн. ед., Р<0,05). Однако уже через 72 ч из-за увеличения уровня АФК и интенсификации пере-кисных процессов жесткость липидного бислоя мембран фибробластов увеличивалась до 0,15±0,01 отн. ед., Р<0,05.

Таким образом, нанесение эмбриональных фибробластов на эту биополимерную конструкцию сопровождается в первые 24 ч культивирования метаболическим сдвигом и увеличением их апоптотической активности. На 3-и сутки культивирования на коллаген-хитозано-вой губке снижается уровень апоптоза. Это свидетельствует об отсутствии цитотоксической реакции. Через 3 сут. культивирования эмбриональных фибробластов на коллаген-хитозановой губке основные физиологические показатели клеток: концентрация внутриклеточного кальция, pH, NAD(P)H, вязкость мембран возвращаются к норме.

Роль кондиционированной среды в регуляции дифференцировки клеток

Известно, что культивируемые клетки секретируют в среду различные факторы (в том числе и ростовые), поддерживающие пролиферативную активность или состояние дифференцировки клеток. Использование кондиционированной клетками среды в качестве добавки к матрице может дать предпосылки для создания подложек для культивирования клеток разных типов, в том числе и стволовых. Для проверки этого предположения при культивировании фибробластов каждые 3-и сут. отбирали среду ДМЕМ со всеми добавками. Эту кондиционированную среду пропускали через фильтр 0,22 мкм, затем переносили во флакон с матрицей «Коллахит-бол». В эту систему затем высевали эмбриональные фибробласты крысы (рис. 2,3).

Морфология культивируемых на коллаген-хитозановой матрице и в кондиционированной среде фибробластов идентична морфологии клеток, растущих на этих подложках и в свежей среде ДМЕМ.

На следующем этапе было выявлено, что коллаген-хитозановая конструкция является благоприятной матрицей для культивирования и направленной дифференцировки стволовых клеток, выделенных из подкожно-жировой клетчатки. Совместное культивирование на раневых покрытиях эмбриональных фибробластов и стволовых клеток подкожно-жировой клетчатки крысы формирует признаки дермально-эпидермального эквивалента кожи (рис. 4,5), что может иметь прикладное значение для реконструкции пораженной или отсутствующей кожи. Подложки с клетками пригодны к прямой трансплантации без ферментных и иных обработок.

При иммуноцитохимическом анализе оценивали с помощью антител возможность стромальных клеток дифференцироваться в клетки эпителия кожи. На рис. 6 показана экспрессия маркеров рбЗ, пан-цитокератина и цитокератина-19.

Обнаружено, что через 4 сут. сокультивирования дер-мальных эмбриональных фибробластов на коллаген-хитозановом комплексе стромальные клетки жировой ткани экспрессируют эпидермальные маркеры рбЗ, панцитокератин, и цитокератин-19.

Таким образом, использование коллаген-хитозано-вого комплекса Коллахит-бол приводило к обратимым изменениям физико-химических свойств клеток. Процесс культивирования клеток на матрицах приводит к уменьшению массы клеток в состоянии апоптоза и к их пролиферации. Этот факт свидетельствует об отсутствии цитотоксической реакции при контакте с матрицами. По-видимому, целесообразно перед процедурой трансплантации с целью улучшения эффективности приживления образца использовать клетки на этапе восстановления их функций и пролиферативной активности. Совместное культивирование на коллаген-хитозановых покрытиях эмбриональных фибробластов и стволовых клеток подкожно-жировой клетчатки формирует признаки дермально-эпидермального эквивалента кожи, что может иметь прикладное значение для реконструкции пораженной или отсутствующей кожи при глубокой и обширной ожоговой травме.

Подняться вверх сайта