Поиск Кабинет

Фибробласты дермы: особенности цитогенеза, цитофизиологии и возможности клинического применения

Гены & Клетки: Том VI, №2, 2011 год, стр.: 15-26

 

Авторы

Зорина А.И., Бозо И.Я., Зорин В.Л., Черкасов В.Р., Деев Р.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В свете получения современных экспериментальных данных общая концепция о фибробластах – основных клетках рыхлых и плотных волокнистых соединительных тканей – претерпевает существенные изменения, все более отдаляясь от классических представлений. В нашем обзоре, продолжая идею определения фибробластов как сугубо фенотипической категории, мы затронули наиболее проблемные вопросы, касающиеся определения дифферона фибробластов, клеточных источников их цитогенеза, особенностей цитофизиологии, их возрастных изменений в аспекте влияния на возможности клинического применения.

До настоящего времени фибробласты – клетки функционально ведущего гистогенетического ряда рыхлой и плотной волокнистых соединительных тканей – представляют собой объект многочисленных научных исследований. Активный интерес к ним связан как со значительным количеством дискуссионных вопросов, касающихся их цитогенеза и биологии, так и с доступностью получения, культивирования и использования в различных экспериментальных моделях, а также неразрешенностью проблем восполнения глубоких и (или) значительных по площади дефектов кожи стандартными хирургическими методами. Единого мнения о клеточных предшественниках фибробластов в постнатальном периоде не сформировано, не существует достоверных критериев отнесения клеточных типов к конкретному звену фибробластического дифферона, равно как нет и представлений о возрастных изменениях и их потенциальном значении в экспериментальном и клиническом применении. Получение ответов на «проблемные» вопросы имеет принципиальное как общетеоретическое, так и прикладное значение.

Научный подход в решении любой задачи предполагает этап адекватного, объективного анализа и синтеза полученной информации. В этой связи и с учетом накопления огромного объема экспериментальных сведений о функциональных и фенотипических характеристиках фибробластов, «поведении» in vitro и in vivo, в сочетании с активным обсуждением их происхождения, возрастных аспектов изменения морфофункциональных особенностей, возникает необходимость объединения данных в единую систему, способную разрешить теоретические дискуссионные вопросы, актуальные для потенциального клинического применения фибробластов.

Цель обзора – внесение недостающих данных в современную концепцию о фибробластах в части, касающейся их цитофизиологии, изменений в возрастном аспекте и вариантов терапевтического использования на основе анализа последних экспериментальных материалов в сопоставлении с классическими представлениями.

Особенности цитогенеза и цитофизиологии фибробластов дермы

В соответствии с современными взглядами и классическими представлениями о клеточных дифферонах, процесс реализации клетками генетической информации носит непрерывный характер, в течение которого существенно изменяются их морфофункциональные характеристики. Несмотря на непрерывность цитогенеза в рамках отдельных клеточных популяций, значимым является выделение ряда его этапов – клеток одной цитогенетической линии, характеризующихся разной степенью дифференцировки, то есть обладающих специфическими, отличными от предыдущего и последующего этапов, свойствами [1].

Представления о фибробластическом диффероне, впервые сформулированные классиками отечественной гистологической школы (А.А. Максимовым, А.А. Заварзиным, Н.Г. Хлопиным), изменялись с начала XX в. до настоящего времени в направлении обогащения гистогенетического ряда, представленного изначально тремя составляющими, дополнительными звеньями, что связано с получением все новых данных о цитофизиологии и иммунофенотипе фибробластов [2].

По аналогии с периодическим законом Д.И. Менделеева – единственным в своем роде, но имеющим множество вариантов иллюстрирующих его таблиц – существует целый ряд моделей фибробластического дифферона, которые полностью укладываются в общепринятую концепцию дифферонной организации цитогенеза. Такое разнообразие вариантов связано с отсутствием унифицированных надежных маркеров клеток, входящих в состав отдельных звеньев дифферона.

Наиболее распространенной в отечественной литературе является модель дифферона, основанная на классических представлениях и современных данных о совокупности морфофункциональных характеристик и пролиферативном потенциале фибробластов [1–3]:

• полипотентные клетки-предшественницы;

• префибробласты – коммитированные клеткипредшественницы;

• юные фибробласты;

• дифференцированные фибробласты – центральное звено фибробластического дифферона.

• конечный тип клеток фибробластического дифферона:

– фиброциты;

– миофибробласты;

– фиброкласты.

Ряд зарубежных авторов, положивших в основу более детальные сведения о пролиферативном потенциале фибробластов дермы, описали две большие составляющие дифферона [4, 5, 6–8]: митотитически активные фибробласты (МФ) и постмитотические фибробласты (ПМФ). МФ, согласно результатам исследования их цитоморфологии, потенциала к делению и способности синтезировать специфические цитокины и факторы роста (TGF-β, KGF), разделяют на три последовательных этапа: МФ I, МФ II и МФ III [5]. При этом клеточный пул МФ I обладает самым высоким пролиферативным потенциалом и проходит около 25-30 клеточных делений перед дифференцировкой в клеточную популяцию МФ II. МФ II, в свою очередь, до перехода в МФ III совершают около 15–20 делений, а МФ III перед дифференцировкой в ПМФ осуществляют всего около 5–8 делений. В сопоставлении с более распространенной схемой, популяции МФ представляют собой цитогенетический ряд от префибробласта до юного фибробласта. Клеточный пул, характеризующийся отсутствием пролиферативной активности, согласно полученным биохимическим характеристикам, отражает клеточную систему «дифференцированный фибробласт-фиброцит». В пересчете на клетку, эта система, по сравнению с клеточными популяциями МФ, продуцирует в 5–8 раз больше общего коллагена и, тем самым, обеспечивает необходимое для поддержания морфофункциональной организации дермы корректное соотношение коллагена I, III и V типов [5, 7]. Выяснилось, что в коже человека соотношение клеточных популяций МФ/ПМФ постоянно и составляет 2:1 независимо от возраста человека [5]. В условиях in vitro клеточные популяции МФ и ПМФ разделяют на основании специфической экспрессии фермента β-галактозидазы, характерного для ПМФ и не наблюдающейся у МФ [8]. Продукция этого фермента применяется для идентификации процессов клеточного старения в культурах фибробластов [9].

В соответствии с существующей парадигмой в отношении этапности фибробластического дифферона, а также с учетом современных данных об их цитогенетической неоднородности и тенденций к обозначению фибробластов как сугубо фенотипической категории [2], нами предложена к обсуждению следующая обновленная схема фибробластического дифферона (рис. 1).

Определение структуры фибробластического дифферона не является сугубо теоретической задачей, а имеет принципиальное значение для понимания морфофункциональных процессов, происходящих на клеточном и тканевом уровнях в норме и при патологии, что, в свою очередь, открывает перспективы клинического применения фибробластов.

Источники цитогенеза фибробластов

Описывая структуру фибробластического дифферона и раскрывая морфофункциональную организацию кожи через призму характеристик отдельных его этапов, необходимо акцентировать внимание на первом звене цитогенетического ряда фибробластов – полипотентной клетке-предшественнице – и вынести его в отдельную рубрику ввиду активной обсуждаемости вопроса происхождения фибробластов в постанатальном периоде, постоянном увеличении числа «претендентов» на роль первого этапа дифферона, а также принципиальной значимости вопроса для потенциального клинического применения.

В настоящее время в качестве источников развития фибробластов рассматриваются несколько возможных вариантов: местные тканевые недифференцированные предшественники, мезенхимные мультипотентные стромальные (ММСК) или гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) красного костного мозга, – а также участие всех вышеперечисленных источников [2].

Еще А.А. Максимов (1918) отметил, что часть клеток мезенхимы дерматомов сомитов, являющихся предшественницами фибробластов в пренатальном периоде, располагаясь в окружности капилляров, остается в малодифференцированном состоянии и обеспечивает в постнатальном периоде онтогенеза пополнение убывающей в результате дифференцировки популяции фибробластов [2]. В настоящее время большинство исследователей определяет эти камбиальные клетки как периваскулоциты (адвентициальные клетки) [10]. Важно отметить, что в зарубежной литературе, зачастую, под термином «периваскулоциты» понимают не только адвентициальные клетки, сопровождающие сосуды и расположенные в контакте с их наружной стенкой, но и «перициты» [11–14], которые, по представлениям отечественной гистологической школы, представляют собой принципиально иную популяцию клеток, локализующуюся между пластинками базальной мембраны сосудов [1]. Именно адвентициальные клетки способны к дифференцировке в фибробластическом направлении, наряду с остео- и хондробластическим, а также адипоцитарным, хотя в ряде работ аналогичный дифференцировочный потенциал показан и для перицитов [11–14]. Поскольку дерма кожи обладает хорошо развитым микроциркуляторным руслом, то вполне вероятно, что периваскулярные клетки принимают активное участие в цитогенезе фибробластов как в физиологических условиях, так и при заживлении ран.

Популяция адвентициальных клеток гетерогенна, о чем свидетельствует иммунофенотипическое разделение их на две группы по экспрессии комплекса гемопоэтических маркеров (CD34, Sca-1, CD49e) [15]. Существует мнение о происхождении их из циркулирующих в кровотоке ММСК и ГСК, наряду с наличием резидентных периваскулоцитов – возможных «прямых потомков» мезенхимных клеток [2].

В последние годы появились публикации, описывающие ряд полипотентных клеток, полученных из дермы и соответствующих по своему дифференцировочному и пролиферативному потенциалу ММСК костного мозга (табл. 1) [16–22].

J. Toma с соавт. (2001, 2005) идентифицировали и описали популяцию так называемых «клетокпредшественников из кожи» (SKPs, skin-derived progenitor cells) [17, 18]. SKPs были выделены из ниши дермального сосочка волосяного фолликула молодых и взрослых грызунов и культивировались in vitro в среде с факторами роста, часто используемыми для инкубирования нейрональных клетокпредшественниц. SKPs экспрессируют нестин, фибронектин, виментин и соответствуют MМСК по способности дифференцироваться в мезодермальном и нейральном направлениях [23, 24]. Популяция клеток со свойствами SKPs была выделена из неонатальной крайней плоти человека [18, 25], а также из кожи плода, человека среднего и пожилого возраста [20]. Ряд авторов полагают, что SKPs представляют собой новый тип мультипотентных «взрослых» клеток с «разнонаправленной» дифференцировкой [17].

SKPs человека способны в течение длительного времени пролиферировать в культуре ex vivo и дифференцироваться в мезенхимальном, нейрональном и гладкомышечном направлениях. Предполагают, что эти клетки, имеющие фенотип мезенхимных стволовых клеток и мультилинейный дифференцировочный потенциал, находятся в состоянии покоя до момента повреждения ткани [17, 18]. Интересно отметить, что субпопуляция SKPs, выделенная из крайней плоти, способна дифференцироваться in vitro в нейроно подобные клетки.

Из дермы крайней плоти человека и кожи кролика мультипотентные клетки, подобные SKPs, выделили J. Lavoie с соавт. (2009). Авторы установили, что эти клетки, как in vitro, так и in vivo способны дифференцироваться в остеобласты и хондроциты, а часть SKPs – в гладкомышечные клетки и периваскулоциты, ассоциированные с кровеносными сосудами. По мнению исследователей, свойства этих SKPs аналогичны свойствам мультипотентных клеток нейрального гребня и их можно выделить как на стадии эмбриогенеза, так и на стадии взрослого организма [26].

N. Gago с соавт. (2009) выделили мультипотентные клетки, сходные с SKPs, (по протоколу J. Toma с некоторой модификацией) из биоптатов кожи от 102 здоровых доноров (в возрасте от 8 месяцев до 85 лет) из разных анатомических областей. При этом, выделение было произведено из ниш вне дермального сосочка волосяных фолликулов. Кроме того, авторы показали, что с возрастом наблюдается резкое снижение пула SKPs и (или) их дифференцировочного потенциала [27].

Предполагается, что SKPs представляют собой эмбриональные эндогенные клетки-предшественницы, мигрирующие в ткани организма во время развития, и сохраняющие свою мультипотентность во взрослом организме [26, 27].

G. Bartsch с соавт. (2005) идентифицировали в дерме крайней плоти еще одну клеточную популяцию, обозначенную ими как дермальные мультипотентные мезенхимные стволовые клетки (dermal multipotential mesenchymal stem cells, dermal MSCs), способные к дифференцировке в мезенхимальных направлениях (в адипоциты, остеоциты и миоциты) даже после 100 пассажей без явлений трансформации [22].

F. Chen с соавт. (2007) в дерме ювенильной крайней плоти обнаружили еще одну популяцию клеток, которую назвали мультипотентными дермальными фибробластами (MDFs), отличную от SKPs [16]. С помощью клонального анализа было показано, что MDFs составляют приблизительно 0,3% от общей популяции фибробластов дермы крайней плоти человека. В противоположность SKPs, обнаруженная исследователями популяция клеток продуцировала виментин и не экспрессировала нестин, а также, кроме эктодермальной и мезодермальной, была способна к энтодермальной дифференцировке (в частности, в гепатоциты). В 2010 г. научная группа F. Chen еще раз подтвердила мультипотентность MDFs, показав их способность дифференцироваться в островково-подобные клетки поджелудочной железы, вырабатывающие инсулин, глюкагон и соматостатин после панкреатической индукции. Более того, эти клеточные кластеры способны in vitro высвобождать инсулин в ответ на введение глюкозы [28].

Практически одновременно с предыдущими исследователями K. Lorenz с соавт. (2008) выделили из ювенильной крайней плоти человека «фибробластподобные мезенхимные стволовые клетки» (FMSCc), которые экспрессируют виментин, фибронектин, коллаген I типа и слабо – нестин, α-SMA. Общий антигенный профиль этих клеток сходен с ММСК костного мозга и жировой ткани. FMSCc обладают остеогенным и адипогенным дифференцировочным потенциалом. Авторы предположили, что выделенные ими FMSCs представлены в дерме человека не в виде одиночных клеток, а в виде главной клеточной популяции, которая находится в состоянии покоя до момента повреждения ткани (что подтверждается низким уровней экспрессии нестина). Клетки этой популяции при повреждении кожи способны дифференцироваться в миофибробласты [25].

Необходимо отметить, что условия культивирования выделенных различными исследователями клеток весьма вариабельны, что могло оказывать существенное влияние на экспрессию ряда маркеров и дифференцировочный потенциал. По мнению P. Robey, возглавляющей ведущую остеологическую лабораторию мира, большинство маркеров способны значительно варьировать в зависимости от добавления специфических ростовых факторов [29]. Так, J. Toma с соавт. культивировали SKPs с FGF2, EGF и В27, которые используются для инкубирования нейрональных клеток-предшественниц. В этих условиях SKPs экспрессировали нестин, виментин и фибронектин. F. Chen с соавт. культивировали выделенные ими MDFs на стандартной культуральной среде без добавления факторов роста. Не исключено, что J. Toma и F.Chen с соавт. выделили одну и ту же популяцию клеток-предшественниц, которые в разных условиях экспрессировали разные маркеры. Более того, в большинстве вышеуказанных работ, описывающих получение различных мультипотентных клеток из дермы, не указывалась их точная локализация. За исключением SKPs, расположенных в области дермального сосочка волосяного фолликула, часть оставшихся клеток, как то FMSCs, MDFs, dermal MSCs вполне могли оказаться уже давно известными периваскулоцитами.

В любом случае, вышеуказанные данные свидетельствуют о том, что дерма человека содержит значительный камбиальный резерв, способный генерировать множество клеточных линий, а, следовательно, который может быть рассмотрен в качестве альтернативного костному мозгу источника стволовых клеток [30–33], которые в перспективе могут быть использованы в клинической практике в рамках биотехнологического подхода.

Костномозговое происхождение предшественников фибробластов доказано экспериментально и не вызывает сомнений [34]. Дальнейший научный поиск, связанный с идентификацией конкретного вида стволовой клетки, являющейся первым звеном фибробластического дифферона, привел к установлению факта, что как ГСК [35–37], так и ММСК [38–41] в равной степени являются предшественниками фибробластов в пост-натальном периоде онтогенеза.

Кроме того, в системном кровотоке также обнаружены популяции клеток, способные к дифференцировке в фибробластическом направлении, которые, по всей видимости, являются ближайшими потомками ГСК и ММСК, мигрирующими в ткани [2].

Так, R. Bucala с соавт. (1994) описали популяцию клеток (коллаген+/виментин+/ CD34+), названных ими «фиброцитами периферической крови» (ФПК), устремляющихся к местам повреждения кожи, где активно участвуют в процессах репаративной регенерации [42]. Экспрессия ими ряда гемопоэтических маркеров в определенной степени свидетельствует о цитогенезе из ГСК [2, 43]. Показано, что хотя доля этих клеток составляет только 0,5% белых клеток периферической крови, в ране они насчитывают 10% от всех инфильтрирующих поврежденную ткань клеток [42]. Более того, ФПК индуцируют ангиогенез, продуцируя ангиогенные факторы [43, 44], синтезируют цитокины для привлечения CD4+ лимфоцитов и других клеток воспаления [45], экспрессируют антигены, в частности ССR7, для активации миграции клеток к ране [46].

В то же время из крови получены так называемые «циркулирующие в кровотоке предшественники соединительных тканей», экспрессирующие остеонектин, α-SMA, CD44, CD106, CD29, в сочетании с отрицательной реакцией на антитела к гемопоэтическим маркерам CD45/CD14, способные адгезироваться к поверхности культурального пластика и дифференцироваться не только в фибробластическом, но и в остео-, хондробластическом и адипоцитарном направлениях, что в совокупности соответствует морфофункциональным особенностям ММСК [47, 48].

В связи с наличием выраженных различий в функциональном профиле фибробластов папиллярного и ретикулярного слоев дермы, а также значительным числом принципиально отличающихся клеточных источников их происхождения, трудно не согласиться с мнением M. Sorrel и A. Caplan (2004), что термин «дермальные фибробласты» сильно упрощен [15]. По всей видимости, слово «фибробласт» следует считать чисто фенотипической категорией, объединяющей целый ряд различных в цитогенетическом аспекте клеточных линий [2].

Таким образом, фибробласты в интересах дальнейшего клинического применения могут быть получены не только непосредственно из дермы уже в определенной степени дифференцировки, но и из клеток-предшествениц, локализующихся в коже, системном кровотоке и красном костном мозге. Однако теоретической основой эффективного клинического применения является не только определение клеточного источника фибробластов дермы, но и установление изменений их морфофункциональных особенностей в возрастном аспекте, а также достоверных критериев, позволяющих отнести клеточную культуру к популяции фибробластов.

Функциональная часть фибробластического дифферона

Префибробласты – коммитированные в фибробластическом направлении мелкие округлые клетки, обладают высоким пролиферативным потенциалом, благодаря чему поддерживают необходимую в конкретных условиях численность популяции фибробластов [49, 50]. Учитывая факт локализации префибробластов, главным образом, вблизи сосудов микроциркуляторного русла [49], наибольшая плотность которой наблюдается в области двух капиллярных сетей, разграничивающих папиллярный, ретикулярный слои и гиподерму [1], можно предположить, что именно в данной области сосредоточен основной пул малодифференцированных предшественников фибробластов. При этом папиллярный слой относительно ретикулярного имеет более обильное кровоснабжение из-за необходимости обеспечения трофики эпидермиса и выполнения кожей функции терморегуляции [1]. Возможно, по причине большей плотности сосудов фибробласты наружного слоя дермы продуцируют большее количество коллагена III типа, нежели клетки ретикулярного слоя [51]. S. Mine с соавт. (2008) показали при помощи клонального анализа более высокую скорость удвоения популяций фибробластов папиллярного слоя по сравнению с фибробластами ретикулярного слоя, при условии получения из одного и того же участка кожи. Данная закономерность может быть связана с преобладанием в первом малодифференцированных предшественников [52].

Юные фибробласты характеризуются сохранением пролиферативной активности, но уже участвуют в организации МКМ [49].

Дифференцированные фибробласты – основная клеточная популяция фибробластического дифферона дермы, обеспечивающая ее морфофункциональную организацию и гомеостаз за счет выполнения ключевых функций: структурной, регуляторной, ремоделяционной, репаративной. В этой связи и в свете наиболее выраженных различий в выполнении структурной функции целесообразно охарактеризовать особенности цитофизиологии фибробластов в соответствии с локализацией в слоях кожи.

Так, дифференцированные фибробласты эпителиально-дермального соединения, как и кератиноциты, продуцируют основные компоненты базальной мембраны – коллагены IV типа, гликопротеины и ламинины [1, 53–59]. Кроме того, секретируют энтактин/ нидоген [55], формирующий плотные нековалентно связанные комплексы с ламинином и в меньшей степени коллагеном IV типа, тем самым выступая в качестве связующего звена между некоторыми компонентами межклеточного матрикса (МКМ), а также тенасцин, модулирующий «эпителиальномезенхимальные взаимодействия» [60]. Более того, фибробластам принадлежит важная роль в регуляции эпидермального гистогенеза за счет взаимодействия с эпителиальными клетками и секреции ряда биологически активных веществ: фактора роста кератиноцитов (KGF-1), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), интерлейкинов (IL-6, IL-8), индуцирующих пролиферацию эпителиоцитов [61-64], а также трансформирующего фактора роста-β1 (TGF-β1), ингибирующего деление эпителиальных клеток, но стимулирующего их дифференцировку и апоптоз [5].

Фибробласты папиллярного слоя дермы формируют основные компоненты МКМ рыхлой волокнистой соединительной ткани – ряд коллагеновых белков (I, III, VI, V, VI, XII, XVI) [65], эластин, гикозаминогликаны и протеогликаны (тенасцин-С), а также ферменты, участвующие в посттрансляционном процессинге структурных белков и катаболических реакциях [1, 56]. В связи с тем, что в папиллярном слое локализуются также представители других клеточных дифферонов (макрофаги, тканевые базофилы, лейомиоциты, пигментные клетки и др.) [1, 55], объяснима экспрессия фибробластами таких биологически активных веществ, как TGF-β1, GM-CSF и др. [5, 60], стимулирующих хоуминг этих клеток. Тонкие коллагеновые и эластические волокна расположены в виде сети, с преобладанием параллельной поверхности тела ориентации [1]. В этой связи, биологическая целесообразность наружного слоя дермы заключается в регуляции и обеспечении трофики эпидермиса, сопротивлении кожи растяжению, акцепции внешних сигналов/воздействий и осуществлении начальных этапов реакции на них, в реализации которых значимая роль принадлежит фибробластам.

Дифференцированные фибробласты ретикулярного слоя дермы характеризуются несколько иными акцентами функционального профиля – продуцируют фибриллярные компоненты МКМ, характерные для плотной волокнистой неоформленной соединительной ткани: коллагены (I, III, VI, XIV), обладающие большим диаметром и образующие сложную трехмерную сеть, эластин и аморфное вещество МКМ: гликозаминогликаны, протеогликаны (версикан, декорин (нейтрализует TGF-β), тенасцин-Х), ферменты (металлопротеиназы) [1, 49, 51]. При этом ретикулярный слой дермы не отличается разнообразием клеточных типов – в нем превалируют дифференцированные фибробласты и фиброциты [1].

Важно, что стабильность различий функциональных особенностей фибробластов папиллярного и ретикулярного слоев сохраняется и при культивировании их in vitro, что, предположительно, может быть связано с влиянием генов семейства АР-1, ДНК-последовательности homeobox, их регуляторов [55].

Несмотря на поддержание специфики функций наружного и внутреннего слоев дермы через различия функционального профиля фибробластов, входящих в их состав, для основных клеток волокнистых соединительных тканей характерна и общая роль в обеспечении морфофункциональной организации и гомеостаза кожи.

Фиброциты – конечное звено фибробластического дифферона, характеризующееся высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением, низкой секреторной активностью и участием в регуляции обменных процессов в дерме [1, 49].

Функции фибробластов дермы

Функция формирования и репарации дермы. Фибробласты обеспечивают морфофункциональную организацию кожи не только в физиологических условиях, но и при патологии – активно участвуют в восстановлении ее целостности после повреждений во взаимодействии с другими клетками кожи и мигрирующими в зону дефекта форменными элементами крови, т.е. реализуют как физиологический, так и репаративный гистогенез в дерме [1, 49, 50, 66, 67]. Первыми с током крови в зону повреждения устремляются тромбоциты, моноциты/ макрофаги, дегрануляция которых приводит к высвобождению TGF-β и др., которые, помимо модуляции функциональной активности фибробластов, индуцируют их хемотаксис, а также стимулируют миграцию нейтрофилов [50]. Процесс активации фибробластов сопровождается усилением пролиферативной активности, хоумингом к месту повреждения, дифференцировкой в премиофибробласты, активно продуцирующие коллаген, фибронектин и организующие МКМ, служащий «опорой» для других клеток. В последующем премиофибробласты под влиянием специфических факторов (TGF-β1, эпидермальный фактор роста (EGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор роста фибробластов-2 (FGF-2)) и механического напряжения дифференцируются в миофибробласты, обладающие выраженным сократительным аппаратом (α-гладкомышечный актин, миозин), ответственные за контракцию регенерата [68]. Миофибробласты апоптозом элиминируются из места повреждения и замещаются фибробластами, регулирующими состав и ремоделирование новообразованного МКМ [55, 60].

Регуляторная функция. Фибробласты дермы продуцируют комплекс проангиогенных факторов: VEGFs, FGFs, TGF-β1, HGF/SF и ангиопоэтин-1 [26 69], которые вовлечены в регуляцию процессов ангиогенеза – индуцируют миграцию и дифференцировку эндотелиальных клеток, способствуют образованию сосудов [70, 71, 15].

Значимое место фибробласты дермы занимают в системе нейро-эндокринной регуляции кожи. Они способны синтезировать биологически активные пептиды – гормоны, биогенные амины, нейропептиды и нейротрансмиттеры, идентичные таковым в центральной нервной и эндокринных системах [72], пролактин, идентичный гипоталамическому [73], экспрессируют ген гормона роста [74]. Фибробласты дермы характеризуются наличием рецепторов андрогенов и эстрогенов, через которые реагируют на гормональные влияния, опосредуя действие половых гормонов на кожу человека [75].

Немаловажную роль фибробласты дермы играют в регуляции иммунного ответа. По мнению Н.П. Омельяненко (2009), фибробласты можно рассматривать как «сторожевые» клетки, организующие ответы соединительной ткани на инфекцию или повреждение [56]. Так, C.G. Larsen и соавт. (1989) продемонстрировали участие фибробластов дермы в реализации механизмов взаимодействия иммунокомпетентных клеток. В условиях in vitro показаны их иммуносупрессорные и иммуномодулирующие свойства [76]. В 1981 г. J.H. Korn показал ингибирующее действие фибробластов на митогенез и пролиферацию Т-клеток [77]. Кроме того, фибробласты синтезируют ряд основных посредников воспаления, одним из которых является фактор транскрипции RelB ядерного фактора kB, активирующий тучные клетки. При совместном культивировании фибробластов дермы и мастоцитов происходит усиление продукции последними гистамина [78]. С другой стороны, фибробласты подвержены регуляторным влияниям других клеток дермы. В частности, цитокины, продуцируемые иммунокомпетентными клетками, стимулируют (TGF-β, интерлейкин-1) и ингибируют (γ-интерферон) продукцию коллагена и фибронектина, снижают экспрессию протеаз (TGF-β), модулируют пролиферацию фибробластов (тромбоцитарный фактор роста) [79].

Функция ремоделирования матрикса. Ремоделирование МКМ – непрерывный процесс его изменения, приведения структуры в соответствие выполняемым функциям и оптимальному сопротивлению воздействующим механическим нагрузкам. Полная детализация механизмов ремоделирования далека от разрешения, однако накопилось множество противоречивых и разрозненных данных, раскрывающих этот процесс. По современным представлениям, в реализацию процессов ремоделирования на клеточном уровне вовлечено большинство клеточных типов дермы, однако именно представители фибробластического дифферона являются ведущим исполнительным элементом. На субклеточном уровне ремоделирование МКМ осуществляется за счет взаимодействия компонентов МКМ, поверхностных рецепторов клеток, цитоскелета, протеаз и их активаторов (плазмин, катепсины B и L)/ингибиторов (тканевые ингибиторы металлопротеиназ, TIMP) [60]. В ходе ремоделирования под действием ряда цитокинов (интерлейкин-1β, фактор некроза опухолей-α) фибробласты продуцируют прометаллопротеиназы, активируемые в МКМ плазмином и катепсинами. В результате происходит разрушение компонентов МКМ, продукты деградации которого посредством эндоцитоза поступают в фибробласты, где по механизму отрицательной обратной связи увеличивают экспрессию TIMP, блокирующих протеолиз [79]. Аналогичную роль – ремоделирование МКМ – выполняют фиброкласты, но не за счет синтеза его компонентов, а посредством их лизиса [49].

Таким образом, фибробласты – основа морфофункциональной организации и гомеостаза кожи, являются ведущим исполнительным элементом регуляторных влияний как общего (нейро-эндокринная система), так и местного (цитокины, межклеточные и клеточно-матриксные взаимодействия) уровней. Специфика функционального профиля фибробластов разных слоев дермы предопределяет функциональные различия папиллярного и ретикулярного слоев. Следует заключить, что именно фибробласты дермы должны быть основной точкой приложения терапевтических вмешательств при патологии кожи, а также являться эффективным инструментом в рамках биотехнологий, позволяющим оптимизировать процессы репаративной регенерации кожи при их нарушении. Однако дальнейшая детализация цитофизиологии фибробластов, особенно в части, касающейся источников их цитогенеза, возрастных изменений и специфики функциональных параметров в зависимости от локализации, крайне необходима для обоснования выбора конкретной популяции фибробластов в случае их клинического применения.

Возрастные изменения цитофизиологии фибробластов

После выяснения особенностей цитофизиологии фибробластов и их значения в морфофункциональной организации и поддержании гомеостаза кожи в физиологических условиях, представляются закономерными следующие вопросы: как меняются цитофизиологические характеристики популяции фибробластов с возрастом (in vitro и in vivo) и как они отражаются на строении и функциях кожи? Решение этого аспекта общей современной концепции о фибробластах имеет принципиальное значение как для понимания генеза «старения», так и для клинической практики: для обоснования выбора доноров клеток, определения показаний, прогнозирования течения и результатов терапевтического применения фибробластов дермы. В этой связи, исследования возрастных изменений и их морфофункциональной активности проводятся на протяжении последних нескольких десятилетий.

Первые различия между популяциями фибробластов дермы, выделенных от молодых и старых доноров, проявляются еще на стадии получения клеточной культуры: показана статистически значимая более медленная миграция клеток пожилых людей из биоптатов кожи на поверхность культурального пластика [80, 81]. Способность любых клеток к передвижению определяется функционированием системы «цитоскелет – поверхностные рецепторы МКМ – волокнистые компоненты МКМ – специфические ферменты» [82]. In vitro показано, что с возрастом наблюдается увеличение размеров фибробластов дермы, повышение содержания и уплотнение компонентов их цитоскелета: даже при световой микроскопии становятся заметными актиновые фибриллы, располагающиеся близко друг к другу, формируя «пласт» на вентральной стороне цитоплазмы, увеличивается удельное содержание микротрубочек и их организационных центров, промежуточных филаментов, образующих фибриллярные структуры в виде слоев и тяжей [83]. Снижение миграционной способности фибробластов дермы, оптимальный уровень которой необходим для нормального течения репаративных процессов в коже, обусловлено не только дезорганизацией актинового цитоскелета, но и пониженной экспрессией и функцией α2β1интегринов, связывающихся с ламинином и коллагеном I типа. При этом продукция и активность металлопротеиназ, также необходимых для передвижения фибробластов в межклеточном веществе соединительной ткани, с возрастом практически не изменяется [83]. Более того, биометрическими методиками показано возрастное увеличение ригидности фибробластов дермы (на 60% при сравнении доноров от 27 до 81 года), основанное на превращении глобулярного G-актина в фибриллярный F-актин, в то время как виментин остается без изменений. Повышение «напряженности» фибробластов дермы в процессе старения организма сопряжено со снижением вязкоэластических свойств организуемого ими коллагенового матрикса [84], а также может служить причиной снижения пролиферативной активности [83].

Другие значимые различия между фибробластами дермы молодых и пожилых людей касаются пролиферативных потенций. Так, при инкубировании in vitro фибробласты доноров в возрасте 60–80 лет подвергаются более быстрому «старению», один из основных показателей которого – понижение скорости удвоения культуры в виде невозможности достичь конфлюентности монослоя в течение двух недель [81]. Отставание наблюдается не только в скорости пролиферативного процесса, но и в числе клеточных делений: фибробласты молодых доноров характеризуются в два раза большим количеством митозов, благодаря чему одна клетка (таких 60%) способна образовать колонию в 256 и более фибробластов, а в случае пожилых доноров – лишь 2% клеток формируют колонии подобного объема [81, 85]. Обоснованием меньшего количества клеточных делений может служить лимит Хейфлика (Hayflick limit), согласно которому соматические клетки, не экспрессирующие теломеразу, способны в среднем лишь на 50 удвоений популяции [86], а фибробласты пожилых доноров до выделения in vitro уже прошли ряд клеточных циклов. С возрастом показано также увеличение частоты апоптозов в популяции фибробластов [87]. Закономерным исходом снижения пролиферативной активности фибробластов дермы и повышения количества апоптозов являются результаты исследования J. Varani с соавт. (2006), которые, анализируя биоптаты кожи людей в возрасте 18–29 и 80 лет и старше, показали, что общее количество фибробластов в группе пожилых доноров снижено приблизительно на 35% по отношению к молодым [88]. Аналогичные данные получены S. Nolte с соавт. (2008), которые предположили, что причиной возрастного уменьшения популяции фибробластов дермы является превалирование в процессе старения клеток с низким пролиферативным потенциалом [5].

Третья группа изменений цитофизиологии фибробластов дермы связана с их синтетической активностью в виде продукции различных веществ как для нужд самой клетки, так и «на экспорт».

В экспериментах 70-х годов XX в., авторы зачастую указывали на отсутствие статистически значимых различий во внутриклеточном содержании РНК и белков, однако их качественный состав не исследовался [81]. К настоящему же времени накопилось большое количество данных, показывающих значительные изменения качественного состава внутриклеточных структурных элементов фибробластов, коррелирующих с возрастом организма. В частности, обнаружено достоверное снижение синтеза митохондриальных белков фибробластов дермы, полученных от людей старше 40 лет, сопряженное с потерей митохондриального мембранного потенциала, со снижением процессов клеточного дыхания, эффективности окислительного фосфорилирования и пониженным синтезом АТФ [89].

В процессе старения наблюдается также снижение продукции компонентов МКМ соединительных тканей дермы. Так, J. Varani и соавт. (2000) показали, что общая продукция коллагена в коже людей 80 лет и старше снижена примерно на 75% относительно молодых людей (18–29 лет) [90], что, по всей видимости, связано как с понижением синтетической активности фибробластов дермы, так и уменьшением общей численности их популяции. При этом наблюдается параллельное снижение продукции коллагена I и III типов с изменением их соотношения в пользу коллагена I типа [91]. Снижение в дерме уровня коллагена считают одним из главных индикаторов ослабления функционирования фибробластов дермы [88].

Таким образом, процесс возрастных изменений сводится к уменьшению численности популяции фибробластов, снижению их пролиферативной и синтетической активности, что закономерно проявляется изменением количественного и качественного состава МКМ дермы. Следовательно, клетки фибробластического дифферона должны быть определены как основной эффектор и точка приложения терапевтического воздействия при коррекции дефектов кожи для возможного клинического применения в рамках регенерационной медицины.

Возможности клинического применения

Наибольшие успехи достигнуты в экспериментальных и клинических исследованиях, направленных на определение эффективности использования дермальных эквивалентов (ДЭ) для коррекции дефектов кожи. ДЭ представляет собой результат совмещения носителя (различные варианты коллагена, фибринового геля, полиглактина и пр.) и культуры аллогенных или аутогенных фибробластов [92]. При этом разрабатываются как двухмерные (клетки адгезируются на поверхность матрикса), так и трехмерные (фибробласты локализованы по всей толщине носителя) графты. Фибробласты используются также для создания комбинированных «аналогов кожи», структура которых предполагает расположение еще и кератиноцитов в один или несколько слоев. К настоящему времени прошел клиническую апробацию и запатентован целый ряд коммерческих препаратов, состоящих из бычьего коллагена I типа, аллогенных фибробластов и кератиноцитов [93].

С учетом того, что возрастные изменения цитофизиологии фибробластов в значительной степени определяют ухудшение морфофункциональной организации дермы в процессе старения, активно разрабатываются подходы, предполагающие использование фибробластов для коррекции возрастных нарушений структуры кожи. Предполагается, что введение функционально активных «молодых» клеток, не исчерпавших лимит митозов, обладающих выраженным синтетическим потенциалом, приведет к восполнению уменьшенного пула резидентных фибробластов дермы и нормализует состав и строение МКМ дермы в области трансплантации. Впервые специалисты компании Isolagen в 1995 г. применили фибробласты дермы для коррекции морщин и рубцов-постакне, доказав безопасность и клиническую эффективность технологии [94–100]. Впоследствии многие исследовательские группы указали на аналогичные положительные результаты, выраженные в виде увеличения продукции коллагена [97, 101–105], эластина, усиление эпидермального гистогенеза, стимуляции резидентной популяции фибробластов дермы [102].

Менее многочисленны работы, исследующие применение фибробластов в других областях медицины, как то урология, сердечно-сосудистая, челюстно-лицевая, нейрохирургия, стоматология и др. Принципиальные технологические аспекты, в основном, соответствуют таковым в части создания ДЭ: фибробластами заселяют носитель из органического материала с возможным включением других клеточных типов (эндотелиоциты, эпителиальные клетки слизистой мочевого пузыря, уретры), получая графт, пригодный для трансплантации [106]. Специфические технологические этапы связаны с конкретной областью применения и необходимыми характеристиками создаваемых графтов. В частности, T.N. McAllister с соавт. (2009) в клиническом исследовании показали приемлемые результаты применения биоинженерного прототипа сосуда в качестве артериовенозного доступа для выполнения гемодиализа. При этом для создания графта сосуда авторы в процессе культивирования фибробластов дермы на желатине получали «клеточные листы», которые оборачивали вокруг стальных мандренов (диаметром 4,8 мм) до сопоставления противолежащих сторон и инкубировали 10 нед., после чего мандрены извлекали, внутренний слой полученных «трубок» девитализировали высыханием на воздухе и заселяли эндотелиальными клетками [107].

В экспериментальных исследованиях в области нейрохирургии положительный эффект получен при эмболизации артериальных аневризм хитозанглицерофосфатным гидрогелем, содержащим фибробласты дермы [108]. Кроме того, в виду доступности получения и культивирования они используются в большом количестве исследований по репрограммированию в качестве исходной клеточной популяции [109–111].

Таким образом, возможности клинического применения фибробластов чрезвычайно широки, а результаты экспериментальных и клинических исследований в значительной степени успешны. Однако для продвижения медицинских технологий, предполагающих использование фибробластов, по аналогии с ММСК, необходимо принятие унифицированных достоверных критериев отнесения клеток к популяции фибробластов. Задача осложняется тем фактом, что, несмотря на экспрессию большого числа клеточных антигенов (табл. 2), ни один из них не является эксклюзивным маркером фибробластов [61]. Так, фибробласты дермы характеризуются экспрессией мезенхимных (CD44, СD73, СD90, СD105, виментин) и отсутствием эпителиальных, гемопоэтических и эндотелиальных маркеров (CD31, CD34, CD45) [2, 15]. При этом, например, поверхностный клеточный антиген Thy-1/CD90 продуцирует все их популяции (предполагается, что он регулирует адгезию фибробластов, организацию цитоскелета и миграцию клеток) [70], но, в то же время, Thy-1/ CD90 является одним из трех обязательных поверхностных антигенов дифференцировки ММСК [2]. Другие маркеры, характерные для фибробластов кожи, такие как структурные белки промежуточных филаментов цитоскелета виментин и десмин, помимо всех фибробластподобных, экспрессируются и другими клетками (см. табл. 2).

На сегодняшний день два маркера – белки FSP1 (член семейства внутриклеточных белков S100) и FAPα (белок активации фибробластов) считаются наиболее специфичными для идентификации фибробластов [10, 15, 61, 112], хотя они также не является эксклюзивными. В этой связи, идентификация фибробластов основывается на комплексе функциональных и иммунофенотипических параметров, конкретный перечень которых требует уточнения и унификации.

Заключение

Несмотря на колоссальное количество исследований, касающихся фибробластов в целом и фибробластов дермы в частности, современная концепция об их цитогенезе, цитофизиологии, специфике функционального профиля в зависимости от источников происхождения, топической локализации, сопутствующей соматической патологии организма и прочих факторов все еще содержит множество нераскрытых дискуссионных вопросов.

Очевидно, что фибробласты дермы – ведущий элемент в системе обеспечения морфофункциональной организации кожи и поддержании ее гомеостаза, оказывающий непосредственное влияние на течение структурных, ремоделяционных, регуляторных, репаративных и других процессов, происходящих в коже в норме, в процессе старения и при патологии. В этой связи, клетки фибробластического дифферона должны рассматриваться и как индикатор развития патологии в коже, и как ключевой эффектор и точка приложения терапевтических вмешательств в регенерационной медицине.

Подняться вверх сайта