Поиск Кабинет

Фенотип и функциональные свойства ММСК из жировой ткани после взаимодействия с мононуклеарами пуповинной крови

Гены & Клетки: Том VIII, №4, 2013 год, стр.: 39-49

 

Авторы

Бобылева П.И., Андрианова И.В., Маслова Е.В., Андреева Е.Р., Гогия Б.Ш., Буравкова Л.Б.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Хорошо известно, что ex vivo экспансия гемопоэтических стволовых клеток более эффективно проходит в тех случаях, когда создаются условия, приближенные к их микроокружению in vivo. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), благодаря их способности поддерживать кроветворение, широко используются в таких системах. На конечный результат взаимодействия ММСК и гемопоэтических клеток может оказывать влияние такой фактор, как низкая концентрация О2, которая характерна для костномозговой ниши и, как показано, отражается на ряде свойств ММСК. Обратные эффекты, которые клетки гемопоэтического происхождения оказывают на ММСК, изучены в гораздо меньшей степени.

В данной работе проводилось изучение влияния мононуклеаров пуповинной крови (МПК) на отдельные морфофункциональные характеристики ММСК из жировой ткани при ко-культивировании их в течение 72 ч в условиях атмосферной (20%) и пониженной (5%) концентрации О2. Динамику прикрепления МПК характеризовали при микроскопии, влияние МПК на экспрессию CD54, CD44, CD90 и жизнеспособность ММСК определяли при помощи проточной цитофлюориметрии.

Взаимодействие гемопоэтических и стромальных клеток при обеих концентрациях О2 увеличивало экспрессию ММСК CD54, в некоторых случаях повышалась продукция CD44, на высоком уровне сохранялись экспрессия CD90 и жизнеспособность ММСК. Прикрепление МПК происходило несколько быстрее при 20% О2.

Таким образом, при ко-культивировании аллогенных ММСК и МПК человека вне зависимости от концентрации О2 происходило повышение экспрессии ММСК молекул адгезии, участвующих в формировании специализированных межклеточных контактов, что обеспечивало эффективное прикрепление МПК. При этом не наблюдалось каких-либо цитотоксических эффектов, что особо важно в случае возможного применения аллогенных ММСК в рамках регенеративной медицины.

Формирование стромы различных тканей, в частности гемопоэтической ниши, является одной из важнейших цитофизиологических функций ММСК, причем они не столько обеспечивают механическую «структуру» ткани, сколько вовлечены в регуляцию пролиферативного и дифференцировочного статуса кроветворных клеток-предшественниц посредством продукции растворимых медиаторов (IL-6, IL-8, MCP1, GCSF, GRO, T IMP-1, TIMP-2, IGFBP-1, IGFBP-2) и прямых межклеточных контактов (cadherin-11, N-cadherin, NCAM1, VCAM1)[1, 2]. Значимую роль в установлении контактных взаимодействий играют молекулы адгезии ICAM1[3] и HCAM[4, 5], последняя также регулирует дифференцировку гемопоэтических предшественников[6, 7].

Исследования in vitro предоставляют широкие возможности для изучения отдельных аспектов функционирования и взаимодействия клеток кроветворной ниши костного мозга[1, 8–10]. Следует отметить, что основное внимание в подобных исследованиях, как правило, фокусировалось на влиянии компонентов ниши на гемопоэтические клетки, тогда как обратный эффект – воздействие гемопоэтиков на ММСК – изучен в меньшей степени.

Физиологическая ниша ММСК характеризуется низким содержанием кислорода (3–7%). Влияние этого параметра на свойства ММСК было показано в ряде исследований, в том числе и выполненных в нашей лаборатории[11–13]. Отмечено, что при пониженной концентрации кислорода увеличивается пролиферативная активность ММСК и их способность к колониеобразованию, замедляется дифференцировка в осте- и адипогенном направлениях, усиливается – в хондрогенном[14]. Тем не менее, на настоящий момент из всех работ, посвящённых изучению взаимодействия гемопоэтических клеток и ММСК, лишь в некоторых при культивировании учитывался этот важный физиологический фактор[10, 15, 16].

Недавно в нашей лаборатории был предложен способ обогащения популяции мононуклеаров пуповинной крови (МПК) ранними гемопоэтическими предшественниками в ко-культуре с ММСК жировой ткани[17]. В описанной модели МПК ко-культивировались с ММСК в течение 72 ч, после чего все неприкрепившиеся МПК удалялись и далее выполнялась экспансия только прикрепившихся малодифференцированных гемопоэтических клеток.

Целью настоящего исследования являлось определение влияния МПК на морфофункциональные особенности ММСК жировой ткани при кокультивировании в стандартных условиях (20%) и при пониженном содержании О2, близком к физиологической концентрации в гемопоэтической нише.

Материал и методы

Источники ММСК и гемопоэтических клеток-предшественниц. ММСК веделяли из стромально-васкулярной фракции жировой ткани человека, используя метод P.A. Zuk с соавт. (2001)[18] в модификации Л.Б. Буравковой и др. (2009)[11]. Образцы жировой ткани от 5 практически здоровых доноров (женщины в возрасте от 38 до 45 лет) были предоставлены многопрофильной клиникой «Союз» в соответствии с договором о научном сотрудничестве.

Все доноры подписывали информированное согласие на выполнение липоаспирации и последующее использование жировой ткани в рамках научного исследования.

Для проверки соответствия полученных клеток критериям ММСК они были охарактеризованы по экспрессии маркёров CD45, CD73, CD90 и CD105, а также способности к дифференцировке в остеогенном и адипогенном направлениях.

Источником гемопоэтических клеток-предшественниц являлась фракция мононуклеаров пуповинной крови (МПК), предоставленой Банком стволовых клеток ООО «Криоцентр» (Москва).

Дизайн исследования. После размораживания МПК в концентрации 2×106 кл/мл добавляли к ММСК и ко-культивировали в течение 72 ч. Ко-культуры клеток были разделены на две группы в соответствии с условиями инкубирования. Группа 1 находилась в СО2-инкубаторе (Sanyo, Япония) в стандартных условиях: 5%СО2, 20% О2, 37°С, 100% влажность; группа 2 – в мультигазовом инкубаторе (Sanyo, Япония) в условиях пониженного содержания кислорода: 5%СО2, 5%O2, 37°С, 100% влажности. В качестве контроля использовали также монокультуры ММСК. Через 24 и 72 ч ко-культивирования проводили микроскопию (Nikon Eclipse TiU, Nikon, Япония) и фотосъёмку фиксированных участков чашки Петри с культурами клеток. На полученных изображениях подсчитывали количество МПК, используя программу анализа изображений SigmaScan Pro 5.0 Image Analysis Software (SPSS Inc, США). Затем выполняли цитологические исследования, включавшие цитохимический, иммуноцитохимический и морфометрический анализы.

Культивирование клеток. Культивирование ММСК проводили в среде α-MEM (Gibco, США), содержащей антибиотик-антимикотик (пенициллин-стрептомицин-фунгизон) (Gibco, США) и 10% фетальной сыворотки коров (FCS) (Hyclone, Бельгия). Для эксперимента использовали ММСК 2–4 пассажей, достигшие 70–80% конфлюентности монослоя. Эксперименты проводили в среде RPMI1640 (Gibco, США), содержащей антибиотик-антимикотик (пенициллин-стрептомицин-фунгизон) и 5% FCS.

Цитологические исследования. Цитохимический анализ МПК, прикрепившихся к ММСК через 24 и 72 ч ко-культивирования, проводили после фиксации метанолом и окрашивания гематологическим красителем по Гимза (BDH, США).

После 24 и 72 ч ко-культивирования ММСК с адгезированными на них МПК обрабатывали раствором 0,05% трипсин-0,02% ЭДТА (1х) (Gibco, США) и суспендировали до получения одиночных клеток. Выполняли цитохимические реакции с моноклональными антителами к CD90 (FITC)/CD45 (PE), СD44 (FITC), CD54 (PE) (Beckman Coulter IO Test, США). Анализ флюоресценции клеток проводили на проточном цитофлюориметре Epics XL (Beckman Coulter, США), используя программное обеспечение System II для захвата и анализа изображения (Beckman Coulter). Кроме этого, цитофлюориметрически определяли количество некротических и апоптотических клеток при помощи набора Annexin-PI (Immunotech, Франция).

Для того, чтобы среди клеток в суспензии, полученной при обработке раствором трипсина, выделить ММСК, проводили одновременное выявление CD90 – молекулы, конститутивно экспрессирующейся ММСК, и CD45 – общего лейкоцитарного антигена, который отсутствует на ММСК. После окрашивания на данные антигены в суспензии ММСК и МПК при проточной цитофлюориметрии выделяли 2 популяции клеток. В первую входили сравнительно мелкие клетки, большая часть которых экспрессировала маркёр CD45, – лейкоциты пуповинной крови; ко второй популяции относили сравнительно крупные гетерогенные по размеру клетки, большинство из которых экспрессировало CD90. В соответствии с этим для дальнейшего цитофлюориметрического анализа ММСК был создан протокол, учитывающий только вторую популяцию клеток.

Статистический анализ. Статистический анализ полученных данных выполняли с помощью программы «Statistica 7.0» (StatSoft, США), используя U-критерий Манна – Уитни. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

Практически все клетки, полученные из стромально-васкулярной фракции жировой ткани, экспрессировали характерные для ММСК маркёры CD73 (95,5±1,3%), CD90 (табл. 1), CD105 (99,6±0,1%) и дифференцировались в остеогенном и адипогенном направлениях. Доля клеток, экспрессировавщих CD45, была незначительна (1,5±0,5%).

В первые сутки ко-культивирования при 20% и 5% О2 наблюдалось активное прикрепление МПК к ММСК (рис. 1). Большая часть популяции прикрепленных МПК была представлена клетками гранулоцитарного ростка, были выявлены предшественники, которые можно отнести к нейтрофильным и эозинофильным миелоцитам и метамиелоцитам. Эритроидный ряд клеток был представлен базофильными, полихроматофильными и оксифильными нормоцитами (рис. 2). Также были обнаружены клетки, в которых в различной степени выражена базофилия цитоплазмы, и имеющие хроматин облаковидного вида – признаки, позволяющие отнести эти клетки к зрелым лимфоцитам периферической крови.

Количество прикреплённых к ММСК мононуклеаров после 24 ч ко-культивирования при 20% О2 было приблизительно в 2,5 раза больше, чем при 5% О2, и в течение дальнейшего ко-культивирования практически не изменялось. Через 72 ч при 5% О2 количество прикреплённых МПК возросло и уже не отличалось от такового при 20% О2 (рис. 3).

Цитофлюориметрический анализ показал, что взаимодействие с МПК привело к значительному увеличению доли ММСК, экспрессирующих CD54 антиген (рис. 4). Было выявлено не только увеличение доли CD54+-клеток, но и средней интенсивности флюоресценции клеток, что свидетельствовало о возрастании количества экспрессированных молекул ICAM1 на поверхности ММСК. Это повышение наблюдалось в течение всего эксперимента в равной степени при 20% и 5% О2 и составляло от 2 до 3 раз по сравнению с монокультурой ММСК (рис. 5).

Практически все ММСК в монокультуре и при ко-культивировании с МПК экспрессировали CD44 антиген. Интенсивность экспрессии данного антигена после 24 ч ко-культивирования была в среднем выше на 50–75%, чем в монокультуре, однако высокая вариабельность, связанная, по-видимому, с индивидуальными особенностями ММСК, полученными от разных доноров, не позволяет говорить о достоверном повышении. Через 72 ч интенсивность флюоресценции при выявлении CD44 антигена была одинаковой у ММСК в ко- и монокультурах.

Экспрессия CD90 статистически значимо не отличалась в ко- и монокультурах, не изменялась в зависимости от условий и сроков культивирования (см. табл. 1).

Для того, чтобы определить, как взаимодействие с МПК влияет на жизнеспособность ММСК, после 24 и 72 ч ко-культивирования при различном содержании О2 в среде была проведена оценка доли живых, апоптотических и некротических ММСК (табл. 2). Оказалось, что в течение всего времени эксперимента жизнеспособность ММСК была высокой и не отличалась от значений, характерных для монокультуры ММСК, независимо от концентрации кислорода.

Обсуждение

Анализ ранних этапов взаимодействия МПК и ММСК жировой ткани, проведенный в настоящей работе, показал, что в течение 72 ч происходит адгезия большей части МПК к ММСК, причём среди прикрепившихся клеток были выявлены как дифференцированные, так и значительное количество малодифференцированных клеток-предшественниц. Прикрепление МПК к стромальной подложке при атмосферной концентрации кислорода происходило быстрее, чем при 5% О2 в среде культивирования. Взаимодействие с МПК привело к увеличению доли ММСК, эспрессирующих CD54 (ICAM1), что указывает на роль ICAM1 в установлении специализированных клеточных контактов при взаимодействии ММСК с МПК. Хорошо известно, что ICAM1 – это рецептор, опосредующий адгезию лейкоцитов к эндотелиальным клеткам[19–21]. Кроме того, была также показана существенная роль, которую эти молекулы играют в прикреплении к ММСК гемопоэтических предшественников, в частности, значительный вклад взаимодействия ICAM-1/LFA-1 в этот процесс[22]. Ещё одним важным белком контактных взаимодействий в кроветворной нише является CD44 (HCAM). Помимо участия в реализации таких значимых функций, как адгезия клеток к субстрату, а также агрегация клеток[4], HCAM задействована во взаимодействии гемопоэтических предшественников и ММСК[23], и её блокирование ведёт к нарушению процесса гемопоэза[6]. По нашим данным практически все ММСК независимо от условий культивирования экспрессировали данную молекулу адгезии, что подтверждает полученные ранее данные о том, что высокий уровень экспрессии данного антигена характерен для ММСК жирового происхождения, по сравнению с ММСК из других источников[24].

К настоящему моменту существует значительный массив данных об иммуномодулирующих свойствах ММСК. В частности, показано, что они способны оказывать супрессивное воздействие на лимфоциты и подавлять их активацию[25–28]. Характерную для ММСК низкую иммуногеннность связывают с пониженной экспрессией MHC-I и отсутствием экспрессии MHC-II[29]. МПК представляет собой гетерогенную по степени зрелости смесь клеток гемопоэтической линии, значительную долю которых составляют дифференцированные лейкоциты.

Есть данные о том, что ММСК из жировой ткани, по сравнению с клетками из других тканей, подвержены лизису CD8+Т-лимфоцитами и естественными киллерами[30]. Однако лимфоциты пуповинной крови обладают сниженной цитотоксической активностью[31, 32]. Можно предположить, что в нашем исследовании сочетание иммуносупрессивных свойств ММСК и их иммунотолерантности с низкой цитотоксической активностью МПК привело к тому, что присутствие аллогенных ММСК не вызывало активации иммунных клеток, что подтверждается высокой жизнеспособностью ММСК в ходе ко-культивирования. Ранее в нашей лаборатории было показано, что изменение уровня О2 не влияет на экспрессию CD90 (Thy1)[11]. При взаимодействии с МПК мы также не обнаружили изменения иммунофенотипа ММСК по данному антигену, а его экспрессия поддерживалась на высоком уровне. Предполагается, что Thy1 через соответствующие интегрины может опосредовать адгезию лейкоцитов к эндотелию и фибробластам, клеток меланомы к эндотелию, тимоцитов к эпителию тимуса[33]. Ранее было показано, что снижение уровня экспрессии Thy1 связано с потерей иммуносупрессивной активности ММСК[34]. Участие в подавлении Т-клеточной активности было выявлено и для ICAM-1: чем больше экспрессия, тем выраженнее был иммуносупрессивный эффект[34]. Таким образом, наблюдавшаяся в данном исследовании стабильная экспрессия Thy1 и повышение уровня ICAM1 при взаимодействии с МПК также могла отразиться на функциональной активности ММСК, связанной с иммуносупрессией, что способствовало снижению цитотоксичности МПК и, таким образом, поддержанию жизнеспособности ММСК.

Проведенное исследование показало, что прикрепление аллогенных малодифференцированных гемопоэтических предшественников к ММСК жировой ткани может одинаково эффективно происходить как при 20%, так и 5% О2. ММСК активно экспрессировали молекулы адгезии, опосредующие формирование специализированных клеточных контактов, причём начальный этап прикрепления мононуклеаров проходил быстрей при 20% О2. Аллогенные ММСК не провоцировали цитотоксическое действие со стороны МПК и сохраняли высокую жизнеспособность при ко-культивировании.

Полученные данные могут быть использованы для разработки систем ко-культивирования, эффективных для обогащения фракции гемопоэтических стволовых клеток, показанных для последующего применения в гематологической практике.

Подняться вверх сайта