Поиск Кабинет

Экспрессия репортерных генов под контролем регуляторных элементов гена теплового шока дрозофилы в трансгенных эмбрионах вьюна Misgurnus fossilis L

Гены & Клетки: Том I, №4, 2006 год, стр.: 39-47

 

Авторы

Андреева Л.Е., Хайдарова Н.В., Родригес-Бланко А.В., Канайкина Н.Н Ревищин А.В., Тарантул В.З., Корочкин Л.И., Павлова Г.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Документ без названия

Исследовали эффективность транзиентной экспрессии репортерных генов lacZ и gfp под контролем двух различных промоторных элементов гена теплового шока hsp70 дрозофилы в трансгенных эмбрионах вьюна Misgurnus fossilis L. F0-noKoneHm, Экспрессия трансгенов в ранних эмбрионах и предпичинках носила мозаичный характер и зависела от количества вводимого генетического материала. В то же время экспрессия трансгена не зависела от повышения температуры окружающей среды, т.е. возникала без теплового шока. У 2-3-суточных зародышей эффективность транзиентной экспрессии была максимальной и достигала в отдельных сериях экспериментов 100%. Таким образом, регуляторные элементы гена теплового шока дрозофилы способны обеспечивать конститутивную экспрессию репортерных генов в эмбрионах вьюна.

Введение

В последние годы появилось множество работ по полу чению линий трансгенных рыб с экспрессирующимися ре портерными генами, находящимися под контролем гетеро логичных регуляторных элементов. Для быстрого анализа различий в экспрессии генов с регуляторными элементами различной структуры довольно часто используют транзиен тную экспрессию трансгенов у F0 поколения рыб [1 4]. Этот метод, несмотря на некоторые недостатки, может быть по лезен для получения информации об уровнях и характере экспрессии трансгена в зависимости от индуцибельности и тканеспецифичности промотора.

Удобную модель для тестирования экспрессии чужерод ных генов представляет собой вьюн Misgurnus fossilis L. Легкость содержания (отсутствие необходимости кормления взрослых особей) и получения половых продуктов, сравни тельно большие размеры икринок и прозрачные оболочки, относительно короткая продолжительность эмбриогенеза способствуют использованию его в экспериментах по иссле дованию функционирования введенных генов [5-7]. Белки теплового шока (ТШ) вовлечены во многие физио логические и патологические процессы организма и играют центральную роль в защите и репарации клеток под воздей ствием стресса (тепловой, Холодовой шок, ультразвук, тя желые металлы и др.) (8). Рядом исследователей показано, что гетерологичные промоторы генов ТШ могут обеспечивать индуцибельную экспрессию маркерных генов в трансген ных организмах и культуре клеток различных видов живот ных [9-14].

В данной работе репортерные гены lacZ и gfp, находя щиеся под контролем двух разных промоторов гена ТШ дро зофилы hsp70, инъецировали в оплодотворенные яйцеклетки вьюна с целью анализа уровней экспрессии трансгенов в зависимости от структуры промоторов, температуры окру жающей среды, концентрации введенного генетического материала и стадии развития зародышей.

Материалы и методы

Половозрелых вьюнов Misgurnus fossilis L, принадлежа щих к семейству вьюнов Cobitidae, отряду карпообразных Cypriniformes, надотряду костистых рыб Teleostei, отлавливали в природе (в Рязанской обл.) в декабре месяце. Самцов и самок содержали раздельно в холодильнике при темпера туре 4 6°С. Зрелую икру получали через 40 42 часа после инъекций самке хорионического гонадотропина в дозе 100 ME и осеменяли суспензией спермы [15]. Через 20 80 мин после оплодотворения и вплоть до первого деления дробления под бластодиск через желток со стороны вегетативного полюса икринки инъецировали 10 20 нл водного раствора, содер жащего рекомбинантную ДНК в концентрации 20 30 нг/мкл. Инъекцию проводили с помощью микроинъектора фирмы «Эппендорф» стеклянной микроиглой с диаметром кончика 12 14 мкм. Общее количество генетического материала варьировало, от 0,2 нг до 1,5 нг на икринку. Для инъекцийиспользовали 2 различных плазмиды, одна из которых содержала ген р галактозидазы Е. coli (lacZ), находящийсяпод промотором гена hsp70 дрозофилы (pD88), у которого5' нетранскрибируемая область содержит 88 пар нуклеотидов, прилегающих непосредственно к точке стартатранскрипции [16] (любезно предоставлена профессоромВ.А. Гвоздевым), вторая репортерный ген зеленого флуоресцентного белка (gfp), находящийся под промотором генамая область содержит 98 пар нуклеотидов. Икринки каждой серии инъекций получены от одной пары родителей. Заро дышей инкубировали в отстойной воде при комнатной тем пературе.ли с помощью субстрата X Gal по методу, описанному ранее [17, 18], с добавлением хлороквина для блокирования энсировали 2,5% м глютаральдегидом, отмывали фосфатно солевым буфером (PBS) и инкубировали 30 мин в растворе следующего состава: 5 мМ K3Fe(CN)6, 5 мМ K4Fe(CN)6 6Н20, 2 мМ MgCI2, 0,2% Тритон X 100, 150 мкг/мл хлороквина на PBS (рН=7,4 7,6). После этого добавляли X Gal до ко нечной концентрации 0,4 мг/мл и проводили окрашивание в течение суток при 35°С. Эмбрионы отмывали в PBS, пере носили в 30% сахарозу на PBS, содержащий азид натрия. Окрашенные эмбрионы подсчитывали и фотографировали.

Количественный анализ р галактозидазной активности в зародышах вьюна определяли по методу, описанному ра нее [19], с некоторыми модификациями. Зародышей, по 5 штук, помещали в пробирки типа «Эппендорф» и промывали буфером С 39 следующего состава: 3,2 mM NaH2P04x2H20, 4,2 mM NaHC03, 21 mM KCI, 65 mM NaCI. Буфер С 39 тща тельно отбирали, добавляли 200 мкл буфера Z (60 mM xx MgS04, 0,35% в меркаптоэтанола) и гомогенизировали, к гомогенату добавляли 100 мкл раствора субстрата о нит инкубировали его при 37°С 90 мин. Реакцию останавливали добавлением 1 мл 0,52 М раствора Na2C03. Оптическую плотность измеряли при Х=420 нм и Х=550 нм. Относитель деляли по формуле А4 Активность гена gfp определяли с помощью флуоресцен тного микроскопа «Axioscop 2 plus» или «Leica DM6000 В» при длине волны 450 490 нм.

Часть зародышей на различных стадиях развития нагре вали при 37°С в течение 30 мин, после чего через 2 4 часа подвергали гистохимическому окрашиванию с помощью тозидазы или исследовали зародыши под флуоресцентным микроскопом.

Положительным контролем служили зародыши, которым инъецировали рекомбинантную плазмиду, содержащую ген gfp под химерным регуляторным элементом, имеющим в своем составе немедленно ранний энхансер цитомегалови руса человека и промотор фактора элонгации 1 b человека (pCEEGFP) [20] (любезно предоставлена Dr. Т. Takada). Эк спрессию трансгена (флуоресценция зеленым цветом) анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа «Axioscop 2 plus» или «Leica DM6000 В» при длине волны 450 490 нм. Отрицательным контролем служили интак тные зародыши и интактные зародыши, подвергавшиеся нагреванию.

Результаты

Было проведено 5 серий микроинъекций плазмиды pD88, содержащей lacZ ген под контролем промотора гена ТШ дрозофилы, в оплодотворенные икринки вьюна на ста дии бластодиска. 108 зародышей и предличинок 1-5 су точного возраста были обработаны X Gal. Экспрессия lacZ гена носила мозаичный характер и проявлялась на всех исследованных стадиях развития в виде сине зеле ных штрихов, точек, пятен различных размеров, располо женных по отдельности или в виде небольших групп (рис. 1А и 1 В). У предличинок мозаичная экспрессия репортерного гена происходила на голове, в туловищных сомитах, хвосте, плавниках, а также в желточном синцитии и была пред ставлена, в основном, клетками эпидермиса и мышечными волокнами.

В некоторых сериях опытов эффективность экспрессии трансгена наблюдали у 100 % зародышей. Как видно из таб лицы, в которой представлены суммарные данные по всем 5 сериям опытов, начало экспрессии происходило у 66,7% су точных зародышей на стадии ранней средней гаструлы. Максимальная доля зародышей, экспрессирующих трансген, возрастала к 2 3 суткам, достигая 96,2-78,6% и постелен но снижалась к стадии вылупления из оболочек (57,1 — 52,9%). Следует отметить, что количество сине зеленых то чек и интенсивность окрашивания, отражающие экспрессию трансгена, были максимальными на стадии 2 3 суток раз вития. У 5 суточных предличинок экспрессия гена lacZ была представлена, в основном, в отдельных эпидермальных и мышечных клетках. Однако повышение концентрации трансгена или объема раствора при микроинъекции в ик ринки приводило к увеличению количества экспрессиру ющих зародышей, интенсивности экспрессии вводимого ге нетического материала и увеличению количества аномальных зародышей (рис. 1 С).

Нагревание 2 суточных зародышей в одной из серий опытов в течение 30 мин при 37°С и инкубация их при ком натной температуре в течение 2 часов с последующим ги стохимическим окрашиванием не приводила к повышению эффективности и интенсивности экспрессии трансгена (табл.). Ни в одном случае не было отмечено специфическо либо интактных зародышей, подвергавшихся нагреванию.

Полученные данные подтверждаются результатами и дру гой серии опытов, где 2 суточных зародышей подвергали аналогичной процедуре, после чего их гомогенизировали и отдельные суммарные гомогенаты (5 зародышей после нагре вания, 5 зародышей без нагревания и 5 контрольных зароды шей) окрашивали по методу, описанному выше, с добав и определяли уровень экспрессии количественным путем на спектрофотометре. Относительная фоновая активность 0,095 у.е., у зародышей, микроинъецированных плазмидой pD88, - 0,410 у.е., а зародышей той же серии после нагре вания - 0,280 у.е. Представленные данные свидетельствуют о том, что нагревание зародышей при 37°С в течение 30 мин и их обработка спустя 2 часа не приводит к увеличению эксп рессии трансгена.

Экспрессия gfp-гена под контролем регуляторных элементов гена теплового шока дрозофилы в эмбрионах вьюна

Было проведено несколько серий микроинъекций реком бинантной плазмиды pHLP, содержащей gfp ген под про мотором гена ТШ дрозофилы, в оплодотворенные икринки вьюна на стадии бластодиска. Экспрессия gfp гена носила мозаичный характер и проявлялась в виде отдельных точек, пятен на поверхности суточных зародышей, в желточном синцитии, а по мере развития зародышей в мышечных во локнах, в эпителиальных клетках эпидермиса, меланофорах и других типах клеток (рис. 2А, В, С).

В одной из серий опытов в икринки вьюна на стадии бла стодиска инъецировали в качестве контроля плазмиду pCEEGFP, содержащую gfp ген под химерным промотором, имеющим в своем составе немедленно ранний энхансер ци томегаловируса человека и промотор фактора элонгации 1 b человека. Этой плазмидой было проинъецировано 48 икри нок, в такое же количество икринок параллельно инъеци ровали плазмиду pHLP. Анализ экспрессии трансгенов у раз вившихся после микроинъекции суточных зародышей показал, что при инъекции контрольной плазмиды pCEEGFP 25 из 26 зародышей экспрессировали трансген, тогда как при инъекции плазмиды pHLP и эффективность, и интенсивность экспрессии трансгена была значительно ниже - только у 6 за родышей из 26, выживших через сутки после микроинъекции, наблюдалась экспрессия gfp гена. К 2 м суткам развития несколько из 11 зародышей, выживших после инъекции плазмиды pHLP, экспрессировали трансген (рис. ЗА).

Нагревание данной группы зародышей в течение 30 мин при 37°С и последующее инкубирование их при комнатной температуре в течение 2,5 часов не привело к заметному уве личению интенсивности экспрессии трансгена (рис. ЗВ). Не было отмечено явного усиления экспрессии gfp гена в данной группе зародышей ни через 4 часа, ни через сутки после на гревания. В то же время, после инъекции плазмиды pCEEGFP трансген интенсивно экспрессировался у 6 из 7 выживших 2 суточных зародышей (рис. ЗС). Дальнейшее наблюдение (до 12 суток развития) за зародышами с плазмидой pHLP данной серии экспериментов показало, что на 6 е сутки у 2 предли чинок из 6 интенсивная экспрессия трансгена проявлялась в мышечных, эпидермальных клетках и в желточном синцитии (рис. 4А). У одной из двух экспрессирующих предличинок была обнаружена сильная экспрессия gfp гена в хрусталиках глаз (рис. 4В), которая сохранялась до 12 суток развития. На 7 12 е сутки развития экспрессия gfp гена у обеих пред личинок отмечалась также в отдельных клетках или клонах кле ток эпидермиса, мышц, жабр, в меланофорах и других ти пах клеток (рис. 4С). Не было отмечено флуоресцентного свечения клеток у контрольных интактных зародышей либо контрольных зародышей, подвергавшихся нагреванию.

Обсуждение результатов

В настоящей работе показано, что экспрессия репортер ных генов lacZ и gfp под контролем регуляторных элементов гена ТШ hsp70 дрозофилы после микроинъекции в опло дотворенные икринки вьюна происходила во время раннего развития эмбрионов F0 поколения. Экспрессия трансгенов осуществлялась на достаточно высоком уровне независимо от структуры регуляторных элементов и носила мозаичный характер.

Ранее также наблюдалась мозаичная транзиентная эк спрессия репортерных генов в эмбрионах различных орга низмов F0 поколения при тестировании эффективности работы гетерологичных регуляторных элементов. В частно сти, промоторы Нох1 мыши и Нох2 человека обеспечивали высокую транзиентную экспрессию гена lacZ у суточных эмбрионов зебрафиш [1]; два различных промотора зебра фиш, специфичных для мышечных и эпителиальных клеток (mylz2 и krt8), строго направляли мозаичную тканеспеци фическую экспрессию gfp и rfp генов в ранних трансгенных эмбрионах медаки [4]; ген gfp под контролем нейронально го гена (GATA2) зебрафиш мозаично экспрессировался в эмбрионах Xenopus L. [21 ].

В ряде работ исследовали уровень активности репортер ных генов под индуцибельными регуляторными элементами генов ТШ. Показано, в частности, что ген люциферазы [luc] под промотором гена hsp70 дрозофилы после применения ТШ приводил к 55 кратному увеличению уровня экспрес сии трансгена в ранних эмбрионах устриц [10]; полностью изолированные регуляторные элементы гена hsp70 тиля пии обеспечивали индуцибельную экспрессию lacZ гена без предпочтения в какой либо ткани у эмбрионов зебрафиш и в культуре клеток карпа [3]; ген lacZ под контролем про моторов генов hsp70 мыши и Xenopus L. в трансгенных эмбрионах зебрафиш экспрессировался в ответ на действие ТШ [12]; высокий уровень люциферазной активности после локального воздействия ультразвуком проявлялся в тканях мы шей и крыс после внутривенной инъекции вектора с luc геном под промотором гена hsp70B дрозофилы [13]; индуцибельная экспрессия гена, кодирующего синий белок BFP, под промо тором гена hsp70 дрозофилы, наблюдалась в трансфециро ванных эмбриональных стволовых клетках мыши [14].

Эти данные свидетельствует о том, что промоторная активность, в целом, и механизмы тканеспецифической и индуцибельной экспрессии генов, в частности, высококонсер вативны у различных видов животных. В отдельных работах детально проанализированы регуляторные элементы гена hsp70 дрозофилы и других организмов, при этом показа но, что экспрессия трансгенов под этими элементами строго индуцибельна. В одном из исследований наблюда лась низкая фоновая экспрессия гена lacZ под контролем регуляторных последовательностей генов hsp70 мыши и Xenopus L. в трансгенных эмбрионах зебрафиш без тепло вого воздействия (несколько окрашенных клеток на эмбри он), однако после повышения температуры авторы отмечали значительное увеличение количества экспрессирующих клеток [12]. В наших экспериментах повышение темпера туры окружающей среды не приводило к явному усилению и без того довольно интенсивной экспрессии трансгенов под обоими вариантами регуляторных элементов гена hsp70 дрозофилы. Возможно, что это связано не столько со струк турой этих элементов, сколько с особенностями развития вьюна: в развивающихся икринках вьюна находится большое количество транскрипционных факторов, которые являются достаточно консервативными и способны к взаимодействию с гетерологичными промоторами, в результате чего для активации экспрессии трансгенов не требуется никаких до полнительных воздействий, достаточно только готовности транскрипционного аппарата собственного генома транс крибировать чужеродную ДНК [7]. Видимо, гомологи транс крипционных факторов HSF у различных видов рыб способны высокоэффективно связываться с промоторами генов hsp70 других видов животных, что подтверждает консерва тивную природу регуляторных районов гена hsp70 [12]. Дополнительным доводом в пользу наличия большого ко личества транскрипционных факторов широкого спектра действия в зародышах вьюна является тот факт, что lacZ ген под контролем высокоспецифичного промотора гена aS1 казеина быка [22], инъецированный в оплодотворенные ик ринки вьюна, также высокоэффективно экспрессировался в различных тканях 1 5 суточных зародышей (собственные неопубликованные данные).

По нашим данным, увеличение концентрации трансгенов при введении в яйцеклетки вьюна приводило к увеличению экспрессии трансгена как в отношении количества экспрес сирующих предличинок, так и интенсивности экспрессии в индивидуальных особях. Это сопровождалось повышением количества аномальных зародышей, что согласуется с дан ными других авторов [12].

Начало экспрессии трансгенов у суточных зародышей вьюна (в период ранней средней гаструлы) согласуется с данными наших предыдущих исследований [17] и совпадает с началом экспрессии чужеродной ДНК в период гаструляции у зебрафиш [23]. Максимальное количество экспрессиру ющих особей вьюна (до 100% в отдельных сериях экс периментов) без теплового воздействия мы наблюдали у 2 3 суточных зародышей (в период перед вылуплением при формировании органов осевого комплекса и сразу же пос ле вылупления из оболочек), что полностью совпадает с нашими предыдущими данными при инъекции lacZ гена под контролем промоторов RSV и CMV в икринки вьюна [17, 2]. Наивысший пик транзиентной экспрессии трансгенов от мечался и в соответствующий период развития (гаструла -начало сегментации) у 12 24 часовых эмбрионов зебрафиш F0 поколения после инъекции репортерных генов под регу ляторными элементами вирусов SV 40 и RSV [23], Нох генов (82,7% экспрессирующих особей) [1], генов hsp70 мыши и Xenopus L. [12], нейронального гена GATA2 [21].

Гены ТШ у зебрафиш в нестрессовых условиях экспрес сируются уникальным образом. В частности, ген hsp90alpha экспрессируется во время нормальной дифференцировки в мышечных волокнах, ген hsp70 4 во время развития хрусталика глаза [24, 8]. Однако под воздействием стресса экспрессия трансгенов с гетерологичными hsp70 промо торами у эмбрионов зебрафиш не имеет специфического характера и сходна с таковой, например, при использова нии SV40 промотора, который является конститутивным [3]. В наших экспериментах экспрессия трансгенов не носила предпочтительного характера по отношению к каким либо органам и тканям и наблюдалась в эпителиальных и пигмен тных клетках эпидермиса, мышечных волокнах, желточном синцитии, хрусталике глаз. Аналогичный характер экспрессии мы наблюдали также после введения lacZ гена с промо торами RSV и CMV [2].

Таким образом, в ранних эмбрионах вьюна показана достаточно высокая транзиентная мозаичная активность репортерных генов lacZ и gfp под контролем двух отличаю щихся регуляторных элементов гена hsp70 дрозофилы без применения теплового шока. Полученные результаты сви детельствуют о том, что данную модель удобно использо вать для быстрого тестирования промоторной активности генов, принадлежащих к различным таксономическим группам.

Подняться вверх сайта