Поиск Кабинет

Экспрессия генов, трансфицированных в мезенхимные стволовые клетки человека

Гены & Клетки: Том V, №4, 2010 год, стр.: 16-23

 

Авторы

Смирнихина С.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В статье представлен обзор о способах трансфекции МСК и их эффективности. Проведен анализ экспрессии трансфицированных генов при стабильной и транзиторной трансфекции. Указаны возможные причины снижения экспрессия трансгенов и пути ее повышения.

Клеточная терапия с использованием мультипо-тентных мезенхимных стволовых клеток человека (МСК) считается одним из наиболее перспективных направлений медицины. За последние 10 лет опубликовано более 10 тыс. статей с описанием морфологии, особенностей пролиферации, дифференцировки и успешном применении для лечения болезней как самих МСК, так и их производных in vivo (на животных и у людей). МСК сейчас используют практически во всех областях медицины: от пластической хирургии до возмещения больших дефектов тканей и органов[1—4].

Использование МСК в регенеративной медицине неслучайно. Эти клетки есть у каждого человека, и их достаточно просто выделить и культивировать. МСК содержатся в костном мозге, жировой ткани, пуповинной крови, а также, по многочисленным свидетельствам, во многих других органах. МСК из всех этих источников характеризуются общими чертами: адгезивность, экспрессия определенного спектра поверхностных маркеров и способность к дифферен-цировке в несколько клеточных линий[5—8]. В последнее время источником МСК считают жировую ткань (ЖТ), потому что из нее можно выделить намного больше клеток -1 г жира содержит 5x103 МСК, что в 500 раз больше чем в 1 г костного мозга[9]. По другим данным, клеток, получаемых из ЖТ, больваскулярной фракции[10], в которой 5,1% МСК, то получения материала является минимально инвазивной и осуществляется под местной анестезией.

При аллотрансплантации МСК относительно не-иммуногенны и даже отмечено, что они могут незначительно подавлять иммунный ответ реципиента, что позволяет им длительно выживать после введения для оказания терапевтического эффекта[12]. Более того, у МСК описано еще одно свойство, позволяющее широко применять их в клеточной терапии: при парентеральном введении МСК стремятся к очагу некоторых видов опухолей[13—17].

Помимо всех выше перечисленных достоинств, МСК экспрессируют широкий спектр цитокинов и факторов роста, которые оказывают паракринные эффекты: осуществляют иммуномодуляцию и трофику[18], стимулируют гемопоэз in vitro[19, 20]. Также есть данные, что МСК оказывают проангио-генный эффект, причем у МСК, выделенных из жировой ткани, он выше, чем у МСК из костного мозга[21]. Кроме того, МСК усиливают неоангиогенез за счет дифференцировки в эндотелиальные клетки и выделения множества ангиогенных факторов, таких как VEGF, bFGF и ангиопоэтин-1[22—24].

Трансфекция МСК

Несмотря на положительный терапевтический эффект МСК, введенных в организм, всегда желательно его усилить. Одним из методов усиления терапевтического эффекта является трансфекция, то есть введение в клетку генетического материала, способного экспрессироваться, таким образом, трансфекция необходима как элемент генной и клеточной терапии.

Трансфекция известна еще с середины 60-х годов; тогда ее начали применять для трансформации бактериальных клеток[25, 26]. В это же время стали изучать мультипотентные клетки из костного мозга[27]. Тогда их рассматривали как прогениторные гемопоэтические клетки, поэтому в литературе можно встретить публикации по трансфекции этих клеток. Трансфекция же мезенхимных стволовых клеток началась лишь в конце 90-х[28, 29].

Существуют три основные задачи, которые можно достичь путем трансфекции МСК: добиться дифференцировки МСК в определенные клетки; получить культуру с гиперэкспрессией какого-либо полезного для лечения заболевания гена (фактора роста, ангиогенеза, цитокина и т.п.); обеспечить экспрессию генов, повышающих выживаемость МСК, трансплантируемых зачастую в поврежденные, затронутые воспалением ткани, находящиеся в состоянии гипоксии.

Наиболее применимой является трансфекция МСК с целью дальнейшей дифференцировки их в определенную линию. Дифференцировки можно добиться и путем простого культивирования с определенными факторами, однако при трансфекции МСК дифференцируются быстрее и более эффективно. Кроме того, генетическая модификация позволяет дифференцировать клетки в такие узкоспециализированные линии клеток, которые невозможно получить путем культивирования с различными химическими соединениями.

Описано много примеров дифференцировки МСК in vitro, при которой получают культуру клеток с заданными свойствами, пригодных для трансплантации в поврежденный орган[30—32]. В то же время, есть данные и о дифференцировке МСК in vivo. Например, после трансфекции МСК геном Osx (остерикса), их трансплантируют лабораторным животным. Диффе-ренцировка происходит уже in vivo. Указывается на 85% эффективность такого подхода для лечения повреждений свода черепа[33].

С помощью трансфекции SF-1 (стероидогенный фактор 1) можно дифференцировать МСК в линию клеток, продуцирующих стероидные гормоны, для заместительной гормональной терапии при стероидной недостаточности[34]. Для лечения ишемической болезни сердца также можно применять трансфицированные МСК. При трансфекции их геном EFNB2 ГэфринБ2) клетки дифференцируются в эндотелиальные клетки сосудов, которые можно использовать в терапии[35]. Также при помощи трансфекции генами ТЕЙТ (обратной транскриптазы теломераза) и Myocd Гмышиного миокардина А) в МСК можно добиться их дифференцировки в сокращающиеся кардиомиоциты[36]. Есть данные о том, что МСК с помощью трансфекции можно дифференцировать в клетки гиалино-подобного хряща iTGF-betal — трансформирующий фактор роста бета 1)[37], адипоциты (неспецифические siRNA)[38] и некоторые другие типы клеток.

Трансфекция МСК может проводиться с целью гиперэкспрессии определенных факторов. Так, трансфицированные геном Л/-/0-7 (гем-оксигеназы-1) МСК вводили крысам с постинфарктными изменениями сердца. Показано, что такие клетки лучше выживали, стимулировали экспрессию различных факторов роста и оказывали больший терапевтический эффект, чем введенные неизмененные МСК[39]. Аналогичное исследование проведено в Китае. Крысам с инфарктом миокарда вводили МСК, трансфицированные геном VEGF165 (фактор роста эндотелия сосудов 165). Такие клетки стимулировали ангиогенез и ми-огенез больше, чем нетрансфицированные МСК[40]. Для лечения респираторного дистресс-синдрома успешно применяли трансплантацию МСК, трансфицированных геном ANGPT1 (ангиопоэтина 1). Такие клетки оказывают, прежде всего, противовоспалительный эффект. В этом исследовании, как и в предыдущих, показано, что трансфицированные МСК эффективнее нетрансфицированных[41].

Еще одним важным направлением в лечении заболеваний является создание инсулин-продуцирую-щих клеток. Для этого МСК трансфицируют геном hPPI (препроинсулина) и через 3 недели получают культуру, синтезирующую инсулин и С-пептид, которую можно применять для лечения сахарного диабета[42].

Использование неизмененных МСК ограничено также временем их жизни в поврежденном органе. Показано, что МСК с трансфицированным геном Bcl-2 (антиапоптотический белок) показывают лучшую выживаемость, реваскуляризацию и улучшение работы сердца при постинфарктной дисфункции левого желудочка[43].

Таким образом, трансфекция МСК является важным и зачастую необходимым элементом генной и клеточной терапии. Доказано, что эффективность терапии трансфицированными МСК намного выше, чем при использовании неизмененных МСК. Кроме того, получить некоторые линии клеток можно только с использованием трансфекции. Анализ литературы показывает, что трансфекция МСК широко проверена и возможность ее не вызывает сомнений.

Наиболее эффективными «инструментами» доставки целевых генов являются векторы на основе лентивиру-сов. Такие векторы используются с середины 90-х годов[44, 45] с целью стабильной трансфекции. Эффективность и длительность персистирования вектора в клетке очень высока, благодаря свойству ленти-вируса встраиваться в геном[46]. Однако встраивание само по себе является опасным, так как может приводить к инсерционному мутагенезу[47]. Интеграция в геном происходит хаотично на различных хромосомах. Но при этом в одном из исследований было показано, что из 28 различных вставок, картированных в человеческом геноме, 24 были обнаружены в кодирующей области ранее идентифицированных генов[48].

Менее эффективными, но тоже часто применяемыми векторами для трансфекции являются другие типы ретровирусных векторов. Они используются реже, потому что обладают всеми отрицательными качествами лентивирусов (встраивание в геном, длительная персистенция в клетке), а эффективность трансфекции с их использованием ниже[49—52].

Некоторые вирусные методики позволяют проводить транзиторную трансфекцию. Одним из примеров является аденовирусный вектор. Он отличается высокой эффективностью трансфекции для разных типов клеток и генов разной величины[53]. Для рекомбинантного аденовирусного вектора показано, что генетическая конструкция с целевым геном функционирует в клетке в виде эписомы. Это означает, что во время деления клетки такой ген не репродуцируется. Этот вектор обладает высокой эффективностью трансфекции и не встраивается в геном, и поэтому является самым используемым в настоящее время. Однако аденовирусные векторы очень иммуногенны[54] и могут даже приводить к тяжелому комбинированному иммунодефициту[55].

При использовании вирусных векторов существует большой риск из-за их потенциальной онкогенности, токсичности и иммуногенности[56—61].

Суммируя данные, можно отметить, что вирусные векторы являются эффективными средствами для трансфекции целевого гена в клетки. Однако побочные эффекты их применения столь существенны, что необходимо использовать другие, более безопасные методы.

онного мутагенеза. Они также не вызывают иммунологических реакций, которые характерны для вирусных векторов. Однако их самый большой недостаток — низкая эффективность трансфекции по сравнению с вирусными системами[54].

Обычно используются методы на основе липофек-ции[62, 63], электропорации[64] и нуклеофекции[65]. Однако их эффективность даже при отлаженной методике ниже, чем у вирусных векторов. Более того, из-за своей токсичности данные методы зачастую приводят к массивной клеточной гибели[66, 67].

Липофекция является наиболее простой методикой, но самой токсичной для клеток и наименее эффективной[67]. Электропорация требует тщательного подбора условий для разных типов клеток и сопряжена с достаточно большой гибелью клеток, хотя по эффективности этот метод значительно выше, чем липофекция[68—70]. Относительно недавно был предложен оптимизированный метод электропорации непосредственно в ядро клетки — нуклеофекция[71, 72]. Все чаще для трансфекции МСК применяют именно этот метод, потому что его эффективность может достигать 90%, что сопоставимо лишь с вирусными векторами[65, 73].

Помимо перечисленных выше невирусных методов трансфекции применяются также в качестве векторов искусственные хромосомы[74—77], наносферы[78], метод электропорации единичной клетки[79] и другие.

Выбор метода трансфекции определяется задачами исследования. Если трансфицированные клетки предполагается использовать для терапии, то наименее предпочтителен метод липофекции, так как липо-фектные конструкции очень токсичны. Однако его с успехом можно применять для исследовательских целей, так как этот метод самый простой. Нуклеофекция, так же как и электропорация, подходит как для исследовательских целей, так и для терапевтических.

Возможность трансфекции МСК подтверждается множеством исследований. Клетки можно трансфицировать разными генами. Условно их можно разделить на гены-репортеры и целевые гены. При использовании первых, экспрессию можно увидеть чаще всего на нефиксированных живых клетках с помощью флюоресцентного микроскопа или специфической окраски. К ним относятся гены GFP, eGFP, YGP, DsRed, LacZ[80, 78, 80, 81]. Такие гены служат лишь моделью для оптимизации протокола трансфекции и дальнейшего ведения культуры. Чаще всего гены-репортеры используют как первый этап, после чего переходят на целевые гены. Это могут быть различные факторы дифференцировки, факторы ангиогенеза и многие другие гены (см. выше).

С помощью нуклеофекции успешно введена кДНК гена scFv EGFRvlll (ген кодирующий антитела scFv к продукту гена EGFRvlll) в МСК человека. Трансфицированные клетки экспрессировали на своей поверхности одноцепочечные антитела (scFv) к продукту гена EGFRvlll (рецептор эпидермального фактора роста), который регистрируется как минимум у половины опухолей. Создав клеточную культуру с антителом к данному гену, ученые стремились разработать таргетную терапию онкологических заболеваний путем миграции МСК к клеткам опухоли[82]. Успешно трансфицированы МСК геном VEGF165. Показано, что экспрессия этого гена в МСК достоверно увеличилась после трансфекции[83]. С помощью электропорации в МСК можно ввести ген ЕРО (эритропоэтина) и индуцировать дифферен-цировку МСК в эритроидные колонии[84].

Нуклеофекцией удалось стимулировать МСК к диф-ференцировке в остеогенном направлении. При трансфекции генами hBMP-2 и hBMP-9 (костного морфогенетического белка) МСК наблюдали повышенное отложение кальция в культурах, а при трансплантации лабораторным мышам клетки образовывали эктопические участки костей[85].

Как видно из этого раздела, трансфекция МСК проходит успешно. Для этого разработаны различные методики. Однако трансфицированные клетки апробированы пока только в исследованиях на животных.

Анализ функции трансфицированных генов

Существует 2 вида трансфекции: стабильная (длительная) и транзиторная (транзиентная, временная). Основное их отличие состоит в том, что при стабильной трансфекции длительность гиперэкспрессии измеряется месяцами (до полугода), а при транзиторной трансфекции гиперэкспрессия трансгена существует недолго — от 7 до 21 дней (в зависимости от типа клеток, генетической конструкции и метода трансфекции).

Meyerrose et al. показали, что при трансфекции МСК ретровирусным носителем экспрессия целевого гена длится до 75 дней[86]. При использовании лентивирусного вектора с eGFP количество экспрессирующих клеток не уменьшилось даже через 5,5 мес. после трансфекции (на 3-й день было 76% позитивных клеток, через 5,5 мес. — 87,9%). Экспрессия, определенная измерением флюоресценции, за это время лишь незначительно снизилась[87]. Данные примеры отражают стабильную трансфекцию МСК.

Как уже было отмечено ранее, аденовирусный вектор обеспечивает временную трансфекцию. При введении вектора с геном VEGF165 в МСК пик экспрессии пришелся на 7-й день (35%), длительность же составила 14 дней.[40]. При использовании вектора с геном eGFP пик флюоресцентных клеток пришелся на 4-й день после трансфекции (65%). Начиная с 16 и до 24 дня уровень GFP-позитивных клеток сильно упал (до 2%), к 32-му дню только в 0,5% клеток экспрессировался ген GFP[88]. Palmer с коллегами наблюдал 80% эффективность и длительность экспрессии 21 день с использованием аденовирусного вектора с геном TGF-$1 (хондрогенного фактора)[89]. При трансфекции гена HSV1-tk (тимидинкиназы) в МСК пик трансфекции пришелся на 24 ч после нее, после чего начал медленно снижаться. Через месяц экспрессия трансгена не отличалась от контрольной нетрансфицированной группы МСК[90].

Липофекция, как и аденовирусный вектор, позволяет лишь временно трансфицировать клетки. Длительность экспрессии при этом методе примерно такая же. В исследовании Yang et al. МСК трансфицировали eGFP и геном HIF-1— (фактором индуцируемом гипоксией). Слабую флюоресценцию увидели через 12ч, через 24 ч появилась интенсивная флюоресценция, пик ее пришелся на 72 ч, длилась интенсивная флюоресценция 1 нед., после чего стала снижаться[62]. При использовании аналогичной плазмиды другие исследователи наблюдали флюоресценцию 14 дней[80]. В отдельных работах продемонстрирована возможность получения с помощью липофекции стабильно трансфицированных МСК. В стабильно трансфицированных МСК (линия HFCL) конструкцией с колониестимулирующим фактором (pIRESIneo/ hGM-CSF) оценили интеграцию, транскрипцию и экспрессию трансгена, подтвердив не только успешную стабильную трансфекцию, но и продукцию биологически активного белка в клеточном супернатанте[91 ].

При использовании нуклеофектора отмечено, что пик экспрессии DsRed приходится на 4-й день после трансфекции, далее наблюдается медленное снижение, а после 14 дня резкое снижение экспрессии до 21 дня[92]. В другом исследовании с геном GFP показано, что даже после сортировки трансфицированных клеток через 2 нед. только 25% экспрессируют ген-репортер, а через 3 нед. — 10%[69].

Тип трансфекции помимо генетической конструкции определяется еще и наличием селекции или сортировки. Сортировку проводят с использованием специальных приборов — сортеров. При этом отбираются только трансфицированные клетки, далее такую линию культивируют. Селекцию же проводят при помощи антибиотика (например, G418), к которому невосприимчивы клетки с плазмидой, несущей ген устойчивости. При этом клетки без генетической конструкции погибают. Эти методы позволяют добиваться стабильной трансфекции даже при использовании плазмид[93].

У каждого вида трансфекции есть свои плюсы и минусы. Так, для стабильной трансфекции плюсом является то, что можно создать клеточную культуру, стабильно экспрессирующую какой-либо фактор. После трансплантации клеток это позволит в течение длительного времени рассчитывать на терапевтический эффект. Однако, длительная «работа» трансплантата в организме реципиента может рассматриваться и как отрицательный момент, так как такие клетки хуже поддаются контролю. Поэтому транзиторная трансфекция, несмотря на короткий период гиперэкспрессии трансгена, более предпочтительна, так как позволяет легче управлять элиминацией из трансфицированных клеток. Кроме того, в ряде случаев, например при направленной дифференцировке МСК, необходима лишь кратковременная экспрессия трансгена, которая должна быть прекращена для успешного применения полученных клеток.

Влияние трансфекции на состояние стволовых клеток (морфология, пролиферация)

Как отмечалось ранее, трансплантированные МСК выполняют важную паракринную функцию, стимулируя выработку факторов роста, ангиогенеза, интерлейкинов. Поэтому важно, чтобы после трансфекции МСК сохраняли свои свойства, морфологию и способность к пролиферации и дифференцировке.

Для лентивирусной трансфекции показано, что она не влияет на дифференцировочный потенциал МСК[50]. При использовании ретровирусного вектора также доказано, что МСК сохраняют свою способность к дифференцировке, иммунофенотип, миграционные возможности и плюорипотентность[86, 94]. Аденовирусные векторы также не влияют на жизнеспособность и дифференцировочный потенциал МСК[88, 95].

В отношении химической трансфекции ситуация не такая благоприятная: выше уже отмечалась токсичность липофекции. Так, при использовании Lipo-fectamine2000 отмечено значительное изменение морфологии МСК: клетки становились больше в размерах, появлялись видимые везикулы в цитоплазме. Также отмечалась значительная гибель МСК по срав- нению с нетрансфицированным контролем. Использование этого реактива ведет к значительному снижению пролиферации и адипогенного потенциала МСК. Более того, Lipofectamine2000 и Lipofectin приводят к снижению колониеформирующей способности МСК. В отличие от них, Fugene не ведет ни к каким изменениям в МСК[67]. По другим данным липофекция не влияет на пролиферацию МСК[62].

При использовании электропорации не отмечено ее влияние на клеточный рост, снижение дифферен-цировочного потенциала и изменение иммунофенотипа[67]. При нуклеофекции гибель МСК не увеличивается[65].

Как уже отмечалось, низкая эффективность и длительность трансфекции требует проведения селекции антибиотиками и увеличения времени культивирования или сортировки, а это может привести к потере стволовости[51, 96].

Кроме метода трансфекции, есть зависимость и от того, чем трансфицируют МСК. Так, показано, что при трансфекции GFP меняется морфология МСК. Наблюдается 2 типа клеток: мелкие фибробластоподобные и большие полигональные. При низких дозах GFP в культуре присутствует только один тип — полигональные клетки[89]. Это важно иметь в виду, потому что GFP, как уже упоминалось, используется зачастую для отработки протокола трансфекции и культивирования.

Подводя итог по влиянию трансфекции на состояние стволовых клеток, следует отметить, что липофекция не только токсична для МСК и вызывает их массовую гибель, но и способна менять их свойства и влиять на пролиферацию. Для применения в терапевтических целях лучше выбирать вирусные методики или на основе электропорации.

Механизмы регуляции экспрессии трансфицированных генов

Как видно из раздела по анализу функции трансфицированных генов, экспрессия при транзиторной трансфекции падает. Это логично, так как генетическая конструкция не встраивается в геном и, с одной стороны, при делении клетки не дуплицируется, то есть снижается ее относительное количество, с другой стороны, она элиминируется за счет внутриклеточной деградации или выбрасывается из клетки. Однако существуют данные о том, что эпигенетические механизмы регуляции экспрессии также являются немаловажным звеном в сайленсинге трансфицированных генов.

Сайленсинг (молчание) гена — это механизм, контролирующий попадающие в клетку генетические элементы и обеспечивающий защиту организма от латентной вирусной инфекции. Зволюционно сайленсинг был направлен на поддержание геномной стабильности организма[97, 98]. Схожие механизмы также лежат в основе инактивации Х-хромосомы, импринтинга и экспрессии тканеспецифических генов. Данная регуляция носит название эпигенетической, а способы достижения сайленсинга — эпигенетической модификацией. В конце 90-х годов XX в. были описаны основные механизмы, лежащие в основе молчания генов у эукариотов. Результаты исследований показывают, что доминантную роль в молчании генов играет метилирование ДНК и деацетилирование гистонов[99, 100].

Метилирование ДНК осуществляется с помощью класса ферментов, называемых ДНК-метилтрансфе-разами, которые ковалентно связывают метальную

В норме невирусные векторы функционируют экстрахромосомно и, таким образом, при их использовании уменьшается риск вставки в геном и инсерцигруппу остатка цитозина в пределах CpG-островка[101 ]. CpG-островки расположены в основном в про-моторных областях генов человека[102]. После метилирования ДНК эти регионы распознаются отдельными белками (метил-СрО-связывающие белки (MBD)). Эти белки связывают метилированные CpG-островки и тем самым блокируют доступ факторам транскрипции, которые обычно связываются с промотором. MDBs также привлекают ферменты — гисто-новые деацетилазы (HDACs), которые катализируют удаление ацетильной группы из s-аминогрупп специфического остатка лизина и вызывают компактную упаковку ДНК. Конечный результат — это сжатый хроматин, который в дальнейшем уменьшает доступ факторам транскрипции к их промоторным сайтам связывания, приводя к молчанию гена (рис.)[103].

На основании вышесказанного можно заключить, что функционально метилирование ДНК и деацети-лирование гистонов тесно связаны и практически не могут проходить отдельно. Так, метилирование ДНК неизбежно приводит к деацетилированию гистонов. Следовательно, при изучении влияния эпигенетических механизмов регуляции на функцию генетической конструкции можно остановиться на одном лишь методе, косвенно подтверждая другие.

Сейчас к эпигенетическим процессам также относят действие микроРНК. Феномен РНК-интерферен-ции заключается в том, что микроРНК обеспечивают специфическое узнавание комплементарных мРНК сложным ферментативным комплексом RISC, который либо разрушает мРНК, либо комплементарно связывается с ней, приводя к существенному снижению уровня трансляции[104]. МикроРНК сейчас активно изучаются, но данных по их влиянию на экспрессию трансфицированных генов пока нет.

Трансфицированные в клетки генетические конструкции как чужеродные объекты должны подвергаться эпигенетическому контролю. Существует множество работ, доказывающих это положение при стабильной трансфекции[49, 105—109]. При транзиторной трансфекции время нахождения генетической конструкции в клетке невелико, поэтому можно было предположить, что эпигенетические процессы не успевают включиться в процесс снижения экспрессии. Однако это не так.

Существует прямое доказательство влияния эпигенетической регуляции в клетке (молекулярно-генетические реакции) и косвенное (применение различных препаратов обратного действия). Первое сделать довольно сложно при транзиторной трансфекции, поэтому в литературе есть лишь небольшое количество примеров. Так, при трансфекции вирусом Эпштейна — Барр эмбриональных стволовых клеток человека показано, что промотор Pgk-1 метилирован через 7 дней после трансфекции. Параллельно также были трансфицированы клетки 293-EBNA1, в которых метилирование не было показано[110]. Это позволяет предположить, что сайленсинг трансфицированных генов в результате эпигенетических процессов зависит не только от генетической конструкции, но и от типа клеток.

Намного больше публикаций, косвенно подтверждающих активацию метилирования/деацетилирования. При транзиторной трансфекции макрофагов геном CYP27A1 показано, что 5-азацитидин (деметилирующий агент) усиливает экспрессию трансфицированного гена[111]. Еще одно исследование было проведено на эндотелиальных клетках аорты телят. Их трансфицировали аденовирусным вектором с генами LacZ (галактозидазы) и VEGF165. Было отмечено, что при культивировании клеток с трихостатином А (ингибитор гистоновых деацетилаз) экспрессия трансгенов увеличивается в 3 и более раз. Однако к 14—21 дню падает, как и в случае неприменения этих препаратов[112]. В обоих исследованиях использовали генетические конструкции с СМУ-промотором.

Модификация гистонов играет важную роль в сай-ленсинге трансгенов. Это доказывает исследование Ishiguro (2004). Транзиторно трансфицировали культуры клеток F-MEL и ЗТЗ липосом-опосредованным методом. Использовали генетические конструкции с генами-репортерами под разными промоторами. Сразу после трансфекции клетки культивировали с различными факторами, модифицирующими хроматин и нивелирующими действие эпигенетических регуляторов клетки. В этом исследовании доказано положительное действие всех препаратов на экспрессию всех генетических конструкций (в том числе и под CMV-промотором) на обоих типах клеток. Наиболее эффективным оказался трихостатин А, что подтверждает важную роль гистонового деацетилирования в «патогенезе» сайленсинга трансгенов[113].

Как видно из приведенных выше примеров, при транзиторной трансфекции метилирование ДНК и де-ацетилирование гистонов играют существенную роль в молчании генов. Все эти исследования были проведены с использованием различных клеточных культур, но в отношении МСК человека таких данных нет. Хотя влияние метилирования ДНК при транзиторной трансфекции и доказано на многих клетках, нельзя забывать, что эпигенетические процессы по-разному протекают в разных культурах клеток и, следовательно, в МСК могут не играть существенной роли.

Способы регуляции экспрессии трансфицированных генов

Доказано, что эпигенетические процессы потенциально обратимы с помощью фармакологических препаратов — деметилирующих агентов и ингибиторов гистоновых деацетилаз.

Наиболее известным препаратом первой группы является 5-азацитидин(5-аза-С), первоначально разработанный как нуклеозидный антиметаболит для острой миелоидной лейкемии[103]. Позднее его использовали в лечении рака и талассемии[114]. Сейчас азацитидин (видаза) рекомендован FDA для лечения миелодиспластического синдрома[115]. Биохимически 5-аза-С — аналог цитозина, который встраивается во вновь синтезированную ДНК на место део-ксицитидина и формирует ковалентные связи с ДНК-метилтрансферазой[116]. Это взаимодействие ведет к прогрессивному истощению ДНК-метилтранс-феразы в клетке. При этом геном может оказаться гипометилирован. Данный препарат очень токсичен и обладает потенциальным канцерогенным действием.

Во многих исследованиях доказана положительная роль 5-аза-С на экспрессию трансфицированных генов. Так как метилирование ДНК более характерно для стабильной трансфекции, то большинство исследований проведено с использованием ленти-и ретровирусных векторов. Так, Krishnan М. et. al. проводили оценку эффективности 5-аза-С в отношении экспрессии гена Flue на крысиных кардиомио-бластах. Результаты показали, что экспрессия постепенно снижалась в течение 8 мес. С помощью 5-аза-С экспрессию гена удалось значительно увеличить[103]. При стабильной трансфекции мышиных эмбриональных клеток карциномы также доказано, что 5-аза-С ведет к увеличению экспрессии «молчащих» клеточных линий. Показана положительная корреляция дозы препарата и уровня экспрессии[117].

Кроме того, были проведены исследования и in vivo. При введении стабильно трансфицированных клеток U937 мышам ученые наблюдали снижение экспрессии трансгенов — LacZ и FtSVtk. После применения 5-аза-С уровень экспрессии существенно вырос[108]. Также было проведено похожее исследование с использованием такого же вектора, но введенного в фибробласты мыши[118]. Результаты обоих исследований похожи, что говорит об одних и тех же механизмах молчания ретровирусов в разных типах клеток.

Как уже отмечалось выше, не только метилирование ДНК играет важную роль в молчании гена-ре-портера, деацетилирование также оказывает большое влияние. Трихостатин А (ТСА) — это антибиотик, ингибирующий ферменты деацетилирования гистонов, что приводит к ослаблению компактной суперспирали хроматина, открывая доступ белкам регуляторам транскрипции к промоторному региону для построения ДНК[119].

Существует множество примеров эффективности данных препаратов в увеличении уровня экспрессии трансгенов. Одно из таких исследований было проведено Bartoli A. et al. на основе ретровирусного вектора с генами-репортерами FtSVtk и LacZ, вводимыми в линию клеток U937. Они достоверно доказали восстановление экспрессии гена LacZ в течение 48 ч после применения ТСА in vitro. Реактивация экспрессии носила дозозависимый характер[114]. В другом исследовании также показано, что применение ТСА существенно повышает экспрессию трансфицированного гена[112].

Выше было описано, как взаимосвязаны метилирование ДНК и деацетилирование гистонов. По этой причине часто проводят комбинированное воздействие деметилирующим агентом и ингибитором гис-тоновых деацетилаз для увеличения экспрессии трансфицированного гена. Так, применение ТСА в комбинации с 5-аза-С поддерживает экспрессию стабильно трансфицированного гена более чем на 90 дней в клонах клеток U937[114]. Это еще раз показывает, что все эпигенетические процессы в клетке взаимосвязаны.

Несмотря на всю эффективность данных препаратов, их польза нивелируется нестабильностью и токсичностью при пероральном введении, а также, как выше было отмечено, возможным канцерогенным действие 5-аза-С. Поэтому эти вещества используют в основном для исследовательских целей. Однако для увеличения экспрессии трансгенов до сих пор продолжаются поиски веществ, обладающих меньшей токсичностью. Так, был предложен аналог цитозина — зебуларин[120]. Но его использование также ограничено, как и его предшественников.

Суммируя, можно отметить, что есть эффективные меры борьбы с сайленсингом трансгенов, которые приводят к повышению экспрессии целевых генов in vitro и in vivo. Однако токсичность, канцерогенное действие и потенциальное изменение морфологии МСК ограничивает их применение в клинических целях.

Заключение

Как видно из анализа литературы, МСК сами по себе оказывают положительное действие на организм, однако этого действия бывает недостаточно. Поэтому было предложено использовать трансфекцию с целью усиления терапевтического эффекта. Показано, что трансфицированные определенными факторами МСК оказывают больший эффект, чем нетрансфицированные. Однако трансфекция МСК не так широко используется, как трансфекция других клеток. Это связано, прежде всего, с трудностями культивирования и с тем, что МСК труднее трансфицировать. Поэтому еще не до конца изучены механизмы и поведение МСК после трансфекции. Разработка этого направления, безусловно, перспективна.

При транзиторной трансфекции со временем генетическая конструкция элиминируется из клетки, с этим, в основном, связывают падение экспрессии трансгена. Однако на различных типах клеток доказано, что на этот процесс также оказывают влияние эпигенетические процессы, происходящие в клетке по отношению к введенной конструкции.

Основными механизмами эпигенетической регуляции трансгена являются метилирование ДНК и деацетилирование гистонов. Эти процессы взаимосвязаны, поэтому, доказав наличие одного из них, можно с большой вероятностью утверждать и о наличии другого. Существуют пути увеличения экспрессии введенного гена в результате эпигенетических процессов. Это применение деметилирующих агентов и блокаторов гистоновых деацетилаз, которые оказывают довольно сильное положительное действие, но очень токсичны для организма, а некоторые из них, к тому же, потенциально онкогенны.

Автор выражает благодарность академику Н.П. Бочкову (МГНЦ РАМН) за общие рекомендации и критическую оценку обзора и А.В. Лаврову (МГНЦ РАМН) за помощь в написании статьи.

Подняться вверх сайта