Поиск Кабинет

Экспрессия эпителиальных (ЕМА, ББА) и мезенхимальных (a-SMA, CD31) антигенов в клетках пульпы зубов человека

Гены & Клетки: Том IV, №1, 2009 год, стр.: 52-58

 

Авторы

Шамсутдинов М.И., Титова МА., Салеева Г.Т., Киясов А.П.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В отличие от мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга одонтобласты не являются клетками истинно мезенхимального происхождения и относятся к клеткам зктомезенхимы, которые развиваются из нервного гребня. Кроме маркеров нервной ткани, в частности — нестина, дифференцирующиеся одонтобласты экспрессируют цитокератин 19. Нами была выдвинута гипотеза о том, что одонтобласты и их предшественники могут характеризоваться не только цитокератинами, но и другими маркерами эпителия, с помощью которых станет возможно определить как сами предшественники (стволовые клетки) одонтобластов, так и их нишу.

Для проверки этой гипотезы была изучена пульпа зубов человека (58 зубов), удаленных по ортодонтическим показаниям при воспалении пульпы или заболеваниях пародонта. Парафиновые срезы обрабатывали антителами, которые используются для выявления популяции стволовых клеток (с-kit, CD 31, CD 34) в том числе и в пульпе (—-SMA). Одновременно был проведен анализ экспрессии двух эпителиальных антигенов, которые широко используются для выявления эпителиальных клеток и дифференциальной диагностики опухолей (EMA, ESA).

В нашем исследовании впервые показано, что одонтобласты как эктомезенхимные клетки экспрессируют эпителиальные маркеры и, в частности, эпителиальный мембранный антиген.

Зубы и окружающая их кость челюстей развиваются в результате взаимодействия эпителиальных и мезенхимальных (эктомезенхимальных] клеток, поэтому в зубе можно выделить две популяции стволовых клеток: эпителиальные, из которых образуются амелоблаты, и мезенхимальные, дающие начало одонтобластам, цементобластам, остеобластам и фибробластам периодонтальной связки. Микроокружение [клетки и межклеточный матрикс], в котором находятся стволовые клетки, принято определять термином «ниша» стволовых клеток. Предполагают, что ниша эпителиальных [для амелобластов] стволовых клеток в резцах грызунов — это пришеечная область зуба [1, 2], а мезенхимальные стволовые клетки, из которых образуются одонтобласты, находятся в периваскулярных областях пульпы [3]. Не исключено, что одним из кандидатов на роль мезенхимальной стволовой клетки пульпы является перицит, поскольку in vitro эти клетки могут дифференцироваться в остеобласты и одонтобласты [3—5]. Несмотря на все имеющиеся предположения и доказательства того, что мезенхимальные стволовые клетки можно выделить из пульпы зуба [6, 7], периодонтальной связки [8, 9] и зубного сосочка — в плодном периоде [10], тканевая ниша этих клеток, а также их морфо-функциональная организация in vivo до сих пор не известны. Среди мезенхимальных стволовых клеток зуба наибольший практический и теоретический интерес представляют стволовые клетки пульпы. В первую очередь потому, что после повреждения зуба именно пульпа вовлечена в процесс репаративного дентиногенеза, когда клетки начинают вырабатывать и откладывать новый дентинный матрикс для восстановления поврежденной области [11]. Неоднократно было показано, что в пульпе имеются клетки, из которых образуются предшественники одонтобластов [4, 12—16]. В то же время, сами кпет-ки-предшественницы [стволовые клетки], до сих пор не идентифицированы, а, следовательно, неизвестен и их фенотип. В отличие от мезенхимальных стволовых клеток костного мозга или жировой ткани одонтобласты не являются клетками истинно мезенхимального происхождения, а формируются из т. н. эктомезенхимы [17], берущей начало из региона нервного гребня. Кроме свойственных нервной ткани маркеров, в частности, нестина [18], дифференцирующиеся одонтобласты экспрессируют цитокератин19 [19] — белок промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток.

Учитывая вышесказанное, нами была выдвинута гипотеза о том, что одонтобласты и их предшественники могут экспрессировать не только цитокератины, но и другие маркеры эпителия, с помощью которых станет возможным определить сами предшественники одон-тобластов и их тканевую нишу. Цель исследования — проверка гипотезы о возможности экспрессии клетками пульпы поверхностных эпителиальных антигенов с одновременным in situ анализом экспрессии антигенов, которые in vitro используют для выявления «стволового компартмента» пульпы зуба.

Материал и методы

В работе была использована пульпа, полученная из 58 зубов человека. Вид зуба и медицинские показания, по которым был удален зуб, представлены в табл. 1.

Зубы фиксировали в 10% забуференном формалине в течение 24 ч. После чего извлекали пульпу. Для этого зуб подвергали равномерной механической нагрузке по всей длине до возникновения трещины. Без избыточного давления щель расширяли стоматологическими инструментами для эндодонтического лечения и извлекали пульпу. Выделенную пульпу помещали в 10% забуференный формалин, фиксировали 12 ч., осуществляли стандартную гистологическую проводку в ряду спиртов возрастающей концентрации и заливали в па- рафин. Парафиновые срезы после депарафинизации обрабатывали антителами, позволяющими выявить in situ отдельные клеточные популяции стрептавидин-биотино-вым методом. В качестве хромогена для выявления пе-роксидазной активности использовали аминоэтилкарба-зол. Все первичные и вторичные антитела были получены из компании Novokastra (Великобритания). Характеристика первичных антител представлена в табл. 2.

Результаты и обсуждение

Проведенный в ходе выполнения работы иммуноги-стохимический анализ пульпы зуба человека позволил получить следующие результаты.

Экспрессия a-гладкомышечного актина

Экспрессия этого белка в пульпе здоровых зубов и пульпе зубов, удаленных по медицинским показаниям, была различной. В пульпе здорового зуба белок экспрессировали в основном гладкомышечные клетки кровеносных сосудов (рис.1А). Совершенно иную картину наблюдали в пульпе после обточки зубов под ортопедические коронки и при хроническом пульпите. При воспалении пульпы после подготовки зуба под ортопедическую конструкцию количество клеток, экспрессирующих а-глад-комышечный актин, которые в основном располагались в субодонтобластическом слое, было значительным и это уже были не единичные, а многочисленные а-глад-комышечный актин-позитивные клетки. В ряде случаев эти клетки располагались в виде многослойного пласта, лежащего на границе между одонтобластами и центральной часть пульпы (рис. 1Б). При хроническом пульпите были обнаружены во всех зонах пульпы, а не только в субодонтобластическом слое. Более того, часть этих клеток располагалась непосредственно среди одонто-бластов (рис. 1В).

Гладкомышечный актин используют в качестве маркера при изучении популяции малодифференцированных клеток, которые образуются из мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (мезенхимальных стволовых клеток) [20], кроме того, он часто присутствует в цитоскелете как стволовых, так и прогениторных клеток [21, 22]. При культивировании клеток коронковой пульпы, выделенной из моляров, было показано, что в культуре образуются узлы или центры минерализации, где происходит отложение фосфатов кальция, а клетки этих узлов экспрессируют —-гладкомышечный актин [23]. Таким образом, именно этот белок часто используется в качестве маркера клеток-предшественниц одонтоблас-тов [24] при изучении стволовых клеток пульпы in vitro.

Данные, полученные в нашем исследовании, подтверждают предположение о том, что предшественники одон-актин. Причем, при отсутствии патологии в пульпе —

плазме гладкомышечных клеток и единичных клетках субодонтобластического слоя. При повреждении же зуба или пульпы количество таких клеток возрастает и расширяется зона их распределения в зависимости от степени выраженности действия повреждающего фактора. Сначала увеличивается количество клеток в субодонтобластическом слое, при более выраженном повреждении появляются клетки в центральных зонах пульпы, а затем и среди одонтобластов. Таким образом, на основании уже известных фактов и наших данных следует заключить, что предшественники одонтобластов могут — обходимо иметь в виду, что в ходе развития зуба на стадиях зубного зачатка и эмалевого органа в клетках эктомезенхимы этот протеин отсутствует [25]. Таким — маркер предшественников одонтобластов и появляется в последних лишь при миграции этих клеток на периферию пульпы, в ходе ответных реакций на повреждение зуба для замещения погибших одонтобластов.

Экспрессия CD 31 и CD 34

Оба антигена были обнаружены в эндотелии кровеносных сосудов пульпы. Отличия в экспрессии этих двух антигенов были лишь в интенсивности окраски клеток эндотелия. При проведении иммуногистохимических реакций во всех случаях наблюдали более интенсивное окрашивание клеток с антителами против CD34. В то же время паттерн распределения эндотелиальных клеток и кровеносных сосудов непосредственно в пульпе был одинаков, то есть отличалась только интенсивность окраски. Во всех здоровых зубах наблюдали несколько крупных сосудов, проходящих из корня в коронку зуба (рис. 2А) и капиллярное сплетение в субодонтобластическом слое. Аналогичные результаты были получены и другими авторами при использовании в качестве маркера эндотелия только CD34 [26]. В тех случаях, когда мы исследовали пульпу, выделенную из зубов на стадии обострения хронического пульпита, наблюдали выраженное увеличение количества капилляров в субодонтобластическом слое (рис. 2Б).

Кроме сосудов, которые имели четко выраженный просвет и находились ближе к центру пульпы, имелись многочисленные клетки, находящиеся в непосредственной близости с одонтобластами. Следует отметить, что слой одонтобластов в этих случаях терял свою морфологическую гомогенность, то есть имела место альтерация одонтобластов и появление рядом с ними вновь образующихся капилляров. В работе A. Graziano с соавт. (2008) была продемонстрирована способность CD34+ клеток, выделенных из пульпы зуба человека, дифференцироваться в преостеобласты, которые начинали синтезировать костный матрикс после трансплантации под кожу иммунодефицитным мышам [27]. Поэтому регистрируемое скопление CD34+ клеток в непосредственной близости от поврежденных одонтобластов, может свидетельствовать о том, что дифференцировка этих клеток возможна не только в преостеобласты, но и в пре-одонтобласты. Подтверждением этого могло быть обнаруженное нами появление CD34+ клеток в непосредственной близости от поврежденных одонтобластов при пульпите. Однако мы использовали два маркера эндотелиальных клеток и идентичность распределения CD31 + и CD34+ клеток позволила нам исключить возможность дифференцировки CD34+ клеток в одонтобласты. Увеличение плотности капиллярной сети и появление эндотелиальных клеток в непосредственной близости с одонтобластами может быть проявлением ангиогенеза (образования новых сосудов за счет ответвления от уже существующих) или васкулогенеза (образование сосудов из предшественников эндотелиальных клеток), как одного из звеньев регенераторного ответа в пульпе. Последний является основным механизмом образования сосудов у эмбриона, но был описан в постоянных зубах человека [28]. Кроме того, было показано, что выделенные из пульпы зуба SP-клетки, экспрессирующие CD34, демонстрируют выраженный васкулогенный потенциал на модели ишемии конечности у мышей [29]. Таким образом, используя два маркера эндотелиальных клеток, один из которых является также маркером кроветворных стволовых клеток, мы не нашли подтверждения в пользу одонтогенного потенциала CD34+ клеток, а увеличение количества этих клеток, как и CD31 + клеток, при повреждении зуба может быть лишь ответной реакцией, направленной на восстановление метаболизма в пульпе.

Экспрессия c-kit рецептор к фактору стволовых клеток, CD

При окрашивании с антителами против c-kit было обнаружено два типа клеток, которые экспрессировали этот антиген. Первая группа — это округлые клетки, расположенные в субодонтобластическом слое (рис. ЗА), а вторая группа — это веретеновидные и отростчатые клетки, которые локализовались в центральных отделах пульпы (рис. ЗБ). Следует отметить, что количество c-kit+ клеток значительно увеличивалось при воспалении пульпы в центральных зонах, и практически все клетки пульпы, прилежащие к слою одонтобластов, начинали экспрессировать рецептор фактора стволовых клеток при пульпите (рис. ЗВ, Г).

C-kit ^рецептор, с которым связывается фактор стволовых клеток (stem cell factor, SCF), их взаимодействие играет важную роль в пролиферации, дифференциров-ке и активации прогениторных клеток в различных биологических системах. Оба — и фактор, и его рецептор — были обнаружены в клетках пульпы, причем есть клетки, которые одновременно экспрессируют и лиганд, и рецептор [30]. При помощи проточной цитометрии и сортинга клеток группа итальянских исследователей под руководством G. Papaccio (2006) выделила из пульпы постоянных и молочных зубов популяцию (c-kit+/CD34+/ CD45~) клеток [31]. Эти клетки при создании определенных условий in vitro дифференцируются в остеобласты, мышечные трубочки, жировые или эндотелиальные клетки [32—37]. Исследователи обнаружили, что регуляция ряда генов ответственных за адгезию, строение цитоскелета и дифференцировку отличаются в остеобластах из кости от остеобластов из клеток пульпы. Поскольку ни в одной из работ не была обнаружена дифференцировка, выделенных клеток в одонтобласты, то, опираясь на данные полученные в нашем исследовании, можно предположить, что итальянские ученые выделяли c-kit+ клетки, которые локализованы в центральных областях пульпы. Более того, нет никаких противоречий с нашими данными по экспрессии клетками пульпы CD34. Если c-kit+/CD34+ клетки, использованные в выше указанных работах, получены из центральных областей, то это клетки истинно мезенхимального происхождения, среди них могут находиться мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (мезенхимальные стволовые клетки), что и было показано итальянскими учеными. Мы, как и группа G. Papaccio, не обнаружили фактов, подтверждающих дифференцировку CD34+ клеток в одонтобласты. В тоже время, мы предполагаем, на основании данных по экспрессии —-гладкомышечного актина и c-kit, что предшественники одонтобластов находятся в субодонтобластическом слое пульпы. Другими словами в пульпе находится как минимум два типа стволовых клеток — мезенхимальных и эктомезенхимальных, которые отличаются не только по происхождению и локализации внутри пульпы, но и по потенциям дальнейшего развития и дифференцировки.

Экспрессия эпителиальных маркеров EMA (epithelial membrane antigen, эпителиальный мембранный антиген) — гликозилированные трансмембранные белки массой 40^425 kDa. В пульпе зуба ЕМА строго экспрессировали только одонтобласты. В здоровых зубах никакие клеточные элементы пульпы, за исключением одонтобластов, не экспрессировали на своей поверхности этот антиген (рис. 4А, Б). У одонтобластов хорошо прокрашивалась клеточная мембрана, но антиген не был обнаружен на мембране отростков клеток. При воспалении пульпы ЕМА выявлялся в клетках субо-донтобластического слоя. Причем не все клетки этого слоя экспрессировали ЕМА, а лишь те, которые находились ближе к периферии пульпы, то есть прилежали к слою одонтобластов (рис. 4В).

ESA (epithelial specific antigen, специфический для эпителия антиген) ^поверхностный гликопротеин (40 kD) экспрессируется на базолатеральных поверхностях эпителиальных клеток. ESA не был обнаружен ни в одном из исследованных зубов (рис. 4Г).

Из двух эпителиальных антигенов, которые широко используются для выявления эпителиоцитов и дифференциальной диагностики опухолей, только ЕМА был обнаружен в пульпе зуба. Этот антиген присутствовал на мембране одонтобластов и их предшественников. Проанализировав научную литературу, мы можем сказать, что мы впервые описали экспрессию эпителиального мембранного антигена в одонтобластах человека. Таким образом, наша гипотеза о том, что одонтобласты, как эктомезенхимные клетки, могут экспрессировать не только цитокератины, но и другие маркеры эпителия, подтвердилась. Более того, это еще одно подтверждение того, что одонтобласты развиваются из нейроэктодермы, потому что ЕМА был обнаружен в клетках паутинной оболочки, эпендимоцитах и глиальных опухолях.

Следовательно, одонтобласты и их предшественники экспрессируют ЭМА. В пульпе зуба присутствует как минимум два типа стволовых клеток — мезенхимальные и эктомезенхимальные. Это обстоятельство необходимо учитывать при культивировании смешанной популяции клеток, полученной из пульпы, а эпителиальный мембранный антиген может быть использован в качестве маркера одонтоцитогенеза при поиске условий направленной дифференцировки стволовых и проге-ниторных клеток пульпы в одонтобласты.

Подняться вверх сайта