Поиск Кабинет

Экспрессия CXCR4 и эффективность мобилизации CD34+ гемопоэтических стволовых клеток

Гены & Клетки: Том II, №3, 2007 год, стр.: 51-56

 

Авторы

Куртова А.В., Эстрина МА, Алексеев С.М., Трофимова СА, Тупицына ОА, Карпов В.Г., Здоров А.Е., Афанасьев Б.В., Зуева Е.Е.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

CXCR4 является хемокиновым рецептором, который играет ключевую роль в регуляции процессов направленной миграции гемопоэтических стволовых клеток [ГСК}. CXCR4 представляет собой непрямую мишень для действия Г-КСФ. Целью данной работы было проведение сравнительного анализа экспрессии CXCR4 на поверхности CD34' ГСК, полученных из продукта афереза мобилизованной периферической крови пациентов с различной эффективностью мобилизации. В качестве групп сопоставления в исследование включены также образцы праймированного костного мозга, нормального костного мозга и пуповинной крови. Было выявлено, что средняя интенсивность флюоресценции CXCR4, отражающая плотность экспрессии данного рецептора, снижается при стимуляции Г-КСФ в направлении: нормальный костный мозг > праймированный костный мозг > продукт афереза от мобилизуемых пациентов и негативно коррелирует с успешностью мобилизации. Уровень экспрессии CXCR4 в группе немобилизуемых пациентов не отличается от нативных источников [костный мозг, пуповинная кровь), что указывает на внутреннюю резистентность к действию Г-КСФ или иную кинетику мобилизации у пациентов с плохим ответом на мобилизацию.

Введение

Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) периферической крови успешно используют для аутогенных трансплантаций у пациентов с различными онкологическими и онкогемато логическими заболеваниями в связи с более быстрым при живлением и менее травматичной процедурой сбора по сравнению с костным мозгом. Физиологические основы поддержания ГСК в костномозговом микроокружении и их мобилизации в периферическую кровь представляют зна чительный клинический интерес. ГСК, полученные в ходе мобилизации, активно используют в современной транс плантологии: среди 30 ООО проводимых ежегодно в мире аутогенных трансплантаций ГСК в 95% случаев использу ют гемопозтические предшественники, полученные в ходе мобилизации и последующего афереза [1], среди 15 ООО аллогенных трансплантаций, проведенных в Европе, 70% ассоциированы с использованием мобилизованной пери ферической крови [2]. Для минимизации риска развития реакции «трансплантат против хозяина» в качестве альтер нативных источников ГСК для трансплантаций рассматрива ют также праймированный костный мозг [3] и пуповинную кровь [4].

Количество трансплантированных ГСК на килограмм массы тела пациента имеет принципиальное значение для ус пешного восстановления гемопоэза: 2x106 CD34+ ГСК/кг считают минимально необходимой дозой для достижения положительного эффекта от трансплантации, хотя доза Несмотря на значительные усилия по оптимизации протоко лов мобилизации, 20 46% пациентов оказываются прак тически резистентными к действию мобилизующих агентов [5], что делает чрезвычайно востребованным более деталь ное исследование процессов мобилизации у пациентов он кологического и онкогематологического профиля.

Взаимодействие хемокинового рецептора CXCR4 с его нативным лигандом stromal cell derived factor 1 (SDF 1) играет принципиальную роль в обеспечении контактов ГСК с костномозговым стромальным микроокружением. Ре зультатом взаимодействия CXCR4 с SDF 1 является модификация таких процессов, как

• транскрипция генов, вовлеченных в регуляцию апоп тоза,

• клеточная адгезия,

Мобилизация ГСК может происходить с различной ин тенсивностью в ответ на определенные стимулы, такие как значительная физическая нагрузка, воспаление, прове дение миелосупрессивной химиотерапии, а также при по вышении концентрации определенных гемопоэтических ростовых факторов, цитокинов, и полианионов [6]. Прак тически все эти стимулы прямо или косвенно затрагивают взаимодействие CXCR4SDF 1 для обеспечения мобили зации ГСК, что указывает на его важную роль в процессах регуляции миграционной активности гемопоэтических пред шественников.

Препараты гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г КСФ) являются наиболее часто используемыми в клинической практике мобилизующими агентами. В целом, Г КСФ индуцированная мобилизация со сроком стимуля ции около 5 дней представляет собой двухэтапный процесс. Первый этап характеризуется активацией клеток грануло цитарного ряда различной степени зрелости и формирова нием в костном мозге протеолитического микроокружения за счет повышения концентрации таких ферментов как зла стаза нейтрофилов, катепсин G, протеиназа 3 и др. Второй сопряжен с разрушением контактов ГСК с компонентами костномозгового микроокружения, в том числе CXCR4 SDF1, и выходом ГСК в периферический кровоток [7]. Аналогич ный эффект имеет место и при праймировании, когда в ходе краткосрочной стимуляции препаратами Г КСФ также про исходит активация клеток гранулоцитарного звена, что опосредованно способствует разрушению контактов ГСК с костномозговым микроокружением.

Целью данной работы было проведение сравнительно го анализа экспрессии CXCR4 на поверхности CD34^ ГСК, полученных из продукта афереза мобилизованной пери ферической крови пациентов с различной эффективностью мобилизации. В качестве групп сопоставления в исследо вание включены образцы праймированного костного мозга, нормального костного мозга и пуповинной крови.

Материал и методы

Образцы аферезного продукта (п = 40) были получены от 20 пациентов при планировании аутогенной трансплан тации (п=23) в результате процедуры лейкафереза на кле точном фракционаторе крови СОВЕ Spectra (version 7.0, Gambro, Sweden) после мобилизации выхода ГСК путем вве дения Г КСФ («Граноцит», Aventis, France, «Нейпоген 48», Roche, Switzerland) из расчета 5 10,5 мкг/кг массы тела пациента в течение 4 17 дней. Все пациенты получали предшествующую химиотерапию. У 11 пациентов были проанализированы образцы от первого и второго дня афе реза. Характеристики пациентов представлены в табл. 1, стратегий мобилизации - в табл. 2.

Образцы праймированного (п = 6) костного мозга были получены от здоровых доноров при планировании аллоген ной трансплантации после проведения праймирования путем введения Г КСФ («Граноцит», Aventis, France, «Нейпоген 48», Roche, Switzerland) из расчета 5 10 мкг/кг массы тела донора в течение 2 5 дней.

Образцы пуповинной крови (п = 12) были получены после нормальных срочных родов до отхождения плаценты.

Образцы нормального (п = 5) костного мозга была полу чены от пациентов негематологического профиля при пла нировании проведения клеточной регенерационной терапии в форме аутогенной трансплантации ГСК.

Подготовка проб всех биологических материалов для выявления CD34^ ГСК и оценки уровня экспрессии CXCR4 (CD184) была проведена без специальных процедур по обогащению гемопоэтическими предшественниками по методике «окрашивание лизис без отмывки».

Клетки [не менее 2 3x106/мл) были инкубированы при +4°С в темноте в течение 30 минут со следующими моно клональными антителами: CD45 FITC, CD14PE, CD34PE, CD184PerCP Су5.5 и соответствующими изотипически ми контролями (все Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Для лизирования эритроцитов после инкубации с антитела ми был использован рабочий раствор EasyLyse (DakoCytomation, Denmark) согласно рекомендациям про изводителя.

Оценка антигенной экспрессии была проведена на про точном цитометре PartecPAS (Partec, Germany), оснащенном одним аргоновым лазером (мощность 15 mW, испускаемая длина волны 488 нм), с использованием программного обеспечения FloMax.

В соответствии с рекомендациями ISHAGE (International Society of Hematotherapy and Graft Engineering) по количе ственному учету CD34^ ГСК было проанализировано не менее 100 ООО событий и не менее 100 клеток с фенотипом CD34^CD45di^SSCl0W [8].

Оценку экспрессии CD184 проводили на целевой попу ляции ГСК путем создания последовательных логических ограничений (гейтов):

• количественно - в виде процентного выражения со держания CD184^ клеток среди всех ГСК;

• качественно - в виде оценки средней интенсивности флюоресценции mean fluorescence intensity (MFI) CD184.

Статистическую обработку данных проводили с исполь зованием программного обеспечения Statistica 6.0. Описа тельная статистика представлена в виде медианы (median), минимального и максимального значения (min max). Для сравнения зависимых вариант (парные наблюдения) был ис пользован непараметрический критерий Уилкоксона. Для сравнения параметров в независимых группах был исполь зован критерий Манна Уитни. Для выявления корреляцион ной зависимости был использован ранговый тест Спирмена. Различия выборок считали статистически достоверными при р<0,05. Результаты

В исследование включены данные по 23 циклам мобили зации для 20 пациентов. Для трех пациентов, не ответивших на первую мобилизацию, была предпринята вторая попытка (ж/РМЖ, м/ОНЛ, м/ОНЛ) стимуляции выхода гемопоэтичес ких предшественников введением Г КСФ. Характеристика клинических данных пациентов представлена в табл. 1.

По схемам мобилизации все циклы были разделены на три варианта: химиотерапия + Г КСФ, циклофосфан + Г КСФ, только Г КСФ. Успех мобилизации был оценен по количе ству CD34^ ГСК/кг массы тела пациента и, в соответствии с классификацией Stiff [9], на основе этих данных были выде лены три группы пациентов:

1. Немобилизуемые пациенты, для которых в ходе пос ледовательных аферезов не удалось получить больше

2. Мобилизуемые пациенты, для которых в ходе пос ледовательных аферезов удалось получить минимально необходимую дозу для одной трансплантации, но не удалось

3. Отлично мобилизуемые пациенты, для которых удаафереза.

В табл. 2 представлены характеристики циклов мобили зации для 20 пациентов, включенных в исследование.

Оценка экспрессии CXCR4 на поверхности ГСК в образцах аферезного продукта была проведена отдельно для каждой группы пациентов. В случае проведения афереза в течение двух дней подряд в качестве конечного показателя интенсивности флюоресценции было использовано среднее арифмети ческое от данных по первому и второму дню афереза. Для сравнения выборок был использован критерий Манна Уитни.

Результаты качественной и количественной оценки экс прессии CXCR4 на поверхности ГСК из различных источни ков представлены в табл. 3.

При сравнении выборок по количественной экспрессии CXCR4 достоверные различия (р<0,03) были получены только между образцами пуповинной крови и аферезного продук та от отлично мобилизуемых пациентов. При сопоставлении данных по средней интенсивности флюоресценции CXCR4 были дополнительно верифицированы значимые различия между группами (см. табл. 3). Было выявлено, что в образцах праймированного костного мозга средняя интенсивность флюоресценции CXCR4 достоверно отличается от таковой в образцах нормального костного мозга и пуповинной крови (р<0,019 и р<0,024 соответственно).

На рис. 1 представлено соотношение медиан MFICXCR4 на поверхности ГСК в исследуемых группах.

На рис. 3. представлены дот плоты, отражающие резуль таты количественного и качественного анализа экспрессии CXCR4 на поверхности ГСК из различных источников. По гические ограничения для идентификации гемопоэтических предшественников созданы согласно протоколу количе ственного учета ГСК ISHAGE.

Медиана количества CD34^ ГСК/ мкл конечного сум марного аферезного продукта составила 94,5 (8,4 1894,7). Значимая отрицательная корреляция была выявлена меж ду интенсивностью флюоресценции CXCR4 и количеством CD34^TCK/ мкл аферезного продукта (г = 0,647, р<0,003). Графическая иллюстрация представлена на рис. 2.

Зависимость эффективности мобилизации от режима мобилизации не была выявлена, что, возможно, связано с незначительным объемом выборки.

Обсуждение и выводы

В соответствии с биологическими основами процесса мобилизации, изменение концентрации CD34^ ГСК в пери ферической крови при стимуляции Г КСФ является след ствием динамических процессов, основным среди которых является миграция ГСК из костного мозга за счет изменения взаимоотношений ГСК со стромой. Направленная миграция ГСК осуществляется и в физиологических условиях в ходе эмбрионального и постнатального поддержания гемопоэза. Взаимодействие CXCR4 SDF 1 играет одну из ключевых ролей в процессах направленной миграции ГСК и чрезвы чайно важно как для мобилизации, так и для хоминга гемо поэтических предшественников.

В данной работе была исследована экспрессия CXCR4 на поверхности ГСК из различных биологических источников:

• пуповинной крови - для определения уровня экспрессии CXCR4 при естественной неиндуцированной миграции ГСК;

• тивного уровня экспрессии CXCR4; ранних этапов изменения экспрессии CXCR4 при Г КСФ индуцированной мобилизации;

• нения экспрессии CXCR4 при Г КСФ индуцированной моби лизации у пациентов с различным ответом на стимуляцию.

Пуповинная кровь характеризуется присутствием зна чительного количества циркулирующих гемопоэтических предшественников, однако, природа мобилизующего стиму ла до сих пор не выяснена. Учитывая биологические основы мобилизации ГСК во взрослом организме, можно предполо жить, что данное явление связано с усиленной продукцией Г КСФ, SDF 1 или комплексной нейроэндокринной регуля цией поздних этапов эмбрионального гемопоэза. В данном исследовании было показано, что ГСК пуповинной крови демонстрируют вариабельный, но, высокий уровень эксп рессии CXCR4, что позволяет предположить ведущую роль градиента SDF 1 в процессах направленной миграции не зрелых предшественников. В пользу данной гипотезы свидетельствует быстрое время элиминации ГСК из цирку лирующего кровотока после рождения, а также низкая кон центрация Г КСФ в пуповинной крови [10]. Высокий уровень MFI CXCR4 отражает значительную плотность экспрессии данного рецептора на поверхности ГСК, что может быть рас ценено как необходимая адаптация CD34^ гемопоэтических предшественников к направленной миграции в соответствии с градиентом SDF, который не ограничен костным мозгом. Полученные данные дополнительно указывают на значи тельную привлекательность развития практики внутрикостной трансплантации образцов пуповинной крови для минимиза ции экстрамедуллярных потерь ГСК.

Стабильно высокая экспрессия CXCR4 на поверхности ГСК нестимулированного костного мозга полностью соот ветствует данным литературы о необходимости взаимодей ствия CXCR4 SDF1 для заякоривания ГСК в костномозговом микроокружении и для поддержания нормального гемопоэ за [11 ]. В отличие от ГСК пуповинной крови, высокий уровень экспрессии CXCR4 на поверхности ГСК в костном мозге не может быть расценен как потенциал к направленной миг рации. Наоборот, он свидетельствует о высокой степени интеграции ГСК в строму костного мозга.

Праймирование в определенной степени отражает пер вые этапы мобилизации ГСК в периферическую кровь. Во всех исследованных образцах праймированного костного мозга была выявлена гомогенно невысокая экспрессия CXCR4. Выявленные достоверные различия по MFI CXCR4 образцов праймированного костного мозга по сравнению с образцами нормального костного мозга и аферезного продукта от отлично мобилизуемых пациентов подтверж дают промежуточный мобилизационный статус ГСК при праймировании.

Учитывая, что первый этап мобилизации в большей степени сопряжен с началом активации гранулоцитарного звена и продукцией SDF, праймированные ГСК демонстри руют относительно невысокий уровень экспрессии CXCR4. В костном мозге физиологически присутствуют зрелые нейт рофилы и коммитированные миелоидные предшественники, которые достаточно быстро реагируют на стимуляцию Г КСФ и создаваемое при этом протеолитическое микроокруже ние достаточно для начальных этапов деградации адгези онных взаимодействий ГСК со стромой, что выражается в снижении интенсивности флюоресценции CXCR4. Тем не менее, этого количества активированных клеток гранулоци тарного ряда не вполне достаточно для стимуляции массив ной эмиграции ГСК. Экспрессия CXCR4 на поверхности ГСК в костном мозге при стимуляции Г КСФ не коррелируют с экспрессией CXCR4 на поверхности мобилизованных ГСК, что дополнительно подчеркивает разницу между двумя дан ными компартментами [12].

В образцах аферезного продукта от мобилизуемых и отлично мобилизуемых пациентов было выявлено значитель ное снижение уровня экспрессии CXCR4 на поверхности мобилизованных ГСК в ответ на стимуляцию Г КСФ. Нега тивная корреляция эффективности мобилизации с экспрес сией CXCR4 на поверхности ГСК подтверждает тесную связь снижения уровня экспрессии данного рецептора в ответ на стимуляцию Г КСФ и/или химиотерапевтическими агентами с увеличением миграционного потенциала ГСК и усилением их эмиграции из костного мозга. Полученные результаты полностью согласуются с результатами исследования D. Dlubek et al„ в котором были проанализированы данные по MFI CXCR4 на поверхности мобилизованных ГСК от 90 здоровых доноров. Было выявлено, что для мобилизованных ГСК характерен стабильно низкий уровень экспрессии CXCR4 [13]. Снижение уровня экспрессии CXCR4 свиде тельствует о потенциальной восприимчивости ГСК к дей ствию Г КСФ у мобилизуемых пациентов. Различия в эф фективности мобилизации между группами мобилизуемых и отлично мобилизуемых пациентов, возможно, связаны оп ределенными факторами, влияющими на эффективность мобилизации, в том числе, с первичным диагнозом, количе ством и составом предшествующих курсов химиотерапии, а также сроками и режимами введения Г КСФ [14].

Среди 23 циклов мобилизации, проанализированных в данном исследовании, в девяти случаях [7 первичных цик лов мобилизации и 2 ремобилизации) пациенты не ответи ли на стимуляцию Г КСФ и были классифицированы как немобилизуемые. Восемь из девяти немобилизуемых паци ентов получили более пяти циклов полихимиотерапии. В двух случаях пациенты [ж/52/РМЖ/рецидив III, м/24/ОНЛ/ рецидив I) не ответили ни на первый, ни на второй цикл мо билизации ГСК. Во всех случаях пациенты получали Г КСФ не менее 5 дней в дозе не менее 10 мкг/кг/день, однако на поверхности мобилизованных ГСК в аферезном продук те был выявлен чрезвычайно высокий уровень экспрессии CXCR4, что может свидетельствовать о внутренней резис тентности к действию Г КСФ одновременно с истощенностью пула ГСК. М. Dabusti et al. связывают отсутствие ответа на стимуляцию именно со снижением пула доступных для мо билизации ГСК вследствие значительного повреждения стромы костного мозга химиотерапевтическими агентами [15]. Также необходимо учитывать, что кинетика мобилиза ции у предлеченных пациентов может значительно отличаться от таковой у здоровых доноров, а пик мобилизации пациен тов может быть отсрочен [16]. Сохранение высокого уровня экспрессии CXCR4 при отсутствии адекватного ответа на мобилизацию делает безусловно привлекательным подход по усилению целевого воздействия на контакт CXCR4 SDF 1, которое возможно при совместном назначении Г КСФ с селективным антагонистом SDF 1 - AMD3100 (Mozobil™), для повышения эффективности мобилизации.

В данном исследовании мы выявили достоверные разли чия по плотности экспрессии CXCR4 на поверхности ГСК, по лученных из нативных источников (нормальный костный мозг, пуповинная кровь) и после стимуляции Г КСФ (за исключени ем группы немобилизуемых пациентов). Последовательное снижение плотности экспрессии CXCR4 (нормальный кост ный мозг > праймированный костный мозг > продукт афе реза от мобилизуемых пациентов) под воздействием Г КСФ свидетельствует о комплексном, зависимом от времени воз действии данного ростового фактора на адгезионный про филь ГСК. Отсутствие снижения уровня экспрессии CXCR4 на поверхности ГСК у немобилизуемых пациентов указы вает на дисбаланс регуляции процессов направленной миграции у предлеченных пациентов и требует оптимиза ции режимов мобилизации с включением селективных агентов.

Подняться вверх сайта