Поиск Кабинет

Экспериментальное лечение аллогенными мультипотентными мезенхимными стромальными клетками эмфиземы легких у крыс

Гены & Клетки: Том VI, №4, 2011 год, стр.: 48-53

 

Авторы

Аверьянов А.В., Конопляников А.Г., Черняев А.Л., Петров В.Н., Коноплянникова О.А., Агаева Е.В., Цыб А.Ф., Кузовлев О.П., Брюховецкий А.С., Кулагина Н.С., Трусов А.Е.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Цель исследования: оценить морфологические и морфометрические изменения ткани легких и активность перитонеальных макрофагов после трансплантации аллогенных мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) в острой эластазной модели эмфиземы легких (ЭЛ) у крыс.

Материал и методы: 40 крыс линии Wistar в возрасте 3-х мес. были рандомизированно разделены на 4 равные группы. Животным 1 группы интратрахеально вводилось 0,4 мл 0,9% NaCl, остальные (2–4 группа) получили эндотрахеально 20 Ед свиной панкреатической эластазы в 0,4 мл 0,9% NaCl. На следующий день (3 группа) и на 7-й день эксперимента (4 группа) крысы получили однократную в/в инъекцию культуры ММСК в количестве 2×106 клеток, суспендированных в 0,5 мл физиологического раствора. Крысы 2-й группы использовались в качестве контроля эмфиземы. Перед выведением из эксперимента на 21-й день крысы подвергались перитонеальному лаважу с анализом хемилюминесцентной активности перитонеальных макрофагов (ПМ) в лаважной жидкости.

Результаты. У животных 2–4 групп выявлено развитие ЭЛ разной степени выраженности. Ширина альвеолярных ходов в группе 2 увеличилась на 231% по отношению к контролю. При введении ММСК через сутки после эластазы ширина альвеолярных ходов уменьшалась в среднем на 50,3% по сравнению с контролем. У животных, которым ММСК вводили на 7-е сут. экперимента, этот показатель снижался более значительно – на 64,5%, но был выше на 40,7% по сравнению с первой контрольной группой. Другой количественный показатель выраженности ЭЛ – альвеолярный индекс (АИ) – достоверно возрастал на 149% в группе 2. При введении ММСК на 1-е и 7-е сутки эксперимента АИ уменьшался на 163,4 и 237% соответственно. Индекс пиковой хемилюминисцентной активности ПМ (Мв/106 клеток) составил 28,8+1,1 (1 группа), 57,3+1,3 (2 группа), 35,8+1,6 (3 группа), 31,9+1,9 (4 группа).

Выводы. Исследование подтвердило возможность восстановления ткани легких после системной (в/в) трансплантации ММСК в острой модели ЭЛ у крыс.

Эмфизема легких (ЭЛ) – один из наиболее частых клинико-морфологических синдромов в патологии органов дыхания. По данным мета-анализа R.J. Halbert с соавт. (2006) ЭЛ встречается у взрослого населения с частотой 0,5–5,7% [1]. Большой проблемой является не только высокая заболеваемость ЭЛ, обусловленная, прежде всего, распространенностью табакокурения, но и фактическое отсутствие медицинских инструментов влияния на прогрессирование процесса. Согласно общепринятому определению, ЭЛ – необратимое увеличение воздушного пространства дистальнее терминальных бронхиол, сопровождающееся деструкцией стенок ацинуса, без сопутствующего их фиброза [2]. Однако это устоявшееся представление о необратимости эмфизематозных изменений ткани легких было подвергнуто сомнению после ряда экспериментов, доказывающих возможность восстановления поврежденных структур экстрацеллюлярного матрикса легочной паренхимы под влиянием ретиноевой кислоты [3, 4]. Было также показано, что в сохранившихся элементах ткани легких идет активный синтез эластина и коллагена [5]. В нашем исследовании у больных, оперированных по поводу тяжелой эмфиземы, обнаружена гиперэкспрессия сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) в паренхиме легких, что свидетельствовало в пользу активного ангиогенеза [6]. Одна из гипотез патогенеза ЭЛ предполагает, что в его основе лежит нарушение баланса повреждения-регенерации альвеолярных структур.

Естественный интерес к проблеме регенерации в легких вызывают активно развивающиеся клеточные технологии. Тем не менее, до последнего времени опубликованы результаты единичных исследований, оценивающих возможные эффекты различных видов стволовых/прогениторных клеток на патологический процесс в экспериментальных моделях ЭЛ. В 2008 г. G. Zhen с соавт. показали, что введение мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) крысам с папаин-индуцированной эмфиземой приводит к миграции их в легкие с последующей дифференцировкой в альвеолоциты II типа, ингибирует процессы апоптоза и предотвращает развитие ЭЛ [7]. K. Schweitzer с соавт. (2011) доказали снижение активности воспаления в дыхательных путях и уменьшение числа погибших альвеолоцитов и эндотелиоцитов после трансплантации ММСК жировой ткани мышам с эмфиземой, вызванной хронической экспозицией табачного дыма или блокадой рецепторов VEGF [8].

Однако H. Kubo (2010) не подтверждает регенеративный эффект экзогенных ММСК костного мозга в экспериментальной модели ЭЛ у мышей [9]. Таким образом, результаты известных исследований эффектов ММСК на разных животных моделях ЭЛ недостаточны и противоречивы, а их зависимость от сроков трансплантации ранее не изучалась. Имея предшествующий опыт экспериментов с ММСК в животных моделях при патологии кишечника, сердца, печени, выполненных в Медицинском радиологическом научном центре Минздравсоцразвития России [10], мы воспроизвели острую модель эмфиземы легких у крыс с последующей трансплантацией ММСК и морфологическим анализом полученного материала.

Цель исследования заключалась в оценке эффектов трансплантации аллогенных ММСК в разные сроки на ткань легких у крыс с эмфиземой, индуцированной интратрахеальным введением панкреатической эластазы.

Исследование проводилось в соответствии с Приложением №8. (Правила гуманного обращения с лабораторными животными) к Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) от 6 апреля 1973 г. № 1045-73.

Материал и методы

40 крыс самок линии Wistar в возрасте 3-х месяцев, массой 180–200 г, были рандомизированы в 2 группы: животным 1 группы (10 крыс) интратрахеально вводили 0,4 мл 0,9% раствора NaCl; остальные животные (30 крыс) получили эндотрахеально 20 ЕД свиной панкреатической эластазы (Sigma, США ) в 0,4 мл 0,9% NaCl. После инстилляции крыс поворачивали в разные стороны в течение 1 мин для равномерного распределения жидкости в дыхательных путях. Для обездвиживания животных во время интратрахеальных инъекций предварительно внутрибрюшинно вводился раствор нембутала в дозе 40 мг/кг массы тела.

Крысы с моделированной эмфиземой случайным образом были распределены на 3 группы по 10 животных в каждой. Одна группа (группа 2) использована в качестве контроля эмфиземы. Другой группе (группа 3) через 1 сут. после инстилляции эластазы в хвостовую вену вводили по 2×106 суспензии аллогенных ММСК, содержащихся в 0,5 мл физиологического раствора. Животные 4 группы получили ту же дозу ММСК через 7 сут. после введения эластазы.

Культура ММСК (пассаж 5) была выращена из костного мозга крыс линии Вистар, самок по модифицированной методике [10]. У крыс-доноров клетки костного мозга для посева в культуру получали из бедренной кости после введения им для эвтаназии раствора нембутала (70 мг/кг). Полученные в строго стерильных условиях примерно 107 костномозговых клеток помещали в пробирки с гепарином (100 ЕД/мл пунктата). После отстаивания эритроцитов в течение 1–2 ч при комнатой температуре супернатант удаляли пастеровской пипеткой, выделенные клетки отмывали в среде 199 (Sigma, США), центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин, осадок ресуспендировали в ростовой среде. В качестве ростовой среды служила среда RPMI-1640 (Sigma, США), содержащая пенициллин (100 ЕД/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 мМ, 20% эмбриональной телячей сыворотки. Культивирование проводилось в пластиковых флаконах Карреля (Sigma, США) c площадью дна 25 см2, в которые вносили 5×106–107 клеток костного мозга в 8 мл ростовой среды. Флаконы продували газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха, и помещали их в обычный термостат при 37оС. Продувание флаконов такой газовой смесью проводили каждый раз, когда меняли среду или пересевали клетки в новые культуральные флаконы. При достижении сливного (конфлюентного) монослоя клетки пересевали с использованием 0,25% раствора трипсина (Sigma, США) в новые флаконы вначале с той же площадью дна (25 см2), а впоследствии при нарастании клеточной массы – в большие культуральные флаконы с площадью дна 175 см2. Такой метод позволял к концу 5–6 нед. добиться получения культуры ММСК в количестве (1–2)×108 клеток, достаточном для трансплантации в организм крыс-реципиентов. При изучении методом проточной цитофлюорометрии специфических маркеров полученных культур ММСК было показано, что они относятся к популяции CD10low/CD34-/СD45-/CD90+/CD105+ клеток, что соответствует дифференциальным критериям ММСК. Это заключение было подтверждено способностью полученной культуры клеток при изменении условий культивирования и использовании соответствующих индукторов к дифференцировке в четырех исследованным в нашей работе направлениях – в остеоциты, хондроциты, адипоциты и кардиомиоциты (в последнем случае при применении деметилирующего агента – 5-азацитидина). Крыс выводили из эксперимента на 21-й день внутрибрюшинным введением нембутала в дозе 70 мг/кг веса. При достижении наркотизации проводили перитонеальный лаваж путем промывания брюшной полости 5 мл забуференного физиологического раствора (ЗФР, рН 7,4). Модифицирующие эффекты ММСК на уровень зимозан-индуцируемой продукции активных форм кислорода (АФК) перитонеальными макрофагами (ПМ) оценивали в тесте люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ) [11] Пул ПМ выделяли на градиенте Histopaque 1077/1119 (Sigma, США). Для определения продукции АФК в кюветы люминометра «LKB-Wallac 1251» вносили по 106 выделенных ПМ в 600 мкл ЗФР, содержащей 10-4 М люминола (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, Serva). Затем в термостатируемую при 37о С кювету в кюветодержателе люминометра автоматически по специальной программе «LKB-Wallac 1254-124 Phagocytosys Program» добавляли суспензию опсонизированного зимозана («Serva» до конечной концентрации 1,25 мг/мл). Регистрация зимозаниндуцированной ХЛ-активности в миллиВольтах/106 клеток продолжалась в течение 30 мин через каждые 2–3 мин. Данные представляли как средние величины показаний пика ХЛ-активности макрофагов от 12 параллельных измерений.

После получения материала для определения ХЛ активности макрофагов для фиксации легких интратрахеально через катетер вводили фиксатор Буэна под давлением 12 см водного столба до полного расправления легких, заполнявших всю плевральную полость. После этого перевязывали трахею, извлекали комплекс легкие-сердце из плевральной полости и помещали его в жидкость Буэна, в 5-кратном размере превышающую объем легких, на трое суток. Затем из каждого легкого вырезали пластины толщиной 0,4 см перпендикулярно к воротам легкого через все отделы легкого. Полученные срезы обезвоживали в восходящих по крепости спиртах, заливали в парафин и приготавливали срезы толщиной 0,4–0,5 мкм по общепринятой методике. Полученные срезы окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону. С помощью объект-микрометра проводили измерение ширины альвеолярных ходов между замыкательными пластинками входа в альвеолы, ширину и глубину альвеол, открывающихся в альвеолярные ходы. Все измерения проводили строго перпендикулярно к продольной оси альвеолярных ходов. Вычисляли также соотношение ширины к глубине альвеол (альвеолярный индекс), характеризующий степень выраженности ЭЛ [12].

Статистическая обработка результатов проводилась при помощи пакета прикладных программ Statistica for Windows StatSoft Inc. Версия 6.0. Данные таблиц представлены как выборочное среднее ± стандартное отклонение. Достоверность различий оцениваемых показателей между исследуемыми группами вычислялась методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Различия считались статистически достоверными при p < 0,05.

Результаты

В течение эксперимента в группах 2–4 погибли 11 животных: в группе 2 осталось 5; в группе 3 – 8, группе 4 – 6 крыс. Большинство лабораторных животных погибло в первые двое суток после инстилляции эластазы. Причиной смерти во всех случаях было острое повреждение легких. В расчеты настоящего исследования включены выжившие крысы. Основные результаты морфометрического анализа альвеолярной ткани в разных группах животных представлены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, ширина альвеолярных ходов в группе 2 экспериментальной эмфиземы увеличивалась в среднем на 231% по отношению контрольной группе (рис. А, Б), что свидетельствовало об успешном моделировании ЭЛ. При введении ММСК на первые сутки после панкреатической эластазы ширина альвеолярных ходов уменьшалась в среднем на 50,3% (до 66,5 мкм) по сравнению с контрольной группой экспериментальной эмфиземы (рис. В). У животных, которым ММСК вводили на 7 сутки развития эмфиземы, этот показатель снижался в большей степени – на 64,5%, но был выше на 40,7% в сравнении со здоровыми животными группы 1 (рис. Г). Другой количественный показатель выраженности ЭЛ – альвеолярный индекс (АИ) – достоверно возрастал на 149% в группе 2 по отношению к контролю. При введении ММСК на 1-е и 7-е сут. после эластазы АИ достоверно уменьшался на 63,3% и на 236% соответственно по отношению к значению данного показателя в группе контрольной ЭЛ.

Исследуя показатели хемилюминесцентной активности ПМ мы получили данные, в целом, отражающие морфологические изменения в экспериментальных группах (табл. 2). Высший пик ХЛактивности ПМ пришелся на животных группы 2 (57,3±1,3 мВ/106 клеток), что практически в 2 раза выше, чем в группе здорового контроля. В группах лечения ММСК показатель ХЛ-активности ПМ снижался в среднем на 60% (группа 3) и 79,6% (группа 4), но не достигал уровня крыс без эмфиземы.

Обсуждение

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о положительных морфологических и иммунологических эффектах трансплантации ММСК в острой эластазной модели ЭЛ. По-видимому, ММСК оказали сдерживающее влияние на развитие ЭЛ после эластазного повреждения. Несмотря на то, что видимые морфологические изменения находят обычно к концу 2-й нед. после введения эластазы в нижние дыхательные пути, биохимические процессы деградации экстрацеллюлярного матрикса паренхимы легких наблюдаются уже в первые часы после эндотрахеальных инъекций эластазы [13]. Гибель альвеолоцитов и эндотелиоцитов, снижение содержания эластина, коллагена и ламинина в альвеолярных стенках имеет место с первого дня эластазного повреждения [13, 14].

В нашем исследовании более выраженный регенеративный эффект наблюдался в группе, получившей ММСК на 7-й день эксперимента (группа 4). Такой факт требует объяснения, поскольку, как правило, раннее вмешательство приводит к лучшим результатам. Возможно, полученные нами данные связаны с тем, что в ближайший от повреждения легких период часть ММСК «отвлекались» на нейтрализацию острого воспалительного ответа, развивающегося на введение эластазы. Известно, что острое повреждение и отек легких, вызванные бактериальными липополисахаридами, блокируются внутривенной инъекцией ММСК [15]. В нашей работе причиной гибели животных было острое эластазное повреждение легких, а большая выживаемость наблюдалась в 3 группе, что свидетельствует об участии трансплантированных в ранние сроки ММСК в преодолении этого критического состояния. Доказательством противовоспалительной активности ММСК могут являться результаты оценки индуцированной хемилюминесценции ПМ. Массированный выброс активных кислородных радикалов (синглетный кислород, перекись водорода, гипохлорит, супероксидный анион, гидроксильный и гидроперекисный радикалы, оксид азота и т.д.) в результате «метаболического взрыва» является одним из основных и начальных звеньев цитостатической и цитотоксической активации монои полиморфонуклеарных фагоцитов, естественных киллеров в отношении микробных, опухолевых и переживающих клеток [16, 17]. В настоящее время благодаря появлению хемилюминесцентных зондов (люминол и люцигенин) стало возможным количественное измерение активных радикалов кислорода в биологических жидкостях и культуральных средах с помощью хемилюминесцентного метода, который до сегодняшнего дня остается наиболее специфическим и высокочувствительным тестом оценки функциональной активности фагоцитов [18]. Используя ХЛ-тест, мы увидели, что, с одной стороны, введение эластазы и развитие эмфиземы усиливают способность эффекторных клеток генерировать АФК, что свидетельствует о системном воспалительном ответе. С другой стороны, в группах, получивших клеточную терапию, пик ХЛ-активности ПМ достоверно уменьшался, приближаясь к уровню здоровых контрольных крыс.

Поскольку известно, что острая гипоксия и окислительный стресс, всегда имеющие место при остром повреждении легких, являются индукторами апоптоза ММСК [19, 20], мы предполагаем, что, подвергаясь ускоренному апоптозу после выполнения противовоспалительной роли, меньшее количество ММСК участвовало в последующем процессе восстановления клеточных и каркасных структур, что объясняет больший регенеративный эффект в группе, получившей ММСК не на следующий, а на 7-й день после эластазной травмы.

Механизмы восстановления паренхимы легких в результате введения ММСК до настоящего времени окончательно не установлены. Хотя несколько исследований доказали миграцию в легкие и превращение экзогенных ММСК в альвеолярный эпителий и эндотелий [21–23], более поздние работы установили, что трансформация в альвеолоциты происходит не более чем у 1% от введенного пула клеток [24, 25]. Однако эти данные были получены не на модели эмфиземы, а при муковисцидозе и блеомициновом фиброзе. Вероятно, больший вклад в регенерацию ткани легких при эмфиземе вносят паракринные эффекты клеточной терапии. G. Zhen с соавт (2010). продемонстрировали положительное влияние ММСК на тканевую экспрессию VEGF и подавление апоптоза эпителия у крыс с эмфиземой, вызванной инстилляцией папаина в дыхательные пути.[26]. В исследовании E.P. Ingenito с соавт. (2011) на модели ЭЛ у овец показана продукция ММСК интегринов, компонентов экстрацеллюлярного матрикса (коллагена IV, ламинина и фибриллина), рецепторов фактора роста тромбоцитов и трансформирующего фактора роста β2 [27]. В той же работе установлено, что часть ММСК встраивается в альвеолярные стенки и перибронхиальный интерстиций при эндобронхиальном введении, а часть подвергается апоптозу с захватом макрофагами и дендритическими клетками.

Вероятны также активирующие эффекты экзогенных ММСК на резидентные стволовые/прогениторные клетки легких. Как и в других органах, в легких имеется собственный камбиальный резерв, включающий клетки протоков подслизистых желез трахеи, базальные клетки межхрящевых зон нижней части трахеи, клетки Клара бронхиол и альвеолярных ходов и альвеолоциты II типа [28]. Одним из путей активации резидентных камбиальных клеток легких может быть экспрессия экзогенными стволовыми/прогениторными клетками ростовых факторов, в частности фактора роста кератиноцитов [29]. Повидимому, суммация разных эффектов трансплантированных ММСК как основного компонента физиологической и репаративной регенерации различных тканей и органов взрослого организма [30] определяет как торможение развития ЭЛ, так и восстановление поврежденных структур ткани легких в острой эластазной модели.

Заключение

Наше исследование подтвердило принципиальную возможность сдерживающего, регенеративного и системного противовоспалительного эффекта при внутривенном введении аллогенных ММСК в экспериментальной модели эмфиземы легких у крыс. Учитывая низкую иммуногенность ММСК, можно ожидать подобный эффект и при введении ксеногенных ММСК, что наблюдалось в экспериментальных моделях других заболеваний [31]. Отдавая отчет в различии механизмов развития эмфиземы легких у животных при остром эластазном повреждении воздухоносных путей и у человека под влиянием хронической экспозиции табачного дыма, мы полагаем, что у больных с прогрессирующей эмфиземой, в основе которой лежит хроническое воспаление нижних дыхательных путей, трансплантация ММСК может быть эффективным методом лечения. Следующим шагом должно стать проведение клинических исследований для оценки эффективности и безопасности данной технологии. При этом успехом можно считать не только обратное развитие патологического процесса, но даже замедление прогрессирования заболевания, которое на сегодняшний день невозможно ни консервативными, ни хирургическими методами.

Подняться вверх сайта