Поиск Кабинет

Экспериментальное и морфологическое исследование биологических мембран ксеногенного происхождения.

Гены & Клетки: Том IX, №4, 2014 год, стр.: 103-109

 

Авторы

Рябов А.Ю., Фадеева И.С., Деев Р.В., Вежнина Н.О., Юрасова Ю.Б., Фесенко Н.И., Гурьев В.В., Склянчук Е.Д., Лекишвили М.В., Акатов В.С.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В последнее десятилетие в челюстно-лицевой хирургии все более ак-тивно используются различные барьерные мембраны. Основными показателями их надежности являются время резорбции, отсутствие токсического/антигенного эффекта, отсутствие отрицательного влияния мембраны на структуру пограничных мягких тканей, а также высокая степень биоинтеграции и возможность их надежной стабилизации в ране. В свете вышесказанного биологические тканеинженерные барьерные мембраны являются материалом выбора в современной восстановительной челюстнолицевой хирургии.

В настоящей работе проведена экспериментально-морфологическая оценка биологических ксеногенных барьерных мембран для определения степени их иммуногенности и времени биодеградации в модельной тест-системе in vivo. Протестированы три группы барьерных мембран – М-Д (децеллюляризованная диафрагма), М-П (перикард), М-ТМО (твердая мозговая оболочка), изготовленных из соответствующих тканей половозрелого быка по методике, разработанной в ЦИТО им. Н.Н. Приорова.

Экспериментальная оценка проводилась на модели 6-недельной гетеротопической подкожной имплантации крысам с помощью комплексного гистологического и иммуногистохимического анализа, а также с помощью количественного определения степени минерализации биоимплантов методом адсорбционной спектроскопии.

Обнаружено, что наиболее быстро и полно (при сохранении протек-тивных свойств) подвергается резорбции материал М-ТМО; относительно долгим сроком биодеградации, выраженным кондуктивным эффектом и ограничительной функцией обладает материал М-П; более быстрым сроком резорбции, быстрым истончением и относительной биоинертностью обладает материал М-Д. Проведенные исследования показывают, что все имплантируемые материалы биосовместимы, эффективны и могут использоваться в различных клинических случаях.

Введение

В последнее десятилетие в челюстно-лицевой хирургии все более активно используются различные барьерные резорбируемые мембраны биологического и синтетического происхождения [1, 2]. Необходимо отметить, что при операциях по направленной регенерации костной ткани в различных клинических ситуациях использование данных материалов является определяющим [2, 3]. Важными факторами, опосредующими выбор ограничительных мембран, являются два независимых аспекта: стоимость изделия и, соответственно, цена конкретного оперативного вмешательства с его использованием и, конечно, надежность, то есть возможность получить предсказуемый успешный результат лечения [1–5]. В свою очередь, основными показателями, влияющими на надежность таких материалов, являются:

– время биорезорбции мембраны, т.е. срок, в течение которого она сможет выполнять барьерную функцию (предотвращение врастания мягких тканей в зону остеогенеза);

– отсутствие негативного влияния на окружающие ткани, в частности, на структуру слизисто-надкостничного лоскута;

– адаптация мембраны в тканях и возможность ее надежной фиксации в зоне имплантации [3–6].

Дополнительными факторами, определяющими выбор барьерной мембраны оперирующим хирургом, могут являться доступность (синтетические мембраны стоят очень дорого), а также простота применения [1, 2, 5].

В связи с вышесказанным, цель данной работы – экспериментально-морфологическая оценка биологических барьерных мембран из тканей быка (диафрагма, перикард, твердая мозговая оболочка), изготовленных по оригинальной методике ЦИТО им. Н.Н. Приорова [7], для определения степени их иммуногенности и времени биодеградации (окончание барьерной функции) в организме реципиента. Выбор указанных материалов обусловлен основными требованиями к тканеинженерным биосовместимым материалам, такими как доступность, простота применения (возможность придать любую форму и размер), отсутствие иммуногенности (обеспечивается проведением децеллюляризации), биорезорбируемость и высокий потенциал интеграции с тканями реципиентного ложа (биологический бесклеточный донорский материал с высокой степенью гомологии внеклеточного матрикса) [2–5, 8, 9].

Материал и методы

В эксперименте протестированы барьерные мембраны из диафрагмы (М-Д), перикарда (М-П), твердой мозговой оболочки (М-ТМО) бычьего происхождения, изготовленные по методике, разработанной в ЦИТО им. Н.Н. Приорова (механическая и химическая обработка с целью удаления клеток донора и элементов крови, лиофилизация из замороженного состояния, радиационная стерилизация) [7, 8].

Для исследования биосовместимости и степени кальцификации биоматериалов использовали стандартную модельную тест-систему гетеротопической подкожной имплантации крысам (самцы линии Wistar массой 180–200 г, стандартные условия содержания) экспериментальных образцов мембран [2, 10]. Все манипуляции с животными выполняли в соответствии с международными правилами гуманного обращения, в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 10993-2-2009. Все операции выполняли под золетил/ксилазиновым наркозом (6/12 мг на 1 кг веса).

По 2 варианта каждого из образцов М-Д, М-П и М-ТМО имплантировали крысам (n = 6) вдоль спины через разрез кожи в нижней ее части. Анализ экспериментальных образцов выполнялся для исходных вариантов (до имплантации, 0 сут.), а также через 30, 45 и 70 сут. после имплантации. Сроки промежуточной и финальной эксплантации образцов были выбраны, исходя из минимального времени резорбции материалов на основе донорских матриц[6, 10].

После эксплантации материал подвергался комплексному макро- и микроскопическому (гистологическому) анализу. При макроскопическом анализе оценивались общий характер изменений: степень истончения образца (не менее 10 измерений для группы), характер минерализации, сохранение барьерных свойств, интенсивность резорбции и т.д. При гистологическом анализе определялись: средняя толщина образца (не менее 10 измерений для не менее 7 образцов – показатель значим при исходной одинаковой толщине образцов), общий характер прорастания реактивно измененной волокнистой соединительной тканью, степень васкуляризации и тип новообразованных сосудов, интенсивность клеточной инфильтрации и т.д. Для гистологического анализа срезы, изготовленные по стандартной методике, окрашивали гематоксилином и эозином; выполняли иммуногистохимические реакции с антителами (DakO, Дания) к α-гладкомышечному актину (α-SMA) – выявление миофибробластов, периваскулярных клеток; CD68 – оценка количества макрофагов, CD4 – выявление CD4+-клеток, Т-лимфоцитов. Иммуногистохимический анализ носил качественный характер: реакция считалась положительной при выявлении клеток с цитоплазматическим окрашиванием. Оценка общей лимфоцитарной инфильтрации и степени разрушения структуры имплантов за счет прорастания соединительной ткани осуществлялась полуколичественно по импровизированной шкале (в крестах). Степень васкуляризации образца оценивалась как общее количество сформированных (дефинитивных) сосудов в исследованных полях зрения (не менее 3 повторов на каждый препарат).

Количественную оценку минерализации (преципитаты кальция) в образцах проводили методом адсорбционной спектроскопии (TECAN Infinity F200, Австрия; набор Calcium AS FS (Arsenazo III; DiaSys, Германия)) [2, 10].

Для полученных результатов определяли среднее значение и стандартную ошибку среднего значения. Учитывая непараметрическое распределение количественных признаков, для сравнения групп (различных мембран) использовали U-критерий Манна –Уитни.

Результаты

Мембраны из диафрагмы

После гетеротопической имплантации мембраны на основе децеллюляризованной диафрагмы подвергались ряду морфофункциональных преобразований с выраженной динамикой: постепенное истончение и уплотнение образца, врастание в него элементов реактивно измененной соединительной ткани с кровеносными сосудами и наличием выраженного клеточного лимфоцитарно-гистиоцитарного инфильтрата, придающими ей сходство с грануляционной тканью (рис. 1, табл.). В период от 30 до 45 сут. после имплантации врастающая новообразованная соединительная ткань состояла из богатого аморфными компонентами матрикса и разнообразных клеточных элементов: фибробластов, миофибробластов, макрофагов, лимфоцитов (рис. 1). К 45 сут. наблюдалось характерное образование многочисленных сосудов микроциркуляторного русла (рис. 1). К 70 сут. выявлялась практически полная резорбция имплантированных фрагментов или выраженное истончение единичных оставшихся образцов (рис. 1).

При этом в структуре нерезорбировавшихся образцов наблюдалось отсутствие новообразованной соединительной ткани между фрагментированными пучками матрикса диафрагмы, появление плотного поверхностного тонкого новообразованного коллагенового слоя и дистрофическое обызвествление протяженных фрагментов стромы имплантированного материала под новообразованным тонким слоем. Также по всему объему образцов обнаруживались полноценные кровеносные сосуды с вполне дифференцированной стенкой (табл.).

В целом протективные свойства и эластичность материала имплантированных фрагментов постепенно убывала к 45 сут. имплантации. К 70 сут. наблюдалось замещение ткани имплантата на новый, прочный, очень тонкий коллагеновый неоматрикс, содержащий большое количество сформированных сосудов. Проявляющаяся к 70 сут. кальцификация образцов (рис. 1; табл.) свидетельствовала о процессах утилизации «старого» имплантированного матрикса через минерализацию уже после образования «нового» (собственного) матрикса, что говорит, в целом, о кондуктивном эффекте используемого типа биологических мембран.

Мембраны из перикарда

Имплантированные фрагменты этой группы отличались более выраженным (в сравнении с М-Д) сохранением структуры и барьерных характеристик имплантированного материала (рис. 2, табл.). Даже к 70 сут. имплантации массированного врастания тканей из реципиентного ложа в структуру образца не происходило (рис. 2). К 30 сут. после имплантации выявлялось развитие рыхлой грануляционной ткани по периферии имплантата (рис. 2), которая уже к 45 сут. резко истончалась с заменой на мощные параллельно ориентированные пучки коллагеновых волокон, свидетельствующие о преобразовании грануляционной ткани в формирующуюся капсулу (рис. 2, табл.). В целом, васкуляризация материала носила преимущественно поверхностный характер с максимальным сосредоточением новообразованных сосудов в матриксе формирующейся капсулы (рис. 2). В дальнейшем, к 45 сут. после операции новообразованные кровеносные сосуды увеличивались в диаметре; к 70 сут. общее количество сосудов уменьшалось, они приобретали дефинитивную структуру (рис. 2). К 70 сут. процесс замещения материала импланта новообразованной соединительной тканью становился более выраженным и проявлялся в развитии пограничной кальцификации и значительном «уплотнении» образца за счет более тесного примыкания друг к другу новообразованных коллагеновых волокон (рис. 2). На всех исследованных сроках гистологических данных, свидетельствующих об активной фагоцитарной и лимфоцитарной реакции на материал, выявлено не было.

В отличие от материалов, созданных на основе ксенодиафрагмы, М-П начинали кальцифицироваться уже к 30 сут. после имплантации (табл.). К 45 сут. минерализация образцов носила тотальный характер, при этом кальцифицированные участки соответствовали слоям перикарда и имели ленточное расположение вдоль внешней или внутренней стороны формирующейся капсулы (рис. 2, табл.). К 70 сут. после операции области кальцификации, контактирующие с мышечной тканью реципиента, представляли собой тонкую пограничную пластинку. В целом полученные данные свидетельствовали о возможном остеогенном эффекте М-П.

Мембраны из твердой мозговой оболочки

По сравнению с предыдущими материалами, М-ТМО быка характеризовались наименьшей «реактогенностью» (табл.). Лишь на ранних сроках (30 сут.) наблюдалась лимфоцитарная инфильтрация поверхностных слоев тканевого фрагмента. В тоже время уже на 30 сут. имела место активная резорбция пограничных слоев матрикса имплантированных мембран, центральные участки материала при этом оставались незадействованными в процессе биопреобразований (рис. 3). Миграция лейкоцитов в поверхностные слои наблюдалась одновременно с врастанием кровеносных сосудов (рис. 3, табл.).

Через 45 сут. наблюдалось завершение активных процессов со стороны формирующейся соединительнотканной капсулы, при этом клеточные элементы врастающих структур не мигрировали в сопредельные слои тканевого образца (рис. 3). Несмотря на относительно быструю резорбцию материала, сохранившие целостность имплантаты не подвергались общему расслоению, структура имплантатов была сохранена.

Через 70 сут. после имплантации срединный волокнистый остов М-ТМО становился более разобщенным, сосуды приобретали более выраженную дефинитивную структуру (рис. 3), врастания соединительной ткани и синтеза «молодых» коллагеновых волокон и аморфного компонента не наблюдалось. Практически все имплантированные фрагменты подверглись интенсивной пограничной кальцификации (табл.), при этом характер наблюдающейся минерализации носил преимущественно деструктивный характер.

Обсуждение

В рамках проведенного исследования были изучены резорбируемые мембраны, изготовленные из трех типов донорских тканей. В ходе исследования было выявлено, что реакция реципиентного ложа и структурные преобразования протестированных барьерных мембран характеризовались различной динамикой в части новообразования соединительной ткани и биорезорбции материала. Полученные результаты дают основания планировать для каждого вида мембраны специфическое предназначение. На основании полученных данных можно заключить следующее:

1. Все имплантируемые материалы биосовместимы.

2. Наиболее быстро и полно (30 сут. – 80%) подвергается резорбции М-ТМО. При этом данный материал в целом истончается, но не теряет своей барьерной функции. Помимо этого, группа М-ТМО показала самую низкую степень минерализации, а также невыраженную гистиоцитарную/ лимфоцитарную инфильтрацию и ангиогенез. Следовательно, наименее выраженные процессы реактивности после имплантации индуцировали именно образцы из ТМО.

3. Наиболее продолжительный срок биодеградации наблюдался у М-П. По данным гистологического и иммуногистохимического исследований, наиболее выраженная инкапсуляция также имела место в группе М-П. В тоже время, у образцов М-П наблюдалось наименее выраженное разрушение структуры, минимальные инфильтрация и прорастание соединительной тканью. Кроме того, материалы данного вида характеризовались выраженной минерализацией, что потенциально может повысить интеграцию с костной тканью.

4. Наименьшие протективные свойства (в виде быстрой деструкции) выявлялись у М-Д. В образцах данной группы определялся активный ангиогенез и минерализация материалов. Инфильтрация тканей была более выраженной, чем в группе М-П. При этом более быстрый срок резорбции и выраженный кондуктивный эффект данных материалов может быть определяющим критерием для их использования в случаях, не требующих длительной барьерной функции, а, напротив, максимально быстрой утилизации имплантатов биологического происхождения. Таким образом, каждая разновидность разработанных биологических мембран в клинической практике может иметь различные показания. Важно понимать, что протективные свойства мембран, то есть срок сохранения целостности, является важным для выполнения их предназначения в клинической практике (барьерная функция, кондуктивная роль – направление формирующегося регенерата; оптимизация репаративного процесса).

Учитывая, что М-ТМО является наиболее биоинертной, имеет средний срок биорезорбции (из трех исследованных материалов) и не теряет барьерной функции вплоть до 70 сут., она может быть использована для предотвращения врастания эпителия в зону остеогенеза и удержания остеопластического материала в области имплантации, так как сроками формирования пригодного для дальнейшей работы (имплантологическое лечение) костного регенерата являются 5–6 мес. после аугментации [1, 8].

В свете выявленных свойств мембраны М-Д можно рекомендовать как материал выбора для аугментации мягких тканей, как альтернативу аутотканям, а именно свободному соединительнотканному и слизистому лоскуту с твердого неба, что является, несомненно, в высшей степени актуальным в современной практике хирургии полости рта [1, 9].

В случае направленной регенерации костной ткани без возможных осложнений в виде гетеротопической кальцификации из-за применения привнесенных остеоиндуктивных факторов, можно использовать М-П. Помимо этого, М-П характеризуется наиболее длительной биорезорбцией, без выраженных процессов ангиогенеза даже к 70 сут. после имплантации, вследствие чего данный вид мембраны может являться материалом выбора для формирования более плотной и качественно устойчивой структуры десны в области костной регенерации или дентальной имплантации. Такой вид мембран может быть особенно актуален при техниках костной аугментации с преимущественным использованием аутотканей или донорских (полученных от человека посмертно или прижизненно) материалов, в том числе по причине более быстрого формирования «рабочего» регенерата по сравнению с материалами ксеногенного и синтетического происхождения. В тоже время, выраженная биосовместимость материалов и сравнительно слабая степень клеточной инфильтрации свидетельствуют о том, что исследованные ограничительные мембраны можно целенаправленно модифицировать за счет дополнительной обработки биологическими агентами с определенными эффектами. Так, например, насыщение мембраны антибиотиками или антисептиками в липосомальной форме может профилакттировать воспаление в послеоперационном периоде. Если модифицировать кондуктивную функцию, то насыщение мембран индуктивным агентом, например, rhBMP-2, rhBMP-7 и др., может обеспечить активацию остеогенеза в зоне костного дефекта или атрофии костной ткани. Внесение в структуру М-Д биологически активных веществ, стимулирующих регенерацию, может быть востребовано для усиления восстановления мягких тканей.

В целом, требуются дальнейшие доклинические исследования разработанных биологических мембран. Возможно, они будут иметь различное применение в клинической практике, т.е. позволят добиться успешных результатов лечения для различных групп пациентов.

Подняться вверх сайта