Поиск Кабинет

Эффективность использования аутофибробластов при хирургическом лечении пародонтита

Гены & Клетки: Том VIII, №3, 2013 год, стр: 72-77

 

Авторы

Грудянов А.И., Зорин В.Л., Переверзев Р.В., Зорина А.И., Бозо И.Я.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Деструктивные формы заболеваний пародонта имеют высокую распространённость. Наше исследование было нацелено на оценку эффективности тканеинженерного остеопластического материала в лечении пациентов с патологией пародонта. Мы получали аутогенные фибробласты слизистой оболочки полости рта пациентов, совмещали их с носителем из гидроксиапатита и трансплантировали в ходе стандартного хирургического лечения при деструктивных формах пародонтита. В качестве контроля использовался материал без клеток, имплантированный тем же пациентам, но в области пародонта других пораженных зубов.

Был показан больший эффект тканеинженерного остеопластического материала по показателю глубины пародонтальных карманов, однако существенной разницы по приросту костной ткани и другим показателям не было выявлено. Таким образом, требуется продолжение исследований для изменения технологии создания тканеинженерного материала и выбора более оптимального носителя для фибробластов слизистой оболочки.

Проблема лечения воспалительных заболеваний пародонта актуальна ввиду их высокой распространенности среди населения[1–3]. Так, по данным Американской академии пародонтологии, озвученным на заседании ВОЗ в 2005 г. и опубликованным в журнале «Periodontology», деструктивными формами патологии пародонта страдает 10–15% населения Земли. В популяции лиц трудоспособного возраста (35–44 года) частота распространенности патологии достигает 20%. Важно, что пародонтит легкой степени – потенциально переходящий в более тяжелые, деструктивные формы, характерен еще для 20–40% населения планеты трудоспособного возраста[4]. В России, по данным ЦНИИ Стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, распространенность воспалительных заболеваний пародонта соответствует общемировой ситуации[5].

При этом основу современного комплексного лечения пациентов с патологией пародонта воспалительного генеза составляют хирургические методы, направленные на устранение очагов костной деструкции и обеспечение условий для эффективного репаративного процесса. Сложность получения оптимальных результатов лечения – полного восстановления утраченных объемов костной ткани пародонта – обусловлена не только объемами образовавшегося дефекта и недостаточной активностью репаративного остеогенеза, но и спецификой компенсаторно-адаптационных реакций тканей полости рта, а именно выраженным репаративным потенциалом слизистой оболочки. Так, без восполнения пародонтального костного дефекта остеопластическими материалами происходит избыточный рост слизистой оболочки десны по «свободной» от костной ткани поверхности корня зуба, что препятствует восстановлению объема костной ткани[6, 7]. В этой связи, деструктивные формы пародонтита являются абсолютным показанием для применения остеопластических материалов в ходе хирургического лечения.

Разрешенные для применения в клинической практике остеопластические материалы, в целом, позволяют оптимизировать репаративный остеогенез в парадонтальной области и получить удовлетворительные результаты лечения. При этом, механизм их действия обеспечен лишь остеокондукцией, то есть способностью служить своеобразной матрицей, направляющей рост костного регенерата[8]. Однако в целом ряде клинических ситуаций, особенно при больших объемах костных дефектов и (или) значительной распространенности деструктивного процесса, остеокондуктивного действия остеопластических материалов недостаточно для успешного лечения пациента.

В этой связи, в попытке наделить остеопластические материалы остеокондукцией и (или) остеогенностью активно разрабатываются тканеинженерные технологические подходы, среди которых одним из наиболее эффективных является клеточный.

Среди различных клеточных типов, потенциально способных активировать репаративный остеогенез, нашей исследовательской группой выбраны фибробласты, которые по профилю продуцируемых биологически активных веществ, во многом, сопоставимы с мультипотентными мезенхимными стромальными клетками (ММСК) и могут быть получены из минимального по размеру биоптата слизистой оболочки полости рта – тканевого источника, наиболее доступного для врачей стоматологического профиля. Более того, в последние годы показано, в том числе и нашей исследовательской группой, что фибробласты, как и ММСК, способны к мультилинейной дифференцировке, в том числе в остеогенном направлении[9–11].

Целью работы явилось изучение эффективности использования аутогенных фибробластов при проведении лоскутных операций у лиц с пародонтитом средней и тяжелой степени.

Материал и методы

Характеристика пациентов

Проведение клинического исследования было одобрено Ученым советом и Локальным этическим комитетом ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ» МЗ России. В исследование были включены пациенты (n = 9, 5 мужчин, 4 женщины; возраст – 36–49 лет) с пародонтитом средней и тяжелой степеней. Основными критериями включения являлись:

– величина потери клинического прикрепления десны (> 5 мм) и убыль костной ткани альвеолярного отростка верхней челюсти или альвеолярной части нижней челюсти на величину более 1/2 длины корня;

– распространение патологического процесса на пародонт нескольких зубов.

От всех пациентов было получено письменное информированное согласие на участие в клиническом исследовании. Для выявления патологии, соответствующей критериям невключения, каждому пациенту выполнялось клиническое обследование, а также ряд лабораторных анализов: общий, биохимический анализы крови и мочи; серологическое исследование крови.

На первом этапе клинического исследования у всех пациентов, осуществляли биопсию – иссекали фрагмент слизистой оболочки размером 2×2 мм со стороны преддверья полости рта, твердого неба или ретромолярной области. Полученный биоптат помещали в герметичную стерильную пробирку с питательной средой и антибиотиком, которую доставляли в лабораторию не позднее 3 сут. с момента забора.

Получение и характеристика тканеинженерного остеопластического материала

Исследуемый тканеинженерный остеопластический материал состоял из носителя («ГАП-99», Полистом, Россия) и аутогенных фибробластов человека. В качестве контрольного материала использовали носитель без клеток.

Получение первичной культуры фибробластов человека. Биоптаты слизистой оболочки полости рта обрабатывали коллагеназой II типа (Sigma, США). Полученные клеточные суспензии культивировали в среде DMEM (Панэко) с 10% ЭТС (Панэко) и 40 мкг/мл гентамицина в течение 14 сут. в культуральных флаконах 25 см2 (Nunc, США). При достижении монослоем 80–100% конфлуэнтности клетки снимали с поверхности флаконов 0,05% раствором трипсина-ЭДТА ( Biological Industries, США) и пересевали с плотностью около 104 клеток на см2 на поверхности культуральных флаконов большей площади (75 см2 , Nunc, США), культивировали в среде DMEM, содержащей 10% FBS и 40 мкг/мл гентамицина. По достижении 80–100% конфлуентности клетки пересевали во флаконы с площадью поверхности 170 см2 (Nunc, США) и культивировали до получения необходимого количества.

Иммунофенотипический анализ фибробластов десны человека. Поверхностные маркеры (CD) определяли посредством цитофлуориметра FACS Cantoтм II c программным обеспечением «FACSDivaтм» (Becton Dickinson, США). В работе использовали флуоресцентные антитела к маркерам гемопоэтических (CD34, CD45), мезенхимальных (CD73, CD90, CD105 (Invitrogen, США)) и эпителиальных (цитокератины 14–16, 19) (BD Pharmingenтм, США) клеток.

Совмещение носителя и клеток. Полученную после трипсинизирования суспензию клеток иммобилизовывали на гранулах ГАП-99 размером 250 мкм из расчета 2×107 клеток на 1 г носителя в среде культивирования в течение 24 ч. После этого гранулы носителя с клетками трижды отмывали от культуральной среды буферным раствором Хенкса и ресуспендировали в 0,5 мл раствора Хенкса, содержащего 5% аутологичной сыворотки пациента. Персонализированные тканеинженерные материалы использовали в течение 1–2 ч после изготовления.

Применение остеопластических материалов Всем пациентам была оказана стандартная медицинская помощь, включающая терапевтические и хирургические методы. Оперативное лечение в виде лоскутных операций по методике Видмана – Неймана выполнялось после необходимой санации полости рта и местной противовоспалительной и (или) антибактериальной терапии.

В ходе выполнения хирургического этапа лечения каждому пациенту в одном сегменте челюсти выполняли введение тканеинженерного остеопластического материала (клиническая группа, № 1), а в другом – носителя без клеток (контрольная группа, № 2). В общем исчислении, с трансплантацией целевого материала лечение было проведено в области 32 зубов, а пародонтальные зоны в области еще 34 зубов составили контрольную группу.

Оценка результатов исследования

Клинические методы. Для клинической оценки состояния тканей пародонта определяли глубину пародонтальных карманов и подвижность зубов, а также использовали следующие индексы: индекс кровоточивости (Muhlemann H.R. в модификации Cowell I., 1975), индекс гигиены J. Silness – H. Loe (1967); тяжесть пародонтита определяли по пародонтальному индексу A. Russel (1956).

Инструментальные методы исследования. Для количественной оценки степени убыли альвеолярной части нижней челюсти и альвеолярного отростка верхней челюсти использовали индекс деструкции альвеолярной кости (индекс Фукса). Степень поражения фуркаций в горизонтальном направлении определяли по S.E. Hamp (1975). Вертикальную убыль кости от фуркации оценивали по D. Tarnow и P. Fletcher (1984).

Изучение метрических параметров десны и пародонтальных карманов проводили с использованием градуированного пародонтального зонда и автоматизированной компьютерной диагностической системы «Флорида Проуб» (США).

Кровоток в десне определяли методом лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) с помощью анализатора ЛАКК-02 (ЛАЗМА, Россия). Состояние микроциркуляции оценивали по показателю, характеризующему уровень капиллярного кровотока (М), и коэффициенту вариаций (Kv), отражающему вазомоторную активность сосудов гемомикроциркуляторного русла.

КТ костей челюсти осуществляли на компьютерном томографе New Tom 3G (Nim S.r.l., Италия), ортопантомографию – на аппарате рентгеновском панорамном ORTHOPHOS XG. Повторные исследования клинических показателей проводили через 3, 6 и 9 мес., рентгенологические исследования – через 6, 9 мес.

Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью программы Statistica 7.0 (StatSoft, США). Количественные результаты исследования были представлены средними значениями показателей и стандартной ошибкой средних значений. Проверку на соответствие распределения значений исследуемых параметров закону нормального распределения осуществляли с помощью критерия Колмогорова – Смирнова. Ввиду отличия выборок от нормального распределения для проверки статистических гипотез использовали непараметрические методы: U-критерий Манна – Уитни и критерий Вилкоксона.

Результаты и обсуждение

Тканеинженерные медицинские изделия и технологии для лечения пациентов с деструктивными формами заболеваний пародонта активно разрабатываются в виду значительной актуальности проблемы. Для их создания используются различные клеточные популяции, как то ММСК, остеогенные клетки надкостницы, фибробласты и др. Однако все большее значение придается не столько типу клеток, сколько его тканевому источнику, доступность эксплантации которого для врача соответствующей специальности имеет существенное значение. Одни исследователи используют ММСК пульпы зуба, периодонтальной связки для создания тканеинженерных остеопластических материалов[12], другие – клетки дентальных фолликулов[13], наше исследование связано с фибробластами слизистой оболочки ротовой полости, ввиду их наибольшей доступности и практичности использования в рамках разрабатываемой медицинской технологии.

Характеристика клеточного материала

Известно, что фибробласты не имеют специфических иммунофенотипических маркеров, однако характеризуются высоким уровнем экспрессии поверхностных антигенов, характерных для ММСК, отличаясь от последних значимо большей продукцией структурных белков – компонентов межклеточного матрикса. В этой связи, для обоснованного отнесения полученных культур клеток к фибробластам нами был использован стандартный перечень антигенов, исследуемых при идентификации ММСК, а также оценен профиль экспрессии структурных белков. В результате клетки, выделенные из слизистой оболочки полости рта человека, характеризовались отсутствием гемопоэтических (CD34, CD45) и эпителиальных (цитокератины 14–16, 19) маркеров и экспрессировали мезенхимальные поверхностные антигены (CD73, CD90, CD105), а также коллагены I, III типа, эластин и виментин, что позволило отнести полученные нами культуры клеток к фибробластам (табл. 1).

Результаты клинического обследования пациентов

Клиническое течение послеоперационного периода в обеих группах практически не отличалось. На протяжении первых 3 сут. наблюдался умеренный отек мягких тканей, незначительная гиперемия лоскута и его болезненность при пальпации. На 7 сут. явления операционной травмы исчезали.

Динамика пародонтальных индексов 1 и 2 групп после операции представлена в таблице 2. Исходная индексная оценка степени выраженности воспалительной реакции в тканях десны соответствовала умеренному воспалению. Изначально определялись достаточно глубокие пародонтальные карманы (более 5 мм) и большая потеря прикрепления десны, что закономерно сопровождалось выраженной подвижностью зубов. Исходное значение индекса Фукса в 1 группе составило 0,47±0,03, а во 2 – 0,49±0,07, что соответствовало степени деструкции костной ткани в пределах от 1/2 до 2/3 длины корня. Таким образом, исходное состояние тканей пародонта в участках вмешательства в обеих группах было практически идентичным.

Индексы гигиены, кровоточивости и гингивальный индекс в послеоперационном периоде (через 3 мес. после операции) отражали благоприятную динамику состояния десны и гигиены рта в обеих группах. Выраженность воспалительных изменений десны (по индексу кровоточивости) последовательно снижалась с высоким градиентом к 6 мес. после операции в обеих группах с дальнейшей стабилизацией показателей на низких уровнях.

Достижение стабильно хорошей гигиены полости рта (индекс Silness – Loe ≤1,0) через 6 мес. после операции было отмечено у половины пациентов. Глубина пародонтальных карманов прогрессивно снижалась в двух изучаемых группах. Однако во 2 группе после 6 мес. отмечалась относительная стабилизация показателей, тогда как в 1 группе имело место дальнейшее уменьшение глубины пародонтальных карманов. Вследствие этого через 9 мес. после операции в клинической группе глубина пародонтальных карманов была меньше (3,7±0,4 мм), чем в контрольной (4,1±0,2 мм).

В последнее время многие отечественные и зарубежные исследователи, характеризуя степень деструкции тканей пародонта, используют величину потери прикрепления, поскольку глубина пародонтального кармана может быть ложно определена за счет отека мягких тканей, либо из-за рецессии десны. Прирост зубодесневого прикрепления является ключевым клиническим показателем эффективности хирургического лечения тканей пародонта. В результате проведенного лечения было определено увеличение этого показателя в послеоперационном периоде в обеих группах (рис. 1). Однако при анализе полученных данных было показано, что в 1 группе через 9 мес. после операции прирост зубодесневого прикрепления был большим, чем в контроле.

Результаты инструментальных методов обследования

На ортопантомограммах и компьютерных томограммах костей челюстей у пациентов обеих групп было отмечено уменьшение костных и фуркационных дефектов разной степени, уплотнение костной структуры, восстановление межальвеолярных перегородок. Через 9 мес. на ортопантомограммах в обеих группах обнаруживалась нормализация костного рисунка при сохранении на отдельных участках очагов остеосклероза: контур альвеолярной кости становился четким, межальвеолярные перегородки приобретали дугообразную форму, костные карманы уменьшались.

Показатели фуркационных дефектов в горизонтальном и вертикальном направлениях до и в различные сроки после операции приведены в таблице 3, которая наглядно демонстрирует положительную динамику изменения показателей в обеих группах по сравнению с исходными. Статистически значимых различий в изменении данных показателей между группами не было выявлено.

Для комплексной оценки восстановительного процесса в тканях пародонта важную роль имеют методы исследования микроциркуляции, которая в определенной степени отражает условия, в которых протекает репаративный остеогенез. Параметры микроциркуляции в тканях десны в норме составляют для М – 18–20 усл.ед., а для Kv – 12–13%.

Исходно повышенные показатели ЛДФ типичны для воспаления, сопровождающегося гиперемией, расширением сосудов гемомикроциркуляторного русла. Достоверное снижение показателя микроциркуляции М с нормализацией уровня в обеих группах наблюдалось через 6 мес. после операции. Вазомоторная активность микрососудов у пациентов обеих групп снижалась через 3 мес. и нормализовалась через 12 мес. после хирургического вмешательства. Межгрупповые различия показателей ЛДФ отсутствовали (табл. 4).

Заключение

Таким образом, лечение пациентов с деструктивными формами генерализованного пародонтита было успешным при использовании остеопластического материала как с аутогенными фибробластами, так и без них. Однако полученный результат нельзя трактовать как «стопроцентный», так как костная ткань пародонта ни в одной из групп не восстановилась полностью. Кроме того, по причине необходимости минимизации использования инвазивных методов в клинических исследованиях не был выполнен гистологический анализ регенерата из областей введения материалов, что не позволяет констатировать реализацию гистотипической регенерации костной ткани. При этом лишь формирование зрелой костной ткани может обеспечить стабильность достигнутых результатов лечения. Учитывая, что эффективность тканеинженерной конструкции обеспечивается не только клеточной популяцией, входящей в ее состав, но и носителем, можно предположить, что примененные в данном исследовании аутогенные фибробласты не проявили весь свой «терапевтический» потенциал, показанный в целом ряде работ, из-за недостаточной «пригодности» выбранного носителя. В этой связи, исследование будет продолжено, но уже с другими, более подходящими для создания тканеинженерных костных графтов носителями.

Подняться вверх сайта