Поиск Кабинет

Эффект одновременной экспрессии различных изоформ фактора роста эндотелия сосудов VEGF и основного фактора роста фибробластов FGF2 на пролиферацию эндотелиальных клеток пупочной вены человека HUVEC

Гены & Клетки: Том V, №2, 2010 год, стр.: 62-67

 

Авторы

Салафутдинов И.И., Шафигуллина А.К., Ялвач M3, Кудряшова Н.В., Лагарькова М.А., Шутова М.В., Киселев С.Л., Масгутов Р.Ф., Жданов Р.И., Киясов А.П., Исламов Р.Р., Ризванов АА.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Трансплантацию стволовых, прогениторных и дифференцированных клеток активно исследуют как способ коррекции дегенеративных заболеваний. Однако механизм терапевтического действия клеточной терапии остаётся не изученным. В настоящее время все большую популярность приобретает теория стимуляции процессов регенерации за счет секреции трансплантированными клетками различных ростовых и трофических факторов. Генная модификация клеток перед трансплантацией позволяет обеспечить эффективную экспрессию и адресную доставку разных терапевтических факторов. Применение плазмидных экспрессионных векторов считают одним из биологически безопасных и перспективных подходов генной модификации клеток. В ходе нашей работы были созданы генетические конструкции на основе двухкассетной плазмиды pBudCE4.1, кодирующие комбинации различных изоформ фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и основного фактора роста фибробластов (FGF2) человека. Экспрессия рекомбинантных генов подтверждена методами иммуноблотинга и иммуноцитохимии. Показано, что генная модификация модельной клеточной культуры FIEK293 полученными плазмидами привела к повышенной паракринной стимуляции пролиферации эндотелиальных клеток пупочной вены человека FIUVEC in vitro.

Ключевые слова: экспрессионные плазмиды, фактор роста эндотелия сосудов VEGF, основной фактор роста фибробластов FGF2, ангиогенез, трансфекция, эндотелиальные клетки пупочной вены человека, HUVEC.

Формирование, рост и ветвление кровеносных сосудов — сложный скоординированный в пространстве и во времени процесс васкулогенеза в пренатальном и ангиогенеза в постнатальном периоде развития. Наиболее активно формирование сосудов происходит в период эмбрионального развития, а во взрослом организме ангиогенез ограничен компенсаторными и регенерационными процессами. Кроме того, ангиогенез играет важную роль в патогенезе злокачественных новообразований.

В процесс образования функциональных сосудов вовлечено большое число факторов, многие из которых в настоящее время подробно исследованы[1 ]. Во всех патологических или физиологических процессах основным индуктором ангиогенеза служит кислородное голодание ткани (гипоксия), в результате которого происходит секреция HIF-1 (hypoxia-inducible factor-1; индуцируемый гипоксией фактор-1)[2, 3].

В свою очередь HIF-1 стимулирует экспрессию целого ряда факторов, обеспечивающих адаптацию клеток к гипоксии[4], однако ключевой транскрипционной мишенью для него выступает фактор роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor, VEGF) и его рецепторы[5]. VEGF был первоначально описан как сосудистый фактор проницаемости (vascular permeability factor, VPF)[6], который, как было показано впоследствии, проявляет специфическую митогенную активность в отношении эндотелиальных клеток[7]. Семейство VEGF включает VEGF-А (ранее просто VEGF), VEGF-B, VEGF-С. VEGF-D, VEGF-E и плацентарный фактор роста (placental growth factor, PIGF)[8]. VEGF-A, главным образом, участвует в ангиогенезе. VEGF-С и VEGF-D вовлечены в процесс формирования лимфатических сосудов. Ангиогенное действие VEGF происходит через эндотелиальную форму синтазы оксида азота (nitric oxide, NO). VEGF стимулирует активность этого фермента и, следовательно, образование оксида азота. Ген VEGF-А человека расположен в хромосомном локусе 6р21.3. Кодирующая область охватывает около 14 т.п.н. и включает в себя 8 экзонов[9,10]. Альтернативный сплайсинг экзонов 6 и 7 общей пре-мРНК может давать начало 11 изоформам (VEGF121 121Ь 145 148 1В2 1В2Ь 185, 185Ь. 18з, 189 и гое5 • в т0 время как все транскрипты гена vegf содержат экзоны 1^5 и 8[10]. Вышеперечисленные изоформы отличаются по внеклеточной локализации и биологическим свойствам[11]. Большинство клеток, продуцирующих VEGF-А, предпочтительно экспрессируют изоформы VEGF121, VEGF1B5 и VEGF18g. VEGF121 — это слабокислый белок, который в результате отсутствия гепарин связывающих доменов и низкого сродства к внеклеточному матриксу значительно легче диффундирует в межклеточном пространстве, в сравнении с другими изоформами[12]. VEGF1B5 — изоформа, преобладающая в большинстве тканей; она представляет собой более основной белок, чем VEGF121. Белок VEGF1B5 способен связывать гепарин, однако большая его часть свободно секретируется в межклеточный матрикс. VEGF18g — выраженный основной белок; после секреции он остается ассоциированным с клеткой, легко связывается с внеклеточным матриксом и гепарином, может выделяться в растворимой форме (VEGF110) с гепарином, гепариназой или плазмином[13].

Фактор роста фибробластов 2 (FGF2) — представитель большого семейства полипептидных факторов роста. У позвоночных молекулярная масса 22 членов FGF семейства варьирует в диапазоне от 17 до 34 kDa при 13—71% гомологии аминокислотных последовательностей. Впервые FGF2 был обнаружен в гипофизарных экстрактах и описан Н. Armelin в 1973 г.[14]. Представители семейства FGF демонстрируют высокое сродство к гепарин сульфат протеогликанам и необходимы гепаран сульфатам для активации одного из четырех FGF рецепторов в клеточной мембране. Во время эмбрионального развития FGF участвуют в регуляции пролиферации, миграции и дифференцировки разных клеточных типов[15]. Во взрослом организме FGF2 служит гомеостатическим фактором и участвует в тканевой регенерации и ангиогенезе, выполняя роль митогена, стимулирующего пролиферацию эндотелиальных клеток, и неспецифического стимулятора формирования сосудов[16].

Описаны 5 изоформ FGF2 с молекулярными массами 18, 22, 22.5, 24, и 34 kDa, получаемыми в результате альтернативного сплайсинга общего предшественника мРНК[17]. Для высокомолекулярных изоформ (22, 22.5, 24, и 34 kDa) характерно наличие специфических аминокислотных последовательностей, отвечающих за транслокацию в ядро клетки, в то время как низкомолекулярная изоформа лишена секреторной последовательности. Механизм секреции низкомолекулярной изоформы FGF2 во внеклеточное пространство на данный момент исследован недостаточно[18].

В настоящее время молекулы VEGF и FGF активно применяют для индукции ангиогенеза в терапевтических целях[19, 20]. Стратегия терапевтического ангиогенеза предполагает применение рекомбинантных белков факторов роста или их генов для улучшения реваскуляризации ишемизированных тканей. В тоже время известно, что стимулирование одиночными ан-гиогеными молекулами недостаточно для развития функциональных сосудов[21]. Вследствие этого, применение комбинированной экспрессии рекомбинантных VEGF и FGF2 представляет собой более эффективный подход для стимулирования развития сосудистого русла за счет выраженного синергетического эффекта между VEGF и FGF-2 на эндотелиальные клетки, приводящего к формированию сосудов, демонстрирующих высокую морфофункциональную целостность и не регрессирующих после прекращения стимуляции[22, 23]

К настоящему времени рассматривается стратегия, основанная на применении различных клеточных дериватов для доставки терапевтических проангиогенных, нейротрофических, антиапоптотических генов в очаги дегенерации. Наиболее перспективными в этом отношении могут выступать мультипатентные мезенхимальные стволовые клетки (ММСК), которые способны давать начало специализированным клеткам разных тканей. Генетически модифицированные ММСК, полученные из различных источников (костный мозг, клетки пуповинной крови, жировая ткань, и ряд других), трансдуцированные /трансформированные плазмидны-ми или вирусными конструкциями способны повышать уровень экспрессии терапевтических генов в десятки раз, тем самым значительно усилить терапевтический эффект трансплантированных клеток и регенераторный потенциал органа-мишени. Так, например, трансплантация клеток пуповинной крови, трансфецирован-ных человеческим геном VEGF, активирует ангиогенез в тканях при моделировании хронической ишемии конечностей у крыс[24] и инфаркта миокарда у мышей[25]. Аналогичные результаты получены при использовании модифицированных стволовых клеток, полученных из жировой ткани[26].

Материал и методы

Создание экспрессионных плазмидных векторов

Специфические праймеры для ПЦР амплификации полных открытых рамок считывания генов vegf и fgf2 созданы на основе нуклеотидных последовательностей, полученных из базы данных GenBank[27] (табл.). 5- и 3’- концы праймеров содержат адаптерные участки с уникальными сайтами рестрикции для Крп\ и Xho\, по которым проводили клонирование генов в экспрес-сионный плазмидный вектор pcDNA 3.1 + (Invitrogen). Клонирование изоформ vegf121 и vegf189 проводили с помощью ОТ-ПЦР амплификации. В качестве матрицы использовали РНК, выделенную из клеток Raja (клетки линии африканской лимфомы Бёркитта) коммерческого приготовления (Applied Biosystems). Матрицей для ПЦР-амплификации генов vegf165, fgf2 и egfp служили плазмиды pCM\M/EGF165, pBK-CMV-FGF2 и pEGFP-N2. В результате клонирования в плазмиду pcDNA 3.1 + стали доступны дополнительные уникальные сайты рестрикции Hind III и Xba\, фланкирующие вставочные фрагменты.

Ко-экспрессирующие векторы собраны на основе pBudCE4.1 (Invitrogen) субклонированием генов egfp или fgf2 под контролем промотора CMV по сайтам рестрикции Hind\\\ и ХЬа\ и изоформы vegf121, vegf165, vegf189 или egfp под контролем промотора EF-1— по сайтам рестрикции Крп\ и Xho\. Конечное подтверждение получения экспрессионных плазмид pBud-VEGF-FGF2 провели методом ДНК-секвенирования с помощью стандартных вектор-специфических праймеров на автоматическом секвенаторе ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

Культивирование эукариотических клеток

Клетки линии НЕК293Т культивировали на среде DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Invitrogen) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки FBS (ПанЗко, Москва), 100 ЕД/мл пенициллина — 100 мкг/мл стрептомицина (ПанЗко, Москва). Первичную культуру эндотелиальных клеток пупочной вены человека (Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC) поддерживали на среде DMEM/F12 (HyClone) с добавлением 15% фетальной телячьей сыворотки (HyClone), 1% смесь аминокислот (Invitrogen) пенициллин/стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), рекомбинантный bFGF (5 нг/мл) (Chemicon), EGF (20 нг/мл) (Chemicon), VEGF от 10 нг/мл (Chemicon), IGF (10 нг/мл) (Chemicon), гидрокортизон 1мкМ, гепарин 5 ед/мл. Клетки инкубировали в инкубаторе при 37°С, во влажной атмосфере, содержащей 5% С02. Пассирование клеток и замену питательной среды проводили согласно стандартным протоколам.

Трансфекцию клеток НЕК293Т плазмидной ДНК проводили с помощью реагента TurboFect согласно рекомендациям фирмы-производителя (Fermentas). Эффективность трансфекции определяли по количеству EGFP позитивных клеток методом флуоресцентной микроскопии. Культуральную среду клеток, трансфецированных экспрессионными плазмидами, собирали через 24, 48 и 72 ч после трансфекции, объединяли и очищали от остаточного клеточного материала центрифугированием и фильтрованием через 0,45 мкм фильтр.

Иммуноцитохимический анализ

Клетки НЕК293Т высевали на 24-луночные культуральные планшеты и трансфецировали согласно описанной выше методике. Трансфецированные культуры фиксировали в 4% растворе параформальдегида и блокировали 5% бычьим альбумином (Sigma). Клетки инкубировали с первичными гуманизированными анти-VEGF антителами (авастин) в разведении 1:50 и вторичными анти-lgG человека антителами, конъюгированными с флуоресцентной меткой Alexa-488 в разведении 1:1000 (Invitrogen). Анализ окрашенных препаратов проводили на инвертированном флуоресцентном микроскопе Axiovert 200 с компьютерной системой фотодокументации (Carl Zeiss).

Вестерн блоттинг

Клетки НЕК293Т, трансфецированные экспрессионными плазмидами, ресуспензировали в буфере для нанесения проб, наносили на 15% полиакриламидный SDS-PAGE гель и проводили электрофорез по методу Лаэмли[28]. Белки переносили на PVDF мембрану (BioRad) и блокировали 5% раствором обезжиренного молока в фосфатно-солевом буфере с добавлением детергента Tween 20. Мембрану инкубировали 1 ч с первичными моноклональными an™-FGF2 антителами (Sigma) в разведении 1:2000 и вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена в разведении 1:5000 (Sigma). Анализ проводили с помощью набора DAB Substrate Kit (Vector).

Анализ пролиферации эндотелиальных клеток in vitro

Культуральную среду после инкубации с трансфеци-рованными клетками НЕК293Т наносили на клетки HUVEC в различных разведениях (30, 3, 0,3% конечная концентрация) со средой DMEM с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки FBS и пенстрепа без факторов роста. Пролиферативный потенциал оценивали с помощью МТТ теста согласно протоколу фирмы-производителя (Promega).

Результаты и обсуждение

В результате ПЦР амплификации и последующих этапов клонирования получены следующие двухкассетные экспрессионные плазмидные вектора: pBud-VEGF1 21 -EGFP, pBud-VEGF1 65-EGFP, pBud-VEGF1 89-EGFP, pBud-VEGF121-FGF2, pBud-VEGF1B5-FGF2[рис. 1], pBud-VEGF1 89-FGF2, pBud-EGFP-FGF2, pBud-EGFP.

Правильность получения рекомбинантных плазмид подтверждена рестрикционным анализом и автоматическим секвенированием (информация не приведена]. Преимущество обусловлено его способностью одновременно и независимо экспрессировать рекомбинантные гены под контролем двух сильных конституционно активных промоторов CMV и EF-1—. Это позволяет повысить эффективность доставки, гарантировать одновременную экспрессию в кпетках-мишенях двух рекомбинантных генов.

Для подтверждения экспрессии рекомбинантных генов полученными двухкассетными плазмидами мы провели трансфекцию клеток НЕК293Т с помощью коммерчески доступного препарата TransFast. Экспрессию репотёрного белка EGFP оценивали с помощью флуоресцентной микроскопии. Трансфекция всех генетических конструкций, содержащих ген egfp, приводила к зелёной флуоресценции генетически модифицированных клеток (информация не приведена]. Экспрессию изоформ VEGF подтвердили иммуноцитохимическим анализом. Показано, что клетки НЕК293Т, трансфеци-рованные двухкассетными плазмидами, содержащими гены различных изоформ vegf, специфично реагируют с анти-VEGF антителами (рис. 2). Экспрессию рекомбинантного FGF2 подтвердили методом иммуно-блотинга. Анализ лизатов клеток НЕК293Т, трансфеци-рованных двухкассетными плазмидами, содержащими рекомбинантный ген fgf2, показал наличие специфичной белковой полосы на мембране с приблизительной молекулярной массой 18кОа, что соответствует ожидаемому размеру рекомбинантного FGF2 (см. рис. 3). Таким образом, с применением микроскопии и иммунологических методов показано, что все созданные двухкассетные плазмидные векторы экспрессируют соответствующие рекомбинантные гены.

В настоящее время особое внимание уделяют применению комбинированной генно-клеточной терапии для лечения различных заболеваний человека. Подобный подход основан на применении клеток, генетически модифицированных для экспрессии терапевтических факторов. Трансплантированные клетки, в первую очередь стволовые, полученные из различных источников, способны мигрировать в очаги дегенерации и участвовать в процессах регенерации[29, 30]. Несмотря на то, что показано участие трансплантированных клеток в замещении гибнущих клеток организма реципиента[31], большую популярность приобретает теория па-ракринной стимуляции выживаемости клеток и процессов регенерации под действием трансплантируемых стволовых клеток, секретирующих ростовые и трофические факторы[32, 33].

Более того, способность стволовых клеток мигрировать в области дегенерации делает их привлекательными «биологическими реакторами» для адресной доставки терапевтических факторов. Таким образом, генетическая модификация стволовых клеток терапевтическими генами позволит существенно повысить эффективность лечения дегенеративных заболеваний.

Для исследования эффективности паракринной стимуляции ангиогенеза с помощью клеток, генетически модифицированных двухкассетными плазмидами, экспрессирующими разные изоформы VEGF и FGF2, мы применили in vitro модель пролиферации эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC). Для этого мы нанесли культуральную среду клеток НЕК293Т, трансфецированных полученными двухкассетными плазмидами, на клетки HUVEC. При этом скорость пролиферации клеток HUVEC отражала стимулирующее действие растворимых факторов, попавших в среду в результате нормальной жизнедеятельности клеток, а также в результате экспрессии секретируе-мых рекомбинантных белков. Показано, что генетическая модификация двумя терапевтическими генами (различные изоформы VEGF и FGF2) значительно повышает пролиферацию HUVEC по сравнению с экспрессией одиночных ангиогенных факторов (рис. 4). Специфичность биологического эффекта культуральной среды трансфецированных клеток НЕК293Т на пролиферацию HUVEC подтверждена экспериментом по серийному разведению среды. Показано, что уменьшение доли культуральной среды НЕК293Т приводило к снижению пролиферации клеток HUVEC (рис. 5).

Таким образом, в ходе выполнения работы получены экспрессионные плазмидные векторы на основе плазмиды pBudCE4.1, кодирующие комбинации различных изоформ VEGF и FGF2 человека. Показано, что трансфекция культуры клеток НЕК293 полученными плазмидами приводит к секреции рекомбинантных белков в культуральную среду, которая усиливает пролиферацию клеток HUVEC по сравнению с культуральной средой клеток, трансфецированных плазмидами, не содержащими ангиогенные гены, или содержащими лишь один из генов.

Подняться вверх сайта