Поиск Кабинет

Двойной негативный эпигенетический контроль генов, вовлеченных в регуляцию дифференцировки ЭСК человека в эндотелий

Гены & Клетки: Том II, №2, 2007 год, стр.: 34-39

 

Авторы

Волчков П.Ю., Лагарькова М.А., Прохорович МА., Киселев С.Л.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Сосудистый эндотелий является одним из первых дифференцированных видов клеток, которые появляются в раннем эмбриогенезе. Во взрослом организме сосудистый эндотелий играет важную роль в регуляции гомеостаза кровеносных сосудов и отделяет компоненты крови от остальных тканей организма. Эндотелий характеризуется экспрессией определенного набора генов, среди которых транскрипционные факторы GATA-2, -3 и контролируемый ими специфический для сосудистого эндотелия ген eNOS. Большой вклад в контроль работы генов, особенно на этапах раннего развития, дают эпигенетические механизмы. Используя разработанную нами ранее модель контролируемой дифференцировки ЭСК человека в функциональный эндотелий, мы исследовали вклад метилирования промоторных областей генов eNOS, GATA-2 и GATA-3 в регуляцию экспрессии этих генов. Полученные данные показали, что гиперметилирование промоторных областей генов транскрипционного фактора GATA-2 и контролируемого им гена eNOS в недифференцированных ЭСК человека блокирует их экспрессию. В эндотелиальных клетках, полученных из ЭСК, и в HUVEC эти области гипометилированы и гены экспрессируются. Таким образом, нами показано, что в ЭСК осуществляется двойной негативный контроль одного из путей дифференцировки клеток и для разработки схем направленной дифференцировки ЭСК важно знать и контролировать эпигенетический статус генома клеток.

Введение

Сосудистые эндотелиоциты являются одними из первых дифференцированных видов клеток, которые появляются в раннем эмбриогенезе. Развитие эндотелиоцитов тесно свя зано с развитием гемопоэтических клеток. Эти два клеточных типа первыми дифференцируются из мезодермального за родышевого листка, после миграции в желточный мешок. Согласно общепризнанной гипотезе [1], клетки формируют агрегаты гемангиобластов на границе зародышевой и вне зародышевой тканей. Далее созревание идет в кровяных островках, центральные клетки становятся клетками крови, а периферические - эндотелиальными.

Эндотелий высокоспециализированная, метаболичес ки активная ткань, выстилающая внутреннюю поверхность кровеносных сосудов, которая играет важную роль в под держании гомеостаза сосудов с помощью производимых эндотелием факторов. Эндотелий выделяет ряд вазоак тивных медиаторов, например, простоциклин, оксид азо та, эндотелиальный гиперполяризационный фактор (EDHF), которые влияют не только на развитие и тонус гладкомы шечного слоя сосудов, но и на проницаемость сосудов, а так же регулируют циркуляцию лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов [2].

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), обладающие способностью к дифференцировке в различные клеточные типы, представляют собой уникальную модель, используя которую на одной нетрансформированной клеточной ли нии можно изучать клеточные и молекулярные механизмы раннего эмбриогенеза и дифференцировки, а также иметь стандартные модели нормальных терминально диффе ренцированных клеточных типов. Необходимо отметить, что практически все исследования по экспрессии генов выполняются либо на трансформированных клеточных ли ниях, либо на первичных клетках различных особей. И то и другое может приводить к получению некорректных резуль татов. В случае использования разработанных моделей направленной дифференцировки ЭСК в желаемый цито фенотип мы полностью исключаем возможный вклад трансформированного генома и имеем абсолютную вое производимость результатов, поскольку избегаем исполь зования первичных тканевых культур от разных особей и организмов.

Формирование эндотелия в эмбриогенезе и его функ ционирование во взрослом организме сопровождается эк спрессией целого ряда транскрипционных факторов. Семей ство GATA состоит из 6 транскрипционных факторов, из которых GATA 2, 3 и 6 экспрессируются в эндотелии [3]. Первоначально считали, что GATA факторы участвуют лишь в дифференцировке [4], однако, в недавних исследованиях было показано, что GATA факторы принимают непосред ственное участие в реорганизации внеклеточного окружения дифференцированных эндотелиальных клеток, регулируя эк спрессию своих генов-мишеней [5]. Кроме непосредствен ного связывания со своими сайтами, GATA факторы могут связываться с различными транскрипционными факторами и кофакторами, участвуя в образовании сложных транскрип ционных комплексов.

GATA 2 экспрессируется в различных типах тканей и играет важную роль в образовании гемопоэтических пред шественников [6], урогенитального тракта, образовании специфических нейронов V2 в спинном мозге. В процессе дифференцировки и в дифференцированных эндотелиаль ных клетках GATA2 регулирует экспрессию таких генов, как eNOS [7] эндотелии 1, Flk 1, ICAM 2, Р селектин, РЕСАМ 1, Utrophin В, vWF.

GATA3 экспрессируется во многих тканях мышиного эмбриона [8]. Как GATA 1 и 2, GATA 3 принято относить к гемопоэтическим транскрипционным факторам [9, 10]. В работе S. Levenberg и соавт. [11] показано, что GATA3 экспрессируется в недифференцированных эмбриональных стволовых клетках (ЭСК) на очень низком уровне. По мере дифференцировки ЭСК в эмбриоидные тельца увеличение уровня экспрессии GATA 3 происходит вплоть до 6 дня диф ференцировки, а затем экспрессия уменьшается. В рабо тах тех же авторов был продемонстрирован высокий уровень экспрессии этого гена в HUVEC (human umbilical vien endothelial cells). Роль GATA3 в гистогенезе и дифферен цировке эндотелия мало изучена. GATA3 принимает учас тие в позитивной регуляции экспрессии гена VCAM 1, а GATA 6 негативно регулирует тот же ген. Одни GATA фак торы регулируют экспрессию других. Например, GATA 1 принимает участие в регуляции экспрессии GATA2 (12), а GATA 2 регулирует экспрессию GATA 3 [13]. Тем самым, образуется сложная сеть регуляции экспрессии, которая от ражается на фенотипе клеток.

Эти и другие транскрипционные факторы оказывают влияние на экспрессию генов, специфических для эндоте лия. Одним из наиболее характерных эндотелиальных генов является eNOS [14]. eNOS производит основную часть ок сида азота, который участвует в противовоспалительных процессах, регуляции адгезии тромбоцитов к стенкам кро веносных сосудов, а также ингибирует пролиферацию клеток гладкой мускулатуры сосудов. eNOS экспрессирует ся на поздних стадиях дифференцировки эндотелия и ха рактеризует зрелый эндотелий [14]. Для eNOS была показана зависимость экспрессии от эпигенетического статуса его регуляторных областей в эндотелиальных и неэндотелиальных клетках [15]. Для транскрипционных факторов GATA 2 и GATA 3 такие ис следования не проводились. В данной работе мы исследо вали метилирование промоторных областей генов eNOS, GATA 2 и GATA 3 во время тканеспецифической диффе ренцировки ЭСК человека в клетки функционального эндо телия, для чего использовали разработанную ранее в нашей лаборатории модель дифференцировки и селекции эндоте лия из ЭСК человека.

Материал и методы

Клеточные линии

В работе использовались клеточная линия ЭСК человека ESM03 (46ХХ) [16], первичные эндотелиоциты пупочной вены (HUVEC) (46ХХ), предоставленные лабораторией П. Лакти онова (ИХБиФМ, Новосибирск), и первичные инактивиро ванные мышиные эмбриональные фибробласты (МЭФ).

Культивирование ЭСК человека и дифференцировка клеток эндотелия

Среда для культивирования ЭСК человека имела следу ющий состав: Knockout DMEM (Invitrogen), 20% ES Serum Replacement (Invitrogen), 2 mM L глутамин (Invitrogen), 0,1 mM p меркаптоэтанол (Sigma), 1% смесь заменимых аминокислот (Invitrogen), рекомбинантный bFGF (4 нг/мл) (Chemicon), пенициллин/ стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/ мл) (Hyclone).

Эмбриональные стволовые клетки культивировали при 37°С и 5% С02 на фидерном слое МЭФ, инактивированных митомицином С в желатинизированных культуральных чаш ках Петри диаметром 35 мм (Corning и Greiner). Клетки пас сировали каждые 5 6 дней культивирования механической диссекцией или обработкой 0,05% трипсином. Дифферен цировка ЭСК человека в клетки эндотелия осуществлялась как описано в работе М. Lagarkova et al. (in press).

Иммуномагнитная сепарация клеток

Для выделения CD31^ клеток, колонии, растущие на чаш ках, покрытых коллагеном IV типа на 5 день дифференци ровки диссоциировали обработкой 0,05% трипсин/ЭДТА (Hyclone) при 37°С в течение 10 мин. После инактивации трипсина сывороткой клетки дважды промывали PBS, со держащим 0,5% BSA, инкубировали 30 мин с мышиными антителами против CD31 человека (BD) и затем с IgG козы против мыши, связанными с магнитными шариками (Miltenyi Biotec) в течение 15 мин при 8°С. После каждого этапа клет ки дважды промывали PBS, содержащим 0,5% BSA. Для по лучения фракции CD31 позитивных клеток производили элюцию на колонке (Miltenyi Biotec), прикрепленной к маг нитному блоку Mini MACS separation unit (Miltenyi Biotech), согласно рекомендациям производителя.

ОТ-ПЦР анализ

Для выделения тотальной РНК из клеточных культур ис пользовали колонки MiniRNA kit (Qiagen) согласно прила гающимся инструкциям. Обработка ДНКазой I осуществля лась непосредственно на колонках с использованием прилагающегося к набору MiniRNA kit ДНКазы I и буфера. Реакцию обратной транскрипции проводили с использова нием RevertAid М MuLV Reverse Transcriptase (Fermentas) согласно прилагающимся инструкциям. Для проведения ПЦР амплификации использовали Taq полимеразу (Fermentas). Последовательности праймеров (НПФ «Син тол») для ОТ ПЦР указанны в табл. 1.

Геномное бисульфитов секвенирование Для выделения геномной ДНК клетки суспендировали в 0,7 мл буфера, содержащего 100 мМ NaCI, 10 мМ Tris HCI pH 8,0, 25 мМ EDTA pH 8,0, 0,5% SDS и 0,1 мг/мл протеи назы К. Обработку протеиназой К осуществляли в течение ночи при 56°С. ДНК экстрагировали равным объемом фе нола/хлороформа, затем равным объемом хлороформа и преципитировали 1/12 объема 7,5 М ацетата аммония, 2,5 объемами этанола. После двукратной промывки в 70% этаноле ДНК ресуспендировали в буфере ТЕ в концентрации 0,2 мг/мл. Геномная ДНК была подвергнута бисульфитной модификации в соответствии с инструкциями, прилагаю щимися к киту для бисульфитной модификации ДНК (CpGenome Fast DNA Modification Kit, Chemicon). Аликвоты ДНК, модифицированной бисульфитом натрия, были ис пользованы для ПЦР при 45 циклах амплификации. Прай меры для ПЦР были подобраны к промоторным районам генов eNOS, GATA2, GATA3, соответствующие модифи цированной бисульфитом матрице (табл. 2). Продукты ПЦР были субклонированы в вектор pGEM с помощью набора pGEM Т Easy (Promega). 10 субклонов каждого продукта ПЦР были секвенированы.

Результаты и обсуждение

Анализ экспрессии GATA 2 при дифференцировке ЭСК человека в клетки эндотелия показал, что GATA 2 экспрес сируется в клетках эндотелия из ЭСК на том же уровне, что и в HUVEC, и не экспрессируется в недифференцированных ЭСК человека (рис. 1). На сегодняшний день механизмы, участвующие в регуляции экспрессии транскрипционного фактора GATA2, остаются еще мало изученными. Однако, известно, что на ранней стадии эмбрионального развития происходят кардинальные изменения эпигенетического ста туса генома [17]. В то же время нами было показано, что некоторые гены экспрессируются в дифференцирующихся ЭСК человека вне зависимости от статуса метилирования промоторных районов [16]. Считается, что экспрессия транскрипционного фактора GATA2 характерна для раннего гемангиобласта [18]. До настоящего времени не известен возможный вклад эпигенетического состояния промоторно го района GATA2 в процессы регуляции дифференцировки ЭСК человека. Поэтому мы решили проанализировать пат терн метилирования промоторного района GATA2 в ЭСК человека, не экспрессирующих GATA2 и в клетках эндоте лия, полученных из ЭСК человека, и в HUVEC, экспресси рующих GATA 2. Для этого в изучение были взяты недиффе ренцированные ЭСК человека и чистая популяция клеток эндотелия, полученная из ЭСК человека с помощью иммуно магнитной сепарации (рис. 2). В качестве контроля исполь зовали человеческие эндотелиальные клетки из пупочной вены (HUVEC) третьего четвертого пассажей.

Как и другие GATA гены, GATA 2 гены млекопитающих экспрессируются с двух альтернативных промоторов селек тивного и главного. Селективный промотор активен в гемо поэтических клетках, а главный во всех остальных типах тканей, где экспрессируется GATA 2. Селективный промо тор расположен примерно на 5 т.п.н. ближе к 5' концу гена GATA2 [9]. Было решено проанализировать особенно на сыщенную CpG динуклеотидами область, соответствующую селективному промотору гена GATA 2, экспрессия с кото рого осуществляется в гемопоэтических клетках. Для ана лиза статуса метилирования было выбрано бисульфитное секвенирование, так как оно обеспечивает высокое разре шение и не требует значительного количества образца ДНК. Были выбраны праймеры на значимую цепь, на область с 43 по 187 нуклеотид относительно старта транскрипции. При бисульфитной модификации ДНК неметилированные цитозиновые основания модифицируются так, что Taq поли мераза воспринимает их как тиминовые, а метилированные цитозиновые по прежнему воспринимаются как цитозиновые основания. То есть, при полимеразной реакции с модифи цированной бисульфитом натрия матрицы ДНК, в случае метилированного цитозина Taq полимераза поставит гуанин, а против неметилированного аденин. Далее ПЦР продукты клонировались и клоны секвенировались. Для каждого типа клеток было проанализировано по 10 клонов. В недиффе ренцированных ЭСК человека уровень метилирования ока зался высоким, доля метилированных CpG динуклеотидов в одном сайте варьировала от 50% до 80% (рис. ЗА). В эндоте лиальных клетках, полученных из ЭСК человека, уровень метилирования был значительно ниже, доля метилированных CpG динуклеотидов в одном сайте метилирования варьиро вала от 10% до 30% (рис. ЗВ). В HUVEC уровень метилиро вания был несколько ниже, доля метилированных CpG ди нуклеотидов в одном сайте метилирования варьировала от О до 20% (рис. ЗС) Таким образом, в недифференцирован ных ЭСК человека, которые не экспрессируют GATA2, промоторный район транскрипционного фактора гипер метилирован, а в клетках, экспрессирующих GATA 2, он ги пометилирован. Таким образом, нами показано, что мети лирование селективного промотора GATA 2 в ЭСК человека может оказывать влияние на экспрессию этого транскрип ционного фактора. Эпигенетический контроль селективного промотора GATA 2 был недавно обнаружен в гемопоэтичес ких клетках [12]. Учитывая продемонстрированное нами гипометилирование промотора транскрипционного факто pa GATA 2, можно сделать вывод, что при эндотелиальной дифференцировке селективный промотор играет такую же важную роль, как при гемопоэтической.

Анализ транскрипции GATA 3 выявил низкий уровень экспрессии гена в недифференцированных ЭСК человека и высокий уровень экспрессии в клетках эндотелия из ЭСК и в HUVEC (см. рис. 1). Аналогичные данные были получены в ра боте S. Levenberg и соавторов [11]. Как и в случае GATA 2, у GATA3 обнаружено два промотора. Альтернативный про мотор находится на расстоянии примерно 10 т.п.н. от основ ного промотора [19]. Экспрессия с альтернативного промо тора обнаруживалась только в тканях головного мозга, в остальных тканях экспрессии с этого промотора не детек тировалось. Поэтому для изучения возможной эпигенети ческой регуляции гена GATA3 нами была выбрана область основного промотора гена. Для получения фрагмента регу ляторного района гена использовали праймеры на значимую цепь с 228 по 115 нуклеотид относительно старта транс крипции. В недифференцированных ЭСК человека исследу емая область была гиперметилирована, и уровень варьиро вал от 60% до 90% метилированных CpG динуклеотидов (рис. 4А). В эндотелии, полученном из ЭСК человека, уровень метилирования был низкий от 10% до 30% метили рованных CpG (рис. 4В). В HUVEC наблюдался схожий уро вень метилирования от 10% до 20% метилированных CpG (рис. 4С). Таким образом, полученные нами данные говорят о том, что даже в случае гиперметилирования основного промотора гена GATA 3 наблюдается экспрессия гена в недифференцированных ЭСК человека. Из этого следует, что наблюдаемый уровень метилирования основного про мотора в недифференцированных ЭСК недостаточен для полного ингибирования экспрессии GATA3 и указывает на существование двух возможных механизмов поддержания экспрессии гена. Во первых, для некоторых промоторов ингибирование, опосредованное метилированием ДНК, эф фективно лишь в контексте хроматина. Для пассивного де метилирования требуется, чтобы клетка прошла некоторое количество делений без участия поддерживающих ДНК ме тилтрансфераз. Модификация хроматина осуществляется активно и происходит раньше, чем пассивное деметилиро вание. Вероятно, когда еще не произошло полного демети лирования промоторной области, а хроматин уже приобрел «открытое» состояние, возможна посадка транскрипцион ных факторов, не чувствительных к метилированию ДНК, и активация транскрипции. Вторым возможным вариантом является работа альтернативного промотора гена GATA 3 в ЭСК человека. В рамках настоящей работы альтернатив ный промотор не исследовался. Тем не менее, опираясь на полученные нами данные по существенному увеличению экс прессии GATA3 в дифференцированных клетках эндотелия, мы можем утверждать, что гипометилирование промотора гена по мере дифференцировки ЭСК человека в клетки эндоте лия оказывает положительное влияние на транскрипцию гена GATA 3.

В трансгенных мышах репортерная конструкция с промо тором гена eNOS экспрессируется только в эндотелии, тогда как эписомная репортерная конструкция, содержащая про мотор eNOS, экспрессировалась и в клетках, которые в нор ме не содержат РНК eNOS [15. 20]. Это дало возможность предположить эпигенетическую регуляцию экспрессии гена. Данная гипотеза была подтверждена Y. Chan с соавт. (15]. Ими было показано, что промоторная область гена eNOS в эндотелиальных клетках гипометилирована, тогда как в клетках других типов гиперметилирована. In vitro метилиро вание эписомной репортерной конструкции с промотором eNOS также приводило к существенному понижению эксп рессии. Метилирование регуляторного района защищает промоторную область от посадки конститутивных транскрип ционных факторов, блокируя экспрессию eNOS в клетках не эндотелиальной природы. В дальнейших исследованиях этой группы было продемонстрировано, что эпигенетическая ре гуляция экспрессии осуществляется не только на уровне метилирования ДНК, но и модификации хроматина (21 ]. Мы решили изучить роль метилирования в регуляции экспрес сии гена eNOS при дифференцировке ЭСК человека в клетки эндотелия. По результатам ОТ ПЦР ген eNOS экспрессиру ется в клетках эндотелия, полученных из ЭСК, и в HUVEC и не экспрессируется в недифференцированных ЭСК чело века (см. рис. 1). По данным Y. Chan с соавт. (15], наиболее существенным эпигенетическим модификациям в эндоте лиальных клетках подвергается регуляторный район гена eNOS в ближайшем к старту транскрипции районе, поэтому для бисульфитного секвенирования нами были использова ны парапраймеры на значимую цепь на область с 13 по 297 нуклеотид относительно старта транскрипции. Для каждого типа клеток было проанализировано по 10 клонов. Уровень метилирования выбранной области в недифференцирован ных ЭСК человека был высоким и доля метилированных CpG динуклеотидов в каждом сайте метилирования варьиро вала от 70% до 90% (рис. 5А). В эндотелиальных клетках, полученных из ЭСК человека, наблюдался низкий уровень метилирования, доля метилированных CpG динуклеотидов в каждом сайте метилирования варьировала от 10% до 30% CpG динуклеотидов (рис. 5В). В клетках HUVEC метилиро вание CpG динуклеотидов не превышало 10% (рис. 5С). Исследуемая регуляторная область гена eNOS содержит сайты связывания конститутивных транскрипционных фак торов Sp1, Sp3, Ets 1 [13], которые активны и в клетках эмбриона [23]. Гиперметилирование этого участка в ЭСК человека, скорее всего, блокирует связывание этих факто ров с промоторной областью гена, как было показано для гладкомышечных клеток стенки сосудов [15]. Известно, что транскрипционный фактор GATA 2 участвует в регуляции экспрессии гена eNOS [7]. В соответствии с нашими дан ными, по мере дифференцировки ЭСК в клетки эндотелия наблюдается одновременное гипометилирование регуля торных районов генов GATA 2 и eNOS. Таким образом, про исходит двойной негативный контроль экспрессии eNOS в недифференцированных клетках ЭСК человека, метилирова ние блокирует не только промоторный район самого гена, но и промоторный район транскрипционного фактора GATA2, контролирующего экспрессию гена eNOS. С другой стороны, не исключено, что это может быть следствием тотального ги перметилирования генома на ранних этапах эбрионального развития [17].

Из наших данных следует, что уровень метилирования промоторных районов сильно отличается в недифференци рованных ЭСК и клетках эндотелия. Однако, наблюдается разница в уровне метилирования, хоть и менее существенная, между клетками эндотелия из ЭСК и HUVEC. Объяснение данного факта, возможно, заключается в том, что клетки эндотелия из ЭСК были получены in vitro, и, несмотря на то, что по экспрессии основных эндотелиальных маркеров и по образованию сосудоподобных структур соответствуют клеткам эндотелия, они проявляют незначительные отличия на эпи генетическом уровне. Вклад в эти отличия может вносить и гетерогенность самой эндотелиальной культуры, посколь ку не ясно, к какому типу эндотелия относятся полученные клетки. Возможно, они представляют собой смесь специа лизированных эндотелиальных клеток. Это предположение подтверждается данными Y. Chan с соавт. [15], которыми показана разница в уровне метилирования регуляторной области гена eNOS в HUVEC и в HuDerMVEC (human dermal microvascular endothelial cells) в то время как уровень эксп рессии гена eNOS в обеих культурах клеток сходен.

Со стадии бластоцисты в клетках внутренней массы идет тотальное de novo метилирование генома. Однако, парал лельно с de novo метилированием во время тканеспецифи ческой дифференцировки идет процесс активации экспрес сии тканеспецифичных генов. Мы использовали лишь одну из имеющихся линий ЭСК человека ESM03 с генотипом XX. В недавно опубликованной работе [24] показано глобальное гипометилирование генома в XX линиях ЭСК мыши. Ранее нами была также показана эпигенетическая гетерогенность между линиями ЭСК человека [16]. Поэтому в свете этих данных требуются дополнительные эксперименты на лини ях ЭСК с генотипом XY для определения зависимости полу ченных данных от половой детерминации клеточных линий.

Работа была выполнена при поддержке РФФИ 05 04 49310а и ФЦП «Исследования и разработки по приоритет ным направлениям развития научно технологического ком плекса России на 2007 2012 годы» ГК № 02.512.11.2060.

Подняться вверх сайта