Поиск Кабинет

Доставка рекомбинантного аденовируса с клонированным геном GDNF в область травмы спинного мозга при помощи клеток крови пуповины человека стимулирует восстановление двигательной функции и поддерживает популяцию глиальных клеток

Гены & Клетки: Том VIII, №3, 2013 год, стр: 129-132

 

Авторы

Мухамедшина Я.О., Шаймарданова Г.Ф., Салафутдинов И.И., Ризванов А.А., Повышева Т.В., Масгутова Г.А., Нигметзянова М.В., Челышев Ю.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

На модели контузионной травмы спинного мозга крысы на уровне Тh8 изучено влияние доставки в область повреж дения гена глиального нейротрофического фактора при по мощи трансдуцированных аденовирусом мононуклеарных клеток крови пуповины человека на восстановление дви гательной функции и поддержание популяции глиальных клеток. Полученные результаты свидетельствуют о том, что предлагаемый метод генно-клеточной терапии позво ляет эффективно стимулировать посттравматическую ре генерацию спинного мозга, что проявляется в виде улуч шения показателей восстановления двигательной функции, увеличения количества реактивных астроцитов и предше ственников олигодендроцитов.

Доставка генов нейротрофических факторов при помощи вирусных векторов является перспективным методом для направленной терапии при патологии ЦНС. Одним из наиболее исследованных и безопас ных с точки зрения неконтролируемой дифференцировки трансплантированных клеток и онкогенности является аденовирус[1]. Показано, что локальная доставка в область травмы спинного мозга гена гли ального нейротрофического фактора (GDNF) при по мощи аденовирусного вектора предотвращает ретро градную атрофию кортикоспинальных мотонейронов и стимулирует восстановление двигательной функции[2]. Однако доставка того же рекомбинантного аденовируса в комбинации с L-аргинином при трав матическом повреждении мозга не восстанавливает функциональный дефицит, но уменьшает область повреждения[3]. Выбранный в качестве терапевтического гена gdnf является мощным фактором поддержания жизнеспособности нейронов, стимулирует рост аксонов, их миелинизацию, уменьшает апоптоз и дегенерацию ткани[4, 5]. Именно поэтому с данным нейротрофическим фактором связывают перспективы лечения неврологических расстройств. Однако инъекция трансгена при помощи вирусных векторов позволяет трансдуцировать клетки, локализация которых ограничена достаточно узкой областью введения. Между тем, при травме спинного мозга в патологический процесс вовлекается обширная область, прилегающая к эпицентру травмы. Поэтому для наиболее полного проявления терапевтического действия вводимого гена необходимо обеспечить его экспрессию не только в эпицентре травматического повреждения, но и в прилегающих областях, как правило, достаточно удалённых от этой зоны. Для решения этой задачи наиболее перспективным подходом представляется доставка терапевтических генов на клеточных носителях. С этой целью интенсивно исследуют клетки крови пуповины, обладающие низкой иммуногенностью, способностью сдерживать воспалительную реакцию, оказывать нейротрофическое действие и стимулировать неоваскуляризацию[6, 7]. Данное исследование посвящено оценке эффективности клеточно-опосредованной доставки гена gdnf при помощи аденовирусных векторов на восстановление двигательной функции и поддержание популяции глиальных клеток.

Материал и методы

Эксперименты проведены на 32 белых лабора торных крысах, самках и самцах, весом 200–250 г. Содержание и использование лабораторных живот ных соответствовало правилам, принятым в Казан ском государственном медицинском университете и одобренным Этическим комитетом. Животных со держали в стандартных условиях со свободным до ступом к воде и корму. Крыс наркотизировали путём внутрибрюшинной инъекции хлоралгидрата (Sigma) (80 мг/мл, 0,4 мл на 100 г). Всем животным про водили ламинэктомию на уровне Th8, после чего наносили дозированную контузионную травму спин ного мозга металлическим стержнем весом 10 г строго на центр визуализируемого участка с высоты 25 мм[8]. Получение рекомбинантного аденовируса с клонированным геном gdnf было описано нами ранее[9]. Сразу после нанесения травмы животным экспериментальной группы (МККП+AdV-GDNF) вводили мононуклеарные клетки крови пуповины человека, трансдуцированные аденовирусом AdVGDNF по 1 млн. в 5 мкл DPBS (БиолоT, Россия) в 2 точки на расстоянии 1 мм ростральнее и каудальнее эпицентра травмы и 0,5 мм латеральнее сре динной линии при помощи гамильтоновского шприца (Sigma, США). Животным первой контрольной груп пы (МККП+AdV-EGFP) в аналогичных условиях экс перимента вводили те же клетки, трансфицирован ные аденовирусным вектором с геном усиленного зелёного флyоресцирующего белка (EGFP). Крысам с контузионной травмой спинного мозга второй контрольной группы трансплантацию клеток не про изводили. В течение 7 сут. после операции всем экспериментальным животным внутримышечно вводили ентамицин (5 мг/кг) один раз в сутки.

Для оценки восстановления двигательной функ ции использовали поведенческий тест ВВВ[10]. На седьмые сутки после контузионной травмы спинного мозга крыс исследовали через сутки в одно и то же время, располагая в центре открытого поля и регистрируя в баллах параметры произвольных движе ний с участием двух независимых исследователей. Через 30 сут. после нанесения травмы животных наркотизировали и транскардиально перфузировали 4% раствором параформальдегида (4°С). Фрагмент спинного мозга длиной 5 см (по 2,5 см в ростраль ном и каудальном направлении от эпицентра по вреждения) забирали вместе с позвонками. Через 12 ч от начала фиксации выделяли спинной мозг и разделяли его на 5 равных частей.

Иммунофлуоресцентное окрашивание проводи ли на поперечных срезах спинного мозга толщиной 20 мкм, полученных на микротом-криостате НМ560 Cryo-Star (Carl Zeiss, Германия). Для идентификации антигена срезы инкубировали с первичными антите лами к α-рецептору тромбоцитарного фактора роста (α-PDGFR, SantaCruze, 1:150) и глиальному фибрил лярному кислому белку (GFAP, SantaCruze, 1:200) в течение ночи при 4°C, промывали в фосфатно солевом буфере, и затем инкубировали с вторичны ми антителами, конъюгированными с флуоресцент ными красителями anti-mouse Alexa 647 (Invitrogen, 1:200) и anti-rabbit Alexa 647 (Invitrogen, 1:200) в течение 2 ч при комнатной температуре. Для визуа лизации ядер клеток срезы дополнительно окраши вали в течение 10 мин при комнатной температуре раствором 4’,6-диамидино-2-фенилиндола (краси тель DAPI, 10 мкг/мл в ФС буфере, Sigma, США).

Окрашенные срезы заключали в среду, поддерживаю щую флуоресценцию, изучение и оцифровку изобра жений проводили при помощи конфокального скани рующего микроскопа LSM 510-Meta (Carl Zeiss). Количество α-PDGFR+-клеток подсчитывали на оцифрованных изображениях в 4 фиксированных зо нах серого и белого вещества на площади 0,05 мм2: вентро-медиальная область вентральных канатиков (VF), вентральные рога (VH), кортикоспинальный тракт в дорсальных канатиках (CST), центральный канал (CC). Анализ количества GFAP+-клеток про водили в аналогичных условиях в следующих зонах: вентро-медиальная часть переднего канатика и ла теральная часть бокового канатика справа и слева. Результаты морфометрии обрабатывали с использо ванием дисперсионного анализа ANOVA.

Результаты

К 30 сут. показатель восстановления двигатель ной функции при трансплантации в область повреж дения спинного мозга МКПК человека, трансдуциро ванных аденовирусом AdV-GDNF, возрастал на 58% при сравнении с соответствующим показателем у животных 1 контрольной группы c введением тех же клеток, трансдуцированных аденовирусом AdV-EGFP. На сроке 9, 11 и 13 сут. показатель ВВВ в экспе риментальной группе по сравнению с 1 контрольной достоверно возрастал, соответственно на 62,7%, 59,5% и 53,5% (рис. 1).

К 30 сут. после контузионной травмы спинного мозга крысы в экспериментальной и контрольных группах в белом и сером веществе были обнаруже ны GFAP+-астроциты. В группе МККП+AdV-GDNF в зонах подсчёта на расстоянии 0,5 см от эпицен тра травмы в каудальном направлении популяция GFAP+-клеток в 2 раза превышала аналогичную в контрольной группе.

При проведении иммунофлуоресцентных реакций с антителами к α-PDGFR во всех исследуемых груп пах в белом и сером веществе выявлены α-PDGFR+ олигодендроциты. В экспериментальной и 2 контрольной группах их количество и распределение в указанных областях существенно различалось (рис. 2).

Обнаружено достоверное увеличение количества α-PDGFR+-клеток во всех фиксированных зонах бе лого и серого вещества на расстоянии 0,5 см в ро стральном направлении от эпицентра повреждения в экспериментальной группе (МККП+AdV-GDNF), по сравнению со 2 контрольной (без трансплантации клеток). При этом в области VF и CST этот показатель больше в группе МККП+AdV-GDNF по сравнению с группой без трансплантации клеток в 2,8–3 раза, а в зонах СС и VH в 2,2–2,4 раза, соответственно (рис. 3).

Обсуждение

Полученные результаты исследования свидетель ствуют о том, что заявляемый способ клеточно-опо средованной доставки терапевтического гена gdnf при помощи аденовирусных векторов в область трав мы спинного мозга позволяет эффективно стимули ровать его репаративную регенерацию, что проявля ется в виде улучшения показателей восстановления двигательной функции и увеличения количества реактивных астроцитов, а также олигодендроцитов, существенно необходимых для протекания процесса нейрорегенерации. Выявленное нами в результате проведения генно-клеточной терапии увеличение количества GFAP+-астроцитов следует рассматри вать как позитивный фактор стимулирования ней рорегенерации. Этот вывод основан на известном представлении о роли реактивных астроцитов, ко торые оказывают антиоксидантное и цитопротек торное действие на нейроны и миелинобразующие олигодендроциты, в том числе путём увеличения экспрессии мембранного транспортёра глутамата и снижения содержания этого возбуждающего нейро медиатора во внеклеточном пространстве[11]. α-PDGFR является специфическим маркёром клеток-предшественниц олигодендроцитов[12].

Наличие α-PDGFR+-клеток в области повреждения имеет большое значение для процесса регенерации, так как свидетельствует о ремиелинизации проводников[13]. В нашем эксперименте значительное увеличение количества α-PDGFR+олигодендроцитов в экспериментальной группе по сравнению с контрольной, где трансплантацию клеток не проводили, свидетельствует о стимуляции посттравматической регенерации выбранной нами генно-клеточной конструкцией.

Рассмотренный в данном исследовании метод генно-клеточной терапии травмы спинного мозга, предполагающий доставку аденовирусного вектора с геном gdnf при помощи МККП в область повреж дения, улучшает функциональные показатели и под держивает популяцию наиболее значимых для ней рорегенерации глиальных клеток.

Подняться вверх сайта