Поиск Кабинет

Доставка генов в органы с помощью невирусных систем направленного транспорта с различной гидрофобностью и с лактозной адресной группой

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 29-33

 

Авторы

Богданенко Е.В., Ибрагимова М.Я., Зиннатуллина Э.Т., Шакирова Р.И, Храмова А.Ю.,  Жданов Р.И.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В работе исследовано биораспределение липоплексов, сформированных из веществ холеним I-III, содержащих один, два или три остатка холестерина, и эукариотической 14С-ДНК и(или) репортерных генов, в органах мышей в зависимости от трех способов введения комплексов (внутрибрюшинно, в воротную вену печени или почечную артерию). Показано, что при внутрибрюшинном введении биораспределение (между селезенкой и кишечником) не зависит от липидного состава липосом, а при внутривенном и артериальном может определяться природой липида. Достигнута также эффективная трансфекция in vivo и экспрессия репортерного гена при введении липоплекса на основе лактозолипида IV и препарата дихоленим (1:1 по массе) в воротную вену печени. Гистохимически и спектрофотометрически показана экспрессия этого гена (не ниже 0,3 мкг/г ткани) в легких, печени и селезенке. Введение холестеринового фрагмента в структуру олигоэтилениминов улучшает характеристики липоплексов: создает оптимальное соотношение гидрофобность/гидрофильность, стабилизирует их, обеспечивает оптимальное значение константы мицеллообразования. Описанные липоплексы перcпективны для направленной доставки генов в органы и ткани.

Генная терапия является одним из перспективных направлений для лечения широкого спектра наследственных заболеваний и патологических состояний [1–3]. Ключевой стадией этой биомедицинской технологии является перенос терапевтического гена в соответствующие ткани и клетки с помощью вирусных или невирусных векторных систем [4–6]. Самыми эффективными системами переноса генов в целях генотерапии оказались вирусные векторы [7], характеризующиеся высокой тканеспецифичностью. Тем не менее, они обладают некоторыми ограничениями и недостатками, среди которых самыми серьезными являются иммуногенность при повторных инъекциях [8] и возможность инсерционного мутагенеза [2]. Будущие векторные системы для генного переноса, вероятно, либо будут создаваться на основе клеток, например, стволовых [9, 10], в варианте генно-клеточной терапии, либо будут сочетать в себе свойства вирусных и невирусных систем [11]. На современном этапе развития основной проблемой в технологиях генной терапии является проблема адресной доставки терапевтических генов в целевые ткани и клетки и их контролируемая эффективная экспрессия [12]. Поэтому поиск эффективных невирусных систем для направленного транспорта генов в протоколах генотерапии остается актуальной задачей.

В работе впервые исследовано биораспределение липоплексов, сформированных из веществ холеним I–III и эукариотической 14С-ДНК, в тканях экспериментальных животных (мышей) в зависимости от трех способов введения комплексов (внутрибрюшинно, в воротную вену печени и почечную артерию). Достигнута также эффективная трансфекция in vivo и экспрессия репортерного гена при введении липоплекса на основе лактозолипида IV и препарата дихоленим в воротную вену печени. Введение холестеринового фрагмента в структуру олигоэтилениминов улучшает характеристики липоплексов: создает оптимальное соотношение гидрофобность/гидрофильность, стабилизирует их, обеспечивает оптимальное значение константы мицеллообразования, и перспективно для направленной доставки генов.

Материал и методы

Все использованные в работе реагенты были химически чистые, вода очищалась системой миллиQ. Растворители перед применением перегоняли. В качестве липидов в работе использовались фосфатидилхолин (ФХ), холестериновые производные N-три(этиленпропилен)имина, искусственные сперминоподобные соединения – монохоленим I, дихоленим II, и трихоленим III [12] и гликолипид IV (лактозилированное производное дипальмитоилового эфира янтарной кислоты) [14].

Липосомы были получены по методу упаривания из обращенной фазы при ультразвуковой обработке [15]. В качестве растворителя использовали хлороформ или диэтиловый эфир. Пленку липида гидратировали стерилизованной водой или физиологическим раствором при встряхивании с последующей обработкой взвеси на ультразвуковом дезинтеграторе (4°С, 5 мин) и получали суспензию полибислойных липосом. Полибислойные липосомы для трансфекции in vivo были сформированы из смеси, содержащей ФХ (70 мол. %), дихоленим II (10 мол. %),) и лактозолипид IV (20 мол. %). Растворы исходных липидов хранили при -80°С, а липосомы – при 4°С под азотом и использовали в течение двух недель [16].

Тотальная 14С-тимидин меченая общая ДНК была получена из эукариотических клеток линии НГУК-1, выращенных на среде с 14С-тимидином (15 мкКи/мл, Изотоп, Россия) как описано ранее [17]. 14C-ДНК обрабатывали ультразвуком при частоте 22 кГц (УЗДН-2Т, Россия, 15 мин с 30 с остановкой после каждой минуты озвучивания при 0°С, 10 циклов) с образованием фрагментов 4–6 т.п.о. длиной (данные электрофореза). Радиоактивность ДНК определяли спустя 1 ч после добавления сцинтилляционной жидкости ЖС-8 к жидким пробам, находившимся в пластиковой пробирке. Репортерная плазмида рСМV-SPORTβGаl, (Bio Life Tech, Cat. No. 10586-04) – получена из лаборатории N. Duzgunes, Pacific Univercity, San Francisco (США).

Исследование эффективности генного переноса in vivo формировали нуклеолипосомные комплексы (липоплексы), смешивали радиоактивную или плазмидную ДНК с холенимами или липосомами и инкубировали смесь в течение 30 мин. Комплексы вводили мышам линии ICR массой 36–40 г возрастом 4–6 мес. внутрибрюшинно, в воротную вену печени или почечную артерию. Липоплексы вводились мышам по методикам, описанным ранее [6, 16].

Вещества холеним I-III вводились мышам в различных соотношениях с 14С-тимидин меченой ДНК, а липоплексы, состоявшие из ДНК и липосом ФХ/ лактозилированный липид IV, имели соотношение этих составляющих 1:1 (100 мкг ДНК и 100 мкг липосом; 50–100 мкг/мышь). Через сутки после введений животных забивали и извлекали у них внутренние органы, которые сначала взвешивали, а затем лизировали 0,6 N раствором КОН при 37°С. Готовые лизаты нейтрализовывали 0,6 N раствором HClO4. При использовании для генного переноса веществ холеним сцинтилляционную жидкость добавляли к жидкой нейтрализованной пробе. В случае использования лактозилированных липосом пробы наносили на фильтры, которые после просушивания и помещения во флаконы заливали сцинтилляционной жидкостью. Подсчет радиоактивности велся в счетчике «Rakbeta». Проводили пересчет содержания метки на единицу массы органа [16, 17]. Доставка плазмиды рСМV-SPORT-β-Gаl для достижения экспрессии гена β-галактозидазы в органах мышей осуществлялась липосомами, состоящими из ФХ и дихоленима (1:1 по массе), и в комплексе со смешанными липосомами состава ФХ / лактозолипид / дихоленим (100 мкг ДНК на 100 мкг липосом).

Результаты и обсуждение

Перед исследованием биораспределения невирусных систем доставки генов на основе холенимов I-III in vivo нами была оценена их активность в генном переносе на культуре клеток невриномы Гассерова узла крысы НГУК-1 с использованием стандартных методов [6].

Эффективность трансфекции клеточных культур. На рисунке представлены данные по эффективности трансфекции плазмиды pCMV-SPORT-β-Gal в клетках НГУК-1 с помощью геносом на основе препаратов моно-, ди- и трихоленим I-III при различных соотношениях ДНК/холеним.

Максимальный уровень экспрессии гена в этих клетках был достигнут для комплекса ДНК/монохоленим в соотношениях 2:1 или 1:1 – 32–35 пикограмм белка на 105 клеток. Для геносом ДНК/дихоленим в соотношениях 2:1 и 1:1 уровень экспрессии был 17 и 25 пг на 105 клеток соответственно. Уровень экспрессии гена β-галактозидазы в клетках НГУК-1 был существенно меньше, чем в случае c клетками РС-12 [13]. Наибольшая эффективность экспрессии – 187 и 113 пг (пикограмм)/105 клеток – была достигнута для монохоленима и дихоленима соответственно при соотношении ДНК/холеним 1:0,5. Для препарата трихоленим наибольшая эффективность генного переноса достигается при соотношении ДНК/олигокатион 1:0,3 – 56,6 пг/105 клеток, наименьшая – для вещества III при соотношении 1:1,5 (7,5 пг/105 клеток) (см. рис.). Эти результаты означают, что чем больше холестериновых остатков содержит холеним, тем меньшее его количество необходимо для достижения оптимума трансфекции. Эти данные коррелируют с физико-химическими свойствами соединений I–III.

Биораспределение 14С-тимидин меченой ДНК. В таблице представлены результаты – доля метки (% сpm) от общего счета во всех органах – изучения биораспределения [14C]-ДНК после внутрибрюшинного введения ее липоплексов с препаратами дии трихоленим (соотношение (масса) 1:1) (строки 1 и 2). ДНК во всех случаях распределялось в основном между селезенкой и кишечником. Биораспределение липоплексов [14C]-ДНК с препаратом I аналогично. Это соответствует опубликованным данным по использованию катионных липосом и других медиаторов трансфекции при этом способе введения.

При введении комплекса [14C]-ДНК (50 мкг) с веществом дихоленим II в соотношении 1:1 в почечную артерию наблюдается не более, чем двухкратное увеличение включения метки в оперированную почку по сравнению с интактной (табл.). При этом максимальное включение метки наблюдалось в сердце, на втором месте – легкие, как и при разных вариантах внутривенного введения. Это можно объяснить тем, что капиллярная сеть почки негустая, а кровоток в них очень быстрый, так что кровь быстро попадает в венозную систему и сердце. При изменении соотношения масс между [14C]-ДНК (15 мкг) и дихоленим II на 2:1 распределение резко меняется. ДНК практически не обнаруживается в интактной почке, а также в селезенке и кишечнике. На первом месте по количеству аккумулированной [14C]-ДНК находится сердце, на втором – печень, на третьем – оперированная почка, и только на 4-м – легкие, что уже значительно отличается от распределения обычных катионных препаратов. Это подтверждает тропность вещества II к печени при определенных способах введения ее комплексов с ДНК.

Результаты изучения распределения липоплексов [14C]-ДНК с веществом II при их введении в воротную вену печени мыши также представлены в таблице (строки 5–7). Максимальное содержание [14C]-ДНК при введении комплексов ДНК/дихоленим (1:1) оказалось в четырех органах: печени, селезенке, сердце и легких, почти по 20%, в 4 раза меньшие количества – в почках и кишечнике. При изменении соотношения ДНК/дихоленим II до 2:1 максимум [14C]-ДНК обнаруживается в печени, значительно уменьшается ее содержание в легких. Данные по биораспределению липоплексов [14C]-ДНК/холеним I и [14C]-ДНК/холеним III (соотношение ДНК/холеним 1:1, доля метки (% сpm) от общего счета во всех органах) при их введении в воротную вену мышей также представлены в таблице. Для вещества I максимальное содержание [14C]-ДНК было в селезенке и сердце (25 и 20%, соответственно), затем – в печени и почках (15%). В случае вещества III максимальное содержание [14C]-ДНК обнаружено в печени (25%), почках (20%) и крови (15%).

Таким образом, при весовом соотношении ДНК/ холеним 1:1 наиболее заметно различие в тропности липоплексов между моно- и трихолестериновыми производными, а для дихоленима II характерно промежуточное распределение. Высокое содержание метки в крови для комплекса с холеним III может косвенно указывать на их сильное взаимодействие с клетками крови, а повышенное включение метки в печень, по-видимому, связано с тем, что в этом органе осуществляется утилизация разрушенных эритроцитов [18]. Изменение весового соотношения ДНК/ холеним в комплексе с 1:1 до 2:1 влияет на тропность к различным органам в тех же пределах, что и использование различных холенимов при одном и том же соотношении масс. Это объясняется тем, что вещество I при одном и том же весовом сотношении с ДНК содержит в два раза больше катионных групп, чем вещество III. Однако количественное соотношение между гидрофобной и гидрофильной составляющими меняется противоположно, что может определять изменения в картине распределения.

Экспрессия гена β-галактозидазы как результат доставки липоплексами холеним. Амфифильные липосомы, состоящие из ФХ и дихоленим (1:1 по массе), были использованы для переноса плазмиды pCMV-SPORT-β-Gal при внутривенной инъекции, при соотношении ДНК/липид 1,6:1 (по массе). Через 2 сут. после переноса гена β-Gal инкубацией срезов органов с субстратом X-Gal, который под действием этого фермента разлагается с выделением яркосинего красителя индиго, удалось обнаружить экспрессию гена в легких и селезенке мышей гистохимически. Это свидетельствует, что наши липоплексы оказались способными проникать через эндотелий сосудов этих органов. Это соответствует распределению ДНК при использовании в генном переносе катионных липосом, что описано в литературе [18].

Мы наблюдали экспрессию гена β-Gal и при переносе плазмиды рСМV-SPORT β-Gаl липосомами ФХ / дихоленим/гликолипид IV (1:1,5 по массе). Гистохимическим методом мы обнаружили экспрессию этого гена преимущественно в клетках печени, она была невысокой и наблюдалась в основном в эпителии кровеносных сосудов и непосредственно вблизи от них, что может говорить о недостаточной проницаемости сосудов для комплексов. Для более точной оценки экспрессии гена β-Gal в органах мышей после введения комплекса плазмиды с липосомами гликолипид/ ФХ/ дихоленим мы измеряли активность этого фермента спектрофотометрически. Максимум ферментативной активности наблюдался в селезенке, и был почти равным в легких и печени. Большую роль в биораспределении может играть иммуногенность липоплексов [19], в частности, их опсонизация [20].

Таким образом, вещества холеним I-III и лактозолипид IV, использованные нами для переноса радиоактивной и плазмидной ДНК в составе липосом, изменяли их тропность по сравнению с обычными катионными липосомами и могут быть рекомендованы для создания систем направленной доставки генов в ткани и органы при системном введении. Эффект «первого прохода» [18], типичный для катионных липидов, отсутствовал при введении метки в комплексе с липосомами фосфатидилхолин/лактозолипид IV, и был значительно снижен при введении комплекса ДНК с липосомами состава фосфатидилхолин/ лактозолипид IV/ дихоленим.

Выводы

1. Результаты по трансфекции in vitro с помощью веществ холеним показали, что чем больше холестериновых остатков содержит вещество, тем меньшее его количество необходимо для достижения оптимума трансфекции, что коррелирует с физикохимическими свойствами этих соединений.

2. Липоплексы на основе липосом ФХ/дихоленим распределялись в основном между легкими и печенью; введение в их состав лактозолипида приводило к максимуму накопления [14C]-ДНК в почках и печени и к экспрессии гена β-Gal в селезенке, печени и легких.

3. При введении в воротную вену печени с увеличением содержания холестериновых остатков и соотношения гидрофобность/гидрофильность в ряду от монохоленима к трихолениму уменьшается содержание [14С]-ДНК в селезенке и сердце, возрастает содержание в крови, печени и почках (в кишечнике и легких не меняется).

4. При трансфекции in vivo гена β-Gal в составе геносом на основе препарата дихоленим при введении в воротную вену печени количественно определена экспрессия гена β-Gal (не ниже 0,3 мкг/г ткани) в легких, печени и селезенке.

5. Изучены биораспределение [14С]-ДНК и трансфекция in vivo гена β-Gal в составе липоплекса на основе лактозолипида IV при введении в воротную вену печени. Гистохимически и спектрофотометрически обнаружена экспрессия этого гена. Максимум содержания метки наблюдается в почках и печени, а не в легких, что говорит о тропности лактозолипида к тканям этих органов.

Подняться вверх сайта