Поиск Кабинет

ДНК-повреждения в мультипотентных мезенхимных стромальных клетках человека при разных сроках культивирования

Гены & Клетки: Том VI, №4, 2011 год, стр.: 39-41

 

Авторы

Чаушева А.И., Никитина В.А., Жанатаев А.К., Дурнев А.Д., Бочков Н.П.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Методом ДНК-комет проведена оценка уровней ДНКповреждений и 8-оксигуанина в ДНК мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) на разных пассажах. Проанализированы двадцать восемь культур ММСК костного мозга здоровых доноров. Уровень ДНКповреждений в ММСК, оцениваемый по показателю %ДНК в хвосте комет статистически значимо не менялся в процессе культивирования (3,9±0,4% на 3–4 пассажах и 3,8±0,6 % на 10–12 пассажах). Не выявлено значимых различий в содержании 8-оксигуанина в ДНК клеток на разных сроках культивирования (1,9±0,24 о.e 3–4 пассажах и 2,1±0,22 о.e на 10–12 пассажах). В двух культурах ММСК наблюдался повышенный уровень ДНК-повреждений и апоптотических ДНК-комет.

Клеточная терапия мультипотентными мезенхимными стромальными клетками (ММСК) – перспективный метод лечения различных заболеваний. Простые процедуры выделения и культивирования, возможность введения непосредственно в кровоток, отсутствие существенной иммуногенности позволяют использовать ММСК в клинических испытаниях при лечении несовершенного остеогенеза [1], метахроматической лейкодистрофии [2, 3], синдрома Гурлера [2], болезни «трансплантат против хозяина» [4], сердечно-сосудистых заболеваний [5].

В силу методических особенностей ММСК до терапевтического использования нуждаются в культивировании, что может приводить к возникновению генетически аберрантных клеток [6], их позитивной селекции в популяции и контаминации ими материала для трансплантации. Последствия применения генетически измененных клеток в организме непредсказуемы, что определяет необходимость проведения оценки генетической стабильности ММСК перед их трансплантацией. ДНК-повреждения лежат в основе возникновения хромосомных аномалий, мутаций в генах, контролирующих процессы клеточной пролиферации, дифференцировки и гибели, ведущих к генетической нестабильности клеток.

Цель настоящей работы – сравнительная оценка уровней ДНК-повреждений в ММСК на разных сроках культивирования.

Материал и методы

Для исследований использовали культуры ММСК, выделенные из костного мозга здоровых доноров, по методу, предложенному А.Я. Фриденштейном с соавт. [7]. Во всех случаях получено письменное информированное согласие на использование образцов для научных целей.

Культуры ММСК дважды отмывали от культуральной среды охлажденным фосфатно-солевым буфером и снимали со дна флакона с помощью силиконового скребка. Клетки переносили в пробирки и центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин. Супернатант удаляли, осадок разводили в буфере до концентрации клеток 1–5×105/мл и помещали до использования в холодильник при температуре 4°С. К ранним пассажам относили культуры прошедшие 3–4 пассажа культивирования, к поздним – 10–12. Метод ДНК-комет в щелочной версии проводили в соответствии с рекомендациями [8]. Микропрепараты окрашивали флюоресцирующим красителем SYBR Green I. Микроскопирование проводили на эпифлуоресцентном микроскопе AxioImager A1 (Zeiss, Германия) при увеличении ×200. Полученные изображения ДНК-комет анализировали с использованием программного обеспечения «СASP 1.2.2» [9]. В качестве показателя поврежденности ДНК использовали процентное содержание ДНК в хвосте (%ДНК в хвосте). С каждого микропрепарата анализировали не менее 100 клеток. ДНКкометы характерной формы с содержанием ДНК в хвосте более 70% рассматривались как апоптотические и подсчитывались отдельно.

Для оценки содержания 8-оксигуанина в ДНК клеток использовали набор «Human 8-oxoGuanine DNA Glycosylase (OGG1) FLARE Assay» (R&D Systems Inc., USA), а также FLARE (Fragment Length Analysis using Repair Enzymes), который является модификацией метода ДНК-комет и основан на регистрации уровней одно- и двухнитевых разрывов ДНК индивидуальных клеток после обработки hOGG1 – ферментом эксцизионной репарации 8-оксигуанина. Приготовление препаратов для анализа проводили в соответствии с инструкцией производителя. Уровень 8-оксигуанина выражали в относительных единицах (о.е.), определяемых как отношение показателя %ДНК в хвосте для ДНК клеток, обработанных hOGG1 к показателю для клеток, обработанных буфером для фермента.

Полученные результаты обрабатывались с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Исследовано 28 культур ММСК на разных пассажах. Уровень ДНК-повреждений в ММСК на ранних пассажах (табл. 1) составил в среднем 3,9±0,4% ДНК в хвосте. На поздних пассажах аналогичные значения составили 3,8±0,6% (табл. 2). Статистическое сравнение уровней ДНК-повреждений на ранних и поздних пассажах не выявило статистически значимых различий (p > 0,05).

Метод ДНК-комет в щелочной версии фиксирует различные виды повреждений ДНК: одноцепочечные, двухцепочечные разрывы, апуриновыеапиримидиновые сайты (АП-сайты), разрывы, возникающие в процессах репликации и репарации в делящейся клетке. Взаимосвязь между уровнем ДНК-повреждений и активностью ферментов системы репарации определяет спонтанный уровень ДНКповреждений в клетке, который может меняться еще и в зависимости от стадии деления клетки, воздействия внешних и внутренних повреждающих факторов. В работах, проведенных на лейкоцитах периферической крови и клетках костного мозга здоровых доноров, спонтанный уровень ДНК-повреждений так же как, в нашем исследовании, варьировал от 0 до 8–9% [10–12].

Одним из типов ДНК-повреждений является окислительная модификация азотистых оснований ДНК. Известно, что в этиологии рака важную роль играет окислительное повреждение ДНК, инициирующее возникновение соматических мутаций. В настоящем исследовании оценивали уровень продукта окислительного повреждения гуанина – 8-оксигуанина в культурах ММСК. На 3–4 пассажах уровень 8-оксигуанина составил 1,9±0,24 o.е. и 2,1±0,22 о.е. на 10–12 пассажах. При этом показатель варьировал от 1,1 о.е. до 3,1 о.е. на ранних пассажах и от 1,5 о.е до 2,6 о.е на поздних пассажах. Статистическое сравнение уровней 8-оксигуанина на ранних и поздних пассажах не выявило различий (p > 0,05). Аналогичный показатель, полученный при исследовании лимфоцитов периферической крови здоровых людей среднего возраста, варьировал 0,5 до 2,0 o.e.[13].

Повышение клеточной выживаемости и подавление апоптоза является одним из патогенетических механизмов опухолевой трансформации клетки. Параллельно с оценкой ДНК-повреждений и определения уровня 8-оксигаунина, в исследовании оценивали уровень апоптотических ДНК-комет в культурах ММСК на ранних и поздних этапах культивирования. По результатам наших исследований, частота апоптотических ДНК-комет в разных культурах ММСК составила в среднем 2,1±0,4% на 3–4 пассажах и 2,5±0,6% на 10–12 пассажах. Частота апоптотических комет не менялась в процессе культивирования ММСК (p > 0,05). Вместе с тем, сравнение с данными литературы показывает, что частота апоптотических ДНК-комет в ММСК выше, чем в соматических клетках человека [13].

В двух культурах ММСК (см. табл. 2) наблюдался повышенный уровень ДНК-повреждений (16,5% и 9,1% ДНК в хвосте комет). Частота апоптотических ДНК-комет в этих культурах также была высокая (18,3% и 10,2% соответственно). Условия культивирования всех клеточных культур ММСК костного мозга были стандартными. В рамках настоящего исследования сложно объяснить высокий уровень ДНК-повреждений и апоптотических ДНК-комет именно в этих культурах. Вероятно, в процессе культивирования ММСК возникают клоны аберрантных клеток, имеющих селективное преимущество в размножении [6], либо подобные изменения связаны не с условиями культивирования, а с индивидуальными характеристиками донора клеток. Истинная причина генетической нестабильности в данных культурах ММСК пока не ясна. Значения этих двух культур были исключены из анализа подсчета среднего.

Таким образом, результаты настоящего исследования показывают, что при длительном культивировании ММСК, в некоторых культурах наблюдается повышенный уровень ДНК-повреждений. Безусловно, это является серьезным препятствием для применения таких культур в целях клеточной трансплантации из-за возможных побочных эффектов. Однако в большинстве культур ММСК уровень ДНК повреждений и 8-оксигуанина не менялись в процессе культивирования. Повышенный уровень апоптотических клеток в культурах ММСК ранних и поздних пассажей, по сравнению с таковым в лимфоцитах периферической крови, возможно, указывает на процесс элиминации клеток с ДНК-повреждениями, возникающими в процессе культивирования.

Оценка ДНК-повреждений в ММСК может служить важным критерием при оценке генетической стабильности для обеспечения безопасности клеточной трансплантации.

Подняться вверх сайта