Поиск Кабинет

Дисферлинопатии: возможности диагностики, моделирования и генно-клеточной терапии

Гены & Клетки: Том VIII, №4, 2013 год, стр.: 61-70

 

Авторы

Старостина И.Г., Соловьева В.В., Юрьева К.С., Шевченко К.Г., Федотов В.П. , Ризванов А.А., Деев Р.В., Исаев А.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Дисферлинопатии – группа нервно-мышечных бо лезней аутосомно-рецессивного типа наследования, при которых происходит нарушение экспрессии мРНК и (или) функции белка дисферлина в скелетной мышечной ткани, что обусловлено мутациями в гене DYSF (англ. dystrophy-associated fer-1-like). Частота заболевания 1:200 000 новорожденных. К дисферлинопатиям относят такие типы заболеваний, как миопатия Миоши (ММ), с первичным поражением дистальных сегментов нижних конечностей, поясно-конечностная мышечная дистрофия типа 2В (ПКМД 2В), в основном с поражением прокси мальных сегментов конечностей, дистальная миопатия с первичным поражением передней группы мышц голе ни, а также вторичные дисферлинопатии, возникающие при кавеолино- и кальпаинопатиях. В настоящем обзоре рассмотрены, структура белка дисферлина, его функции, а также клинические фенотипы, известные эксперимен тальные модели и стратегические подходы к терапии дисферлинопатий.

Введение

Поясно-конечностные мышечные дистрофии (ПКМД) – обширная группа наследственных мышеч ных заболеваний, характеризующихся выраженным клиническим полиморфизмом и значительной ге нетической гетерогенностью. К настоящему време ни описано более 40 локусов ПКМД, для 37 из них идентифицированы гены, мутации в которых ответ ственны за развитие мышечных дистрофий. Клини ческая картина ПКМД характеризуется прогрессиру ющей слабостью и атрофией мышц конечностей и туловища, приводящих к параличам и инвалидности.

Дебют заболеваний приходится преимущественно на молодой и реже детский возраст, что обусловливает их высокую медико-социальную значимость. История первых описаний ПКМД восходит к се редине XIX столетия, когда усилиями клиницистов неврологов и патоморфологов были приведены и выделены в отдельные нозологические формы се мейные наблюдения больных с развитием мышеч ных атрофий и параличей, получивших имена авто ров их описавших (детская псевдогипертрофическая форма Дюшена, юношеская форма Эрба, лицеплече-лопаточная форма Ландузи – Дежерина). В ХХ столетии было продолжено описание новых форм миопатий, что неизбежно привело к необходимости создания классификации, отражающей современные представления о данной группе заболеваний. Классификация основана как на особенностях клинической картины ПКМД (возраст дебюта, локализация мышечных атрофий, темп прогрессирования), так и генетических, а теперь и молекулярногенетических данных.

В 1995 г. по результатам встречи международ ного консорциума по изучению LGMD – Limb-Girdle Muscular Dystrophy (ПКМД) в Наардене (Голлан дия) была принята международная номенклатура наименования ПКМД на основе типа наследования, хронологического порядка описания заболевания и локуса каузативного гена (табл. 1). В случае ауто сомно-доминантного типа наследования присваива ется «1» (LGMD1), а при аутосомно-рецессивном наследовании – тип «2» (LGMD2). Последующие за цифрой латинские буквы кодируют локус гена, му тации которого приводят к ПКМД данного типа. Так заболевание, связанное с дефицитом кальпаина-3, картированного в локусе 15q15, обозначено ПКМД тип 2А, другой локус для гена дисферлина (2p13) получил обозначение ПКМД 2В.

Классические описания ПКМД представлены развитием мышечных атрофий и парезов в первую очередь и преимущественно проксимальных сег ментов конечностей (плечевого и тазового поясов). Первое описание дистальной формы миопатии, раз вивающейся после 40-летнего возраста с поражени ем мышц кистей и предплечий в дебюте, с аутосом но-доминантным типом наследования (локус 2р13) принадлежит Welander (1951).

Японским исследователем К. Миоши с соавто рами в 1967 году впервые была описана дисталь ная миопатия с рецессивной формой наследования у четырех больных из двух кровнородственных се мей, со значительно повышенным уровнем креа тинкиназы в сыворотке крови, которая в последую щем получила название «миопатия Миоши»[1, 2]. Клинические проявления миопатии Миоши имеют сходство с ПКМД 2В. Локус ПКМД 2В был впервые картирован в семьях больных с преимущественно проксимальной мышечной дистрофией, начинающей ся в позднем подростковом возрасте (в 15–25 лет), которые в детстве имели нормальную подвижность. Дебют мышечной слабости и атрофии приходится на мышцы тазового пояса (ягодичные, бедренные), в то время как мышцы голени и плечевого пояса с медленным прогрессированием поражаются позднее и менее выражено. У небольшого количе ства больных на ранних стадиях заболевания за регистрирована гипертрофия икроножной мышцы, как переходный синдром к атрофии. Также на ран них стадиях для этой формы редкими были кон трактуры[3].

Молекулярно-генетические методы в конце ХХ столетия позволили подтвердить или отвер гнуть нозологическую самостоятельность многих из описанных форм ПКМД. В 1994 г. группой I. Richard впервые был выявлен ген, мутации в ко тором связаны с развитием ПКМД. Им стал ген CAPN3, кодирующий белок кальпаин, недостаточ ность которого приводит к формированию ПКМД 2А[4]. Дальнейшие исследования показали вовлечение и других генов в патогенез ПКМД раз личных типов.

В 1995 г. при изучении 12 семей, пять из кото рых были кровнородственными, K. Bejaoui с соавто рами картировал ген миопатии Миоши в сегменте 2p14–p12[5]. В 1996 г. Т. Weiler с соавторами отметили в больших семьях канадских индейцев из племени Манитоба наличие у одних больных кли нических признаков миопатии Миоши, а у других поясно-конечностной мышечной дистрофии[6]. Ранее I. Mahjneh с соавторами зарегистрировали подобные феномены в нескольких семьях Пале стинских арабов[7]. Внутрисемейный клинический полиморфизм был отмечен в большой 6-поколен ной аварской семье из Дагестана, исследованной группой С.Н. Иллариошкина в 1996 г., в которой из 12 пациентов у 3 были проявления миопатии Миоши, а у 7 ПКМД тип 2В. Ген аутосомно-рецес сивной ПКМД, выявленной в данной семье был картирован в локусе хромосомы 2р13. В последу ющем ДНК анализе у всех больных в этой семье была обнаружена одна и та же мутация в гене DYSF, с заменой p.Val67Asp, что свидетельствует о еди ной молекулярно-генетической природе миопатии Миоши и ПКМД тип 2В[8].

В 1998 году при исследовании локуса MM/ПКМД 2В сегмента 2p13, две независимые лаборатории клонировали ген дисферлина и показали, что ММ и ПКМД 2В вызваны дефектом в одном и том же гене DYSF[9, 10].

K. Bushby с соавторами в 1998 г. предложила объединяющий термин «дисферлинопатии» для ми опатии Миоши (ММ) и ПКМД 2В, которые опре деляются как аллельные состояния, обусловленные мутациями в гене дисферлина (DYSF)[11]. В на стоящее время термин характеризует различные клинические фенотипы, связанные с нарушением экспрессии гена и функции белка дисферлина.

Клиническая характеристика дисферлинопатии

Для дистальной миопатии Миоши характерен аутосомно-рецессивный тип наследования и мед ленная прогрессия мышечной слабости и атрофии, распространяющихся первоначально на икроножную мышцу, начиная с позднего подросткового, реже с детского возраста. На ранней стадии заболевания повышаются уровни «мышечных ферментов», таких как креатинкиназа, альдолаза и др. С течением вре мени мышечная слабость может распространяться на дистальные мышцы таза и верхних конечностей (избирательное поражение бицепса плеча)[12–14]. Характерной клинической картиной миопатии Мио ши является уменьшение икроножных мышц в объ еме и их атрофия.

Ферлин-1-подобные белки

Дисферлин относится к семейству ферлин-1 по добных белков, которое включает в себя также ото ферлин (Fer1L2)[15], миоферлин (Fer1L3)[16, 17], ферлины Fer1L4, Fer1L5 и Fer1L6. Каждый бе лок содержит несколько кальций-связывающих C2 доменов и С-концевой трансмембранный домен, отвечающий за связывания белка с мембраной. Ферлин-1-подобные белки имеют гомологию с бел ком FER-1 Caenorhabditis elegans (нематода).

Экспрессия белка FER-1 у C. elegans происходит в первичных сперматоцитах, где он необходим для со зревания подвижных сперматозоидов. FER-1 белок опосредует кальций-зависимое слияние мембран нескольких внутриклеточных органоидов с плазма тической мембраной сперматид во время сперма тогенеза[18]. У гомозиготных мутантов по FER-1, сперматидные мембранные органоиды не соединя ются с плазматической мембраной во время спер матогенеза, что приводит к образованию неподвиж ных сперматозоидов и бесплодию[19]. Достаточно одной аминокислотной замены в любом из трех C2 доменов FER-1 для нарушения слияние мембранных органоидов, что изменяет чувствительность этого белка к ионам Ca2+.

Белок миоферлин обладает наивысшей гомо логией к дисферлину, среди семейства ферлин-1 подобных белков. Миоферлин присутствует в сар колемме скелетных мышц, но, в отличие от дисфер лина, в большом количестве находится в ядре[17]. Миоферлин необходим при слиянии миобластов с мышечными волокнами в процессах рабдомиоги стогенеза (дифференцировки и роста поперечно-по лосатой скелетной мышечной ткани). Нокаут гена миоферлина у мышей приводит к атрофии мышц[20]. Миоферлин и дисферлин выполняют, по видимому, разные функции, о чем свидетельствует отсутствие компенсационного повышения экспрес сии миоферлина в мышцах при дисферлинопатии[21]. До сих пор не обнаружена связь миоферлина с какими-либо заболеваниями человека.

Ген отоферлина в основном экспрессируется в клетках улитки и вестибулярного отдела внутрен него уха, головного мозга, хотя низкий уровень экс прессии гена показан и для других органов, включая легкие, почки, скелетные мышцы и сердце. Мутации в гене отоферлина приводят к несиндромной глухоте у людей, известной как DFNB9 (англ. OTOF-Related Deafness, Nonsyndromic Hearing Loss)[15]. Недавние исследования показали, что отоферлин важен для последнего этапа синаптического экзоцитоза везикул и может выступать в качестве главного Ca2+-воспринимающего элемента, инициируя синаптическое везикулярно-плазматическое мембранное слияние[22].

Белки Fer1L4, Fer1L5 и Fer1L6 были обнаружены у человека и мыши, но еще не достаточно исследо ваны.

Дисферлин и его функции

Дисферлин – трансмембранный белок (230 кДа), который локализуется как на цитоплазматической, так и на мембране эндоплазматического ретикулу ма. 2080 аминокислот формируют семь С2 доме нов, два DysF домена и один мембран-связывающий С-концевой домен[23]. Функция DysF доменов на настоящий момент не известна. С2 домены облада ют способностью связывать фосфолипиды и белки Ca2+-зависимым способом, наиболее выраженной для С2А-домена. Для остальных С2 доменов пока зана роль в образовании функциональных димеров белка[24]. Белок экспрессируется в клетках раз личных тканей и органов, в том числе помимо ске летных и сердечной мышцах, в почках, плаценте и в головном мозге[10]. В центральной нервной систе ме, дисферлин может играть роль в изменении про ницаемости гематоэнцефалического барьера[25] Повышение проницаемости капилляров почечных клубочков коррелирует с дефицитом дисферлина в подоцитах[26]. Снижение содержания этого белка в синцитиотрофобласте плаценты не препятствует ее функционированию. В то же время, исследователи из института Огайо выявили пониженный уровень дисферлина в ряде тяжелых случаев преэкламп сии[27]. В мышечной ткани снижение содержания дисферлина до уровня 20% от физиологического выявлено при первичной дисферлинопатии. Кроме того, возможны вторичные дефицитные состояния, например при наследственном дефиците кальпаи на-3 и кавеолина-3[28]. Также дисферлин может участвовать в рабдомиогенезе[29]

Роль дисферлина в репарации сарколеммы и во внутриклеточной везикулярной системе Один из механизмов репарации мембраны тре бует присутствия внутриклеточных везикул[30], которые поставляют дополнительный мембранный материал для формирования «мембраного пэтча» («заплатки») через кальций-инициируемый везику лярный экзоцитоз[31, 32]. Такой способ репарации характерен для повреждений мембраны 30–50 нм[33] Исследование ультраструктурных изменений в скелетной мышце у пациентов с дисферлинопатией показало, что области под сарколеммой характери зуются множественным скоплением везикул. Также в самой сарколемме наблюдается множество об рывков и неровностей, в то время как в норме она должна быть непрерывной и гладкой[34, 35]. Была выдвинута гипотеза, что внутриклеточные везикулы изначально транспортируются в место повреждения путем последовательных действий моторных белков, в том числе кинезина и немышечного миозина IIA и IIB[36, 37], а процесс слияния везикул с мембраной опосредован другими белками. В ряде исследований показано, что внутриклеточные везикулы содержат кавеолин-3[38] и DYSF, который связан с аннекси нами A1 и A2[39].

Некоторые исследования показали, что митсугу мин 53 (mitsugumin 53, MG53) играет важную роль в облегчении транслокации везикул для мышечной репарации мембраны[40–45]. Взаимодействия между DYSF, MG53 и кавеолином-3 были показаны in vitro с помощью иммунопреципитации[40]. Таким образом, считается, что DYSF взаимодействует с MG53, аннексинами и другими белками в скоплении везикул в месте повреждения мембраны. В дополне ние к MG53, аннексинам и кавеолину-3, DYSF может также взаимодействовать с AHNAK-белком (human neuroblast differentiation-associated protein)[46], аффиксином[47], S100A10[48], кальпаином-3[49], тубулином[50] и дигидропиридиновым рецеп тором (англ. dihydropyridine receptor, DHPR)[51]. На модели иммортализованнных «миобластов» пациентов с дисферлинопатией, S. Spuler опреде лила пролонгированное время репарации мембраны после механического повреждения, по сравнению с аналогичной культурой миобластов здорового доно ра. При экспериментальном восстановлении функции дисферлина время репарации мембраны нормализо валось[52].

Роль дисферлина в развитии Т-трубочек

Недавние исследования показали, что DYSF играет активную роль в формировании Т-трубочек и взаимодействует с дигидропиридиновым рецеп тором (потенциал-зависимый кальциевый канал) в сарколемме[53, 54]. Предполагают, что дисфер лин опосредует слияние микровезикул, содержащих кавеолин-3, с Т-трубочками. В связи с тем, что не достаток DYSF вызывает ультраструктурные наруше ния в Т-трубочках скелетных мышц, была высказана гипотеза, что DYSF требуется для поддержания или развития Т-трубочек.

Роль дисферлина в высвобождении АТФ и внутриклеточной сигнализации Ca2+ В ряде исследований показано, что DYSF может быть вовлечен в высвобождение АТФ и межклеточ ную Ca2+-сигнализацию[55]. Было установлено, что DYSF опосредует Ca2+-инициируемую межклеточную сигнализацию в ответ на повреждение мембраны у эмбрионов морских ежей: нокдаун экспрессии мРНК дисферлина с использованием морфолино вых олигонуклеотидов у эмбрионов морского ежа эффективно блокирует высвобождение АТФ после повреждения мембраны и тем самым подавляет последующую межклеточную Ca2+-сигнализацию[55]. В других исследованиях было показано, что недостаток DYSF в скелетных мышцах млекопита ющих приводит к высвобождению АТФ или других эндогенных сигнальных молекул, таких как белки высокомобильной группы бокс-1 (high-mobility group box-1, HMGB1), S100 или белки теплового шока (heat-shock proteins, HSPs). Увеличение везикуляр ного трафика связывают с активацией компенса торного пути синаптотагмин-подобного белка Slp2a и ГТФазы Rab27A. Была выдвинута гипотеза, что высвобождающиеся при этом эндогенные факторы, в том числе активируют воспалительный путь через Toll-подобные рецепторы и без участия экзогенной инфекции. Для рецептора Р2Х7 (АТФ-зависимый неселективный катионный канал млекопитающих) была показана активация воспалительного ответа при повышении уровня внеклеточного АТФ.[56]. В действительности, антагонист рецептора P2 снизил уровни креатинкиназы (КК) сыворотки крови и со кратил повреждения мышц у дистрофин-дефицит ных мышей mdx и у саркогликан-дефицитных хомя ков BIO 14.6[57]. Однако, данных о взаимосвязи между высвобождениями сигнальных молекул и недостатком DYSF на сегодняшний день недостаточно.

Роль дисферлина в фагоцитозе

Было показано, что моноциты, полученные от DYSF-дефицитных мышей и от человека с дисфер линопатией, обладают повышенной фагоцитарной активностью[58]. Нокдаун экспрессии мРНК дис ферлина путем РНК-интерференции в клеточной линии макрофагов J774 существенно усилил фа гоцитоз. Однако, поскольку мышечно-специфичная трансгенная экспрессия DYSF на соответствующих уровнях (отделах) подавляет прогрессирование дистрофических изменений в модели дисферлино патии у мышей[59, 60], усиленная фагоцитарная активность DYSF-дефицитных моноцитов не может считаться основным патогенетическим фактором повреждения мышц при дисферлинопатии.

Диагностика дисферлинопатии

Диагностика дисферлинопатии стала возможной с внедрением в повседневную практику иммуноло гических методов анализа и методов молекулярной генетики. Следует отметить, что для точной диагно стики дисферлинопатии необходимо комбинированное применение различных методов.

Уровень креатинкиназы

Креатинкиназа (КК) — ключевой фермент кле точной энергетики, который стимулирует превращение креатинина в креатинфосфат и депонирует энергию для мышечного сокращения. Повышенный уровень КК в сыворотке крови характерен для дистрофических и некротических процессов в мышечной ткани. Для дисферлинопатий установлен и сохраняется на протяжении всего заболевания высокий уровень КК в крови, как правило, превышающий норму в десятки раз (на ранних стадиях 50–100 раз). Наряду с симптомами слабости и атрофией дистальных мышц, значительное увеличение КК может указывать на миопатию Миоши и, следовательно, дисферлинопатию. С течением времени, уровень КК и ее диагностическая информативность имеет тенденцию к снижению[61].

Электромиографические исследования

Электромиографические (ЭМГ) исследования при ПКМД в первую очередь позволяют установить топический уровень поражения нервно-мышечно го аппарата. При игольчатой ЭМГ у больных ПКМД выявляется «миодистрофический» паттерн измене ний в пораженных мышцах, что позволяет провести дифференциальную диагностику с наследственными моторно-сенсорными нейропатиями, для которых характерен нейрогенный тип нарушений электро генеза. Это особенно актуально, когда у больного преобладает синдром вялого дистального пареза, «свисающих стоп» как при дистальной миопатии с первичным поражением передней группы мышц голени. В большинстве случаев дисферлинопатий отмечаются миогенные изменения, а скорость про водимости нерва остается в норме. Нейрогенные из менения могут быть выявлены на поздних стадиях мышечной дегенерации[61].

Лучевая визуализация

Независимо от типа дисферлинопатии, мышеч ная визуализация представляет интерес, особенно на ранних стадиях заболевания. Исследования пу тем магнитно-резонансной томографии (МРТ) или компьютерной томографии (КТ) нижних конечностей целесообразно применять для первичного обследо вания. Атрофия мышц обеих голеней указывает на миопатию Миоши, в то время как преобладание дис трофии в мышцах тазового пояса свидетельствует о ПКМД 2В. Атрофия мышц голеней с течением времени часто распространяется и на мышцы зад ней стороны бедра, задолго до того, как этот процесс достигнет клинического проявления. Нарушение структуры икроножных мышц часто предшествует появлению клинических симптомов. В некоторых немногочисленных случаях дистальная миопатия с первичным поражением передней группы мышц го лени атрофия изначально визуализируется в перед ней большеберцовой мышце, однако с течением вре мени распространяется и на икроножную мышцу (как правило, в течение нескольких лет)[61].

Патогистологический и иммуногистохимический анализ

Одним из патогистологических признаков дис ферлинопатий является наличие некротического процесса в мышцах. На ранней стадии заболевания тканевые изменения могут быть минимальны, харак терны признаки регенерации – волокна с центрально расположенными ядрами. Экспрессию дисферлина исследуют в основном с применением двух коммерчески доступных моноклональных антител (Hamlet-1 и Hamlet-2), обеспечивающих визуализацию сни жения уровня или полное отсутствие дисферлина в мышце[62–64]. Исследование мышечной ткани у пациентов с дисферлинопатией на ультраструк турном уровне показали наличие в мембранах по вреждений и накопление субсарколеммных везикул и вакуолей[61]. Также показано, что у пациентов с дисферлинопатией наблюдаются амилоидоподобные отложения[65], воспалительные инфильтраты[66], которые иммунологически и цитологически отлича ются от классического полимиозита (аутоиммунное заболевание, характеризующееся диффузным вос палением мышц).

Иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг — полуколичественный метод, направленный на оценку количества и молекуляр ной массы исследуемого белка. При диагностике дисферлинопатий, уровень белка оценивают как в мышечных образцах, так и в CD14+ моноцитах[61, 67, 68]. Было показано, что ген дисферлин экс прессируется в моноцитах CD14+ периферической крови человека[67]. Для ряда важных функций моноцитов/макрофагов, включающих рецептор опосредованный фагоцитоз, секрецию цитокинов и рецепторов сигнальной регуляции посредством Rho семейства небольших GTPаз, таких как Rac1, RhoA, и Cdc42, необходима эффективная мембранная ре гуляция[69–72]. Учитывая роль дисферлина в мем бранной регуляции в мышечных клетках и наличие дисферлина в моноцитах, можно предположить, что дефицит дисферлина может изменить способность моноцитов выполнять такие функции, опосредо ванные Rho семейством небольших GTPаз. Так как моноциты являются предшественниками тканевых макрофагов, можно предположить, что нарушение функций макрофагов может играть определенную роль в воспалительных реакциях, происходящих у многих пациентов с дисферлинопатией.

Генетические исследования

Причины дисферлинопатий – нарушение экспрес сии гена DYSF и (или) функции дисферлина[10]. В теории, анализ ДНК – основной способ для под тверждения диагноза первичной дисферлинопатии. Однако на практике возникают сложности в опреде лении мутаций гена DYSF, который включает 55 эк зонов и имеет размер 150 тысяч пар нуклеотидов (т. п. н.), что затрудняет полное секвенирование гена. Выявлено более 450 различных мутаций, большин ство из которых являются однонуклеотидными заме нами[62, 63, 73]. Доступные в настоящее время методы не могут определять большие делеции, по сравнению с микроделециями/дупликациями или точечными мутациями, которые обнаружить легче. Вторая проблема заключается в сложности опреде ления компаунд-гетерозигот на молекулярном уров не. Нахождение только одной из двух ожидаемых мутаций гена DYSF нередкое явление. Кроме того, существует множество полиморфных аллелей гена DYSF.

Наконец, имеется выраженный фенотипический полиморфизм среди больных, несущих одинаковые мутации. Так, описаны семьи, у одних членов кото рых болезнь протекает по типу миопатии Миоши, тогда как у других ПКМД 2В[61].

Трансгенные животные в моделировании дисферлинопатий

Для изучения механизмов развития и подходов к терапии дисферлинопатии человека были разработа ны экспериментальные модели заболевания у мышей (табл. 2). Первой была описана линия мышей SJL – есте ственная модель поясно-конечностной миодистро фии[74]. Помимо мышечной дистрофии, мыши этой линии обладают повышенной восприимчивостью к индуцируемым аутоиммунным болезням, таким как экспериментальные аутоиммунные энцефалиты и вос палительные заболевания мышечной ткани. У живот ных часто развиваются спонтанные воспалительные миопатии, но при этом мышцы не теряют способность к регенерации. На линиях SJL на протяжении многих лет проводился большой объем экспериментальных исследований, касающихся различных аутоиммунных заболеваний человека, изучались процессы регенерации и трансплантации мышц[75].

Позже была предложена вторая модель – ин бредная линия A/J (родственные генотипы: a/a Tyrp1b/Tyrp1b Tyrc/Tyrc). Это гибрид белой линии Cold Spring Harbor и белой линии Baga. Инбредные линии A/J широко используются в исследованиях в области онкологии и иммунологии. Они очень восприимчивы к вызванной кортизоном врожденной волчьей пасти и подвержены к спонтанным аденомам легких (опу холи легких быстро развиваются в ответ на канце рогены). У мышей линии A/J подтвержден высокий процент развития аденокарцином молочных желез среди многорожавших самок. Также наблюдаются редкие спонтанные миоэпителиомы, образующиеся из клеток различных экзокринных желез[76]. У линии мышей A/J мышечная дистрофия проявляется достаточно поздно (на 4–5 мес.). Спонтанная мутация представляет собой вставку ретротранспозона в ген dysf около 5` конца (интрон 4). Мышцы проксимальных сегментов повреждаются сильнее, чем дистальных[77].

В 2004 г. опубликовано описание трансгенной линии мышей Dysf-/-[77]. Эти животные выведе ны в результате вставки ретротранспозона на 3` и 5’ концах гена dysf . У мышей линий Dysf-/- и A/J развивается прогрессирующая мышечная дистро фия. В начале болезни у обеих линий наблюдает ся проксимальная мышечная дегенерация. У этих линий проявляются клинические, биохимические и патогистологические характеристики дисферлино патии человека, в том числе повышенные уровни сывороточной креатинфосфокиназы, миофибриль ная дегенерация и регенерация, изменение размера фибрилл, эндомизиальный фиброз, замещение мы шечной ткани на жировую и воспаление мышечной ткани[77]. Клиническое проявление заболевания на ранних этапах у обеих линий мышей идентично и не имеет очевидной корреляции между сайтами мута ций в гене dysf. На поздних этапах болезни у линии мышей A/J наблюдается более медленная прогрес сия мышечного заболевания в сравнении с линией Dysf-/-. Фенотипическое проявление болезни на поздних этапах у разных линий в основном зависит от их генетического происхождения. Таким образом, линия мышей A/J больше подходит для идентифи кации генов, которые могут задержать начало или прогрессию мышечного заболевания.

Таким образом, у моделей мышей SJL/J (SJL) и A/J мутации в гене DYSF связаны с фенотипически ми особенностями прогрессивной мышечной дис трофии. У мышей SJL мутации затрагивают сайты сплайсинга, в результате чего происходит делеция экзона 45, кодирующего высоко консервативный домен C2E белка DYSF.

Генная терапия дисферлинопатий

Ген дисферлина имеет большой размер (6243 п.н.) и состоит из 55 экзонов, которые охватывают 233140 п.н. геномной ДНК. Возможность восста новления дефектного белка мышц путем введения в клетку функционального гена дикого типа является перспективным методом генной терапии мышечных дистрофий. Вследствие большого размера кодон-оп тимизированного гена DYSF (6243 п.н.) для созда ния генетических конструкций подходят аденовирус ные векторы, которые способны доставлять большой объем рекомбинантной генетической информации как в делящиеся, так и в неделящиеся клетки, обес печивают достаточный уровень экспрессии трансге нов, а также обладают высокой биобезопасностью[78]. Однако, эффективность аденовирусных кон струкций для лечения нервно-мышечных заболе ваний требует дополнительного изучения в связи с известными недостатками данной технологической платформы. В частности, аденовирусы плохо транс фицируют мышечную ткань, а их введение связано с возникновением иммунного ответа и формированием пула специфических антител.

Другой подход связан с использованием в каче сте носителя кодирующей ДНК дисферлина адено ассоциированных вирусов (англ. adeno-associated vector, AAV). Данный тип вирусов встраивается в ге ном клетки-хозяина. Благодаря этому свойству мо жет быть достигнута постоянная, а не транзиторная экспрессия белкового продукта. Размер гена превы шает размер трансгенной вставки, которую способен нести геном данного вируса. Интересным приемом для обхода этого ограничения является применение метода двойного транс-сплайсинга, при котором кДНК гена DYSF клонируют в виде двух отдельных частей в два AAV вектора: один рекомбинантный AAV вектор несет 5` конец кДНК вместе с донорным сайтом сплайсинга интрона; другой рекомбинантный AAV вектор несёт акцепторный сайт сплайсинга и следующую за ним 3` концевую последовательность кДНК. В результате естественной способности AAV векторов к конкатемеризации[79, 80] происходит объединение двух частей кДНК и экспрессия полно размерного белка дисферлина[81]. Внутримышеч ная инъекция двух рекомбинантных AAV в мышцу модельным мышам линии A/J привела к экспрессии полноразмерного дисферлина, продолжающейся, по крайней мере, в течение одного года. Важно, что системная инъекция в хвостовую вену мышей этих двух векторов привела к системной, хотя и слабой, экспрессии белка. Генная терапия в этом случае при вела к улучшению состояния мышечной ткани, что было установлено по данным гистологического ис следования. В целом, эти данные свидетельствуют о перспективности использования данной стратегии для лечения дисферлинопатии[81].

В 2010 г. была опубликована статья по созданию белка минидисферлина человека, восстанавливающего поражения сарколеммы у модельных мышей с дисферлинопатией[82]. Как упоминалось ранее, ввиду большого размера гена DYSF прямой перенос всей кДНК в клетки затруднителен в связи с ограниченным размером упаковки адено-ассоциированного вируса, поэтому использование мРНК минидисферлина, укороченной формы белка, обнаруженной у пациента с мягкой формой дисферлинопатии, рассматривается как альтернативная стратегия. Была идентифицирована гомозиготная геномная мультиэкзонная внутренняя делеция гена дисферлина у пациентки с поздним проявлением и умеренным развитием заболевания дисферлинопатии. Таким образом, работа продемонстрировала возможность идентификации естественных «минигенов» дисферлина при системном скрининге пациентов со слабым фенотипическим проявлением заболевания. К сожалению, геннотерапевтическая экспрессия минигена дисферлина в мышцах в условиях in vivo, не привела к улучшению на гистологическом уровне, несмотря на восстановление скорости репарации мембраны в условиях in vitro[83].

Метод пропуска экзонов с помощью антисмысловых олигонуклеотидов (экзон-скипинг)

Метод пропуска экзонов с помощью антисмыс ловых олигонуклеотидов — один из передовых методов терапии мышечной дистрофии Дюшена. Примером такой терапии являются препарат-кан дидат Drisapersen, разрабатываемый компанией GlaxoSmithKleine, который в настоящее время на ходится на III фазе клинических исследований и Eteplirsen компании AVI BioPharma (II фаза клини ческих исследований). Оба препарата обеспечивают пропуск 51-го экзона гена дистрофина.

Метод пропуска экзонов с помощью антисмысло вых олигонуклеотидов имеет некоторые недостатки[84]. Так, для коррекции различных мутаций гена требуются специфичные антисмысловые олигону клеотиды, разрабатываемые и создаваемые для каждой мутации отдельно. Кроме того, терапевти ческий подход на основе метода пропуска экзона предполагает, что укороченный белок будет функ ционально активным, что показано для мышечной дистрофии Дюшена. В двух независимых иссле дованиях была показана техническая возможность осуществления пропуска экзона в гене дисферлина, однако функциональность такого подхода так и не была изучена[85, 86].

Трансплантация стволовых или прогениторных клеток

Возможность восстановления мышц в результате клеточной трансплантации все еще считается пер спективным методом лечения поясно-конечностных мышечных дистрофий или других форм прогресси рующей мышечной дистрофии. Описаны различные источники стволовых и прогениторных клеток (СК), которые показывают способность к пролиферации in vitro, а также имеют способность участвовать в фор мировании нормальных мышечных волокон in vitro и in vivo[87-88]. Описаны и опробованы два подхода клеточной терапии: трансплантация аллогенных кле ток здорового донора и трансплантация аутогенных генетически модифицированных (с коррекцией гене тического дефекта) клеток.

На предмет возможного применения в клеточ ной терапии были исследованы миосателлитоциты (т.н. «миобласты»), гемопоэтические стволовые клетки, мезенхимные стволовые клетки, побоч ная популяция костномозговых клеток, побочная популяция мышечных клеток, стволовые клет ки мышечной ткани, стволовые клетки жировой ткани, эндотелиальные клетки-предшественницы и стволовые клетки, связанные с кровеносными со судами (мезоангиобласты)[89, 90]. Начались или планируются к проведению несколько клинических исследований по трансплантации миобластов или мезоангиобластов от HLA-совместимых доноров[89].

В исследованиях K. Leriche-Guérin (2002) были протестированы 2 модели: иммунодефицитной SCID мыши трансплантировали нормальные миобласты человека, либо мышам линии SJL, в условиях им муносупрессии, трансплантировали аллогенные мы шиные мышечные клетки-предшественницы. Через месяц белок специфический дисферлин (человека или мыши) был обнаружен в тканях у каждой из мо делей[91]. Количество дисферлин-положительных волокон составило 40–50% и 20–30% в мышцах мышей SCID и SJL соответственно.

В другом исследовании иммуногистохимическим методом было продемонстрировано, что небольшое количество клеток, взятых из пуповинной крови че ловека, могут мигрировать в мышцы SJL мышей, и экспрессировать как дисферлин, так и дистрофин, специфичный для человека, на 12 нед. после трансплантации[92].

В 2008 г. N.M. Vieira с соавторами описали вве дение без иммуносупрессии стромальных жировых клеток человека (human adipose stromal cells) мы шам SJL[93]. В статье впервые было показано, что клетки hASC не отторгаются после системного вве дения и могут участвовать в образовании химерных мышечных волокон, экспрессирующих значительное количество мышечных белков человека. Это приво дило к улучшению двигательной способности подопытных животных.

Не теряет своей актуальности возможность ге нетической коррекции мутантных клеток in vitro при помощи технологий искусственных хромосом чело века, Zn-фингерных эндонуклеаз, talen s с последующей трансплантацией.

Несмотря на определенные научные сдвиги, про изошедшие за первое десятилетие XXI века, про блема создания эффективного и безопасного мето да лечения дисферлинопатий и других ПКМД пока далека от разрешения. Развитие генно-клеточных технологий открывает возможности для разработки новых методов терапии этого заболевания.

Подняться вверх сайта