Поиск Кабинет

Действие бактериальных сериновых протениназ на перевиваемые культуры клеток животных

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 88-91

 

Авторы

Кириллова Ю.М., Данилова Ю.И.,  Шарипова М.Р.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Изучено действие сериновых протеиназ (субтилизиноподобная протеиназа и глутамилэндопептидаза) бацилл на перевиваемые линии клеток животных. Установлено, что сериновые протеиназы бацилл способны оказывать цитотоксическое действие на перевиваемые линии клеток животных. Исследуемые клеточные линии различаются по степени чувствительности к ферментам. К субтилизиноподобной протеиназе наиболее чувствительной оказались линии ЛЭК и НГУК, к глутамилэндопептидазе – линия клеток Vero.

Исследования последних лет показали, что протеолитические ферменты не только участвуют в белковом круговороте, но и играют фундаментальную роль во внутриклеточной регуляции на посттрансляционном уровне [1]. Более того, протеолитические белки традиционно активно применяются в медицине, фармакологии и промышленности [2]. Особенно перспективным является применение ферментов бактерий, так как бактерии обладают широким набором различающихся по субстратной специфичности протеаз.

Установлено, что бактерии Bacillus pumilus 3-19 секретируют в среду протеиназы, среди которых детально изучены сериновые: субтилизиноподобная протеиназа и глутамилэндопептидаза [3]. Гены ферментов клонированы и секвенированы, последовательности зарегистрированы в Международной базе данных (субтилизиноподобная протеиназа AprBi AN AY 754946, глутамилэндопептидаза GseBi AN Y15136). Изучена экспрессия обоих генов в рекомбинантном штамме B. subtilis [4]. Соответствующие белки выделены и охарактеризованы [5, 6, 7]. Способность ферментов к расщеплению фибрина, а также высокая устойчивость в широком интервале рН и температуры, позволяют провести поисковые исследования для их применения в медицине. Цель работы заключалась в определении действия бактериальных сериновых протеиназ на перевиваемые линии клеток животных.

Материал и методы

Объектом исследования служили сериновые протеиназы: глутамилэндопептидаза и субтилизиноподобная сериновая протеиназа. Глутамилэндопептидаза получена из культуральной жидкости рекомбинантного штамма B. subtilis JB 2036 Δ58.21, у которого плазмида Δ58.21 имела вставку размером 2.6 тыс. пар оснований и содержала ген глутамилэндопептидазы B. pumilis 3-19 (плазмида Δ58.21 любезно предоставлена для работы проф. С.В. Костровым).

Субтилизиноподобная сериновая протеиназа очищена из культуральной жидкости рекомбинантного штамма B. subtilis. Штамм получен путем трансформации плазмиды pCS9 в протеазо-дефицитный штамм B. subtilis JB 2036, из хромосомы которого делетированы гены внеклеточных протеиназ (штамм любезно предоставлен проф. Ю. Йомантасом). Мультикопийная плазмида pCS9, сконструированная на основе вектора pCB22, несет полный ген субтилизиноподобной сериновой протеиназы B. pumilis 3-19 под собственным промотором (плазмида pCS9 предоставлена проф. С.В. Костровым). Изучали действие ферментов на перевиваемые линии клеток животных: легкие эмбриона коровы (ЛЭК), почки африканской зеленой мартышки (Vero), почки свиньи (РК-15) и невринома Гассерова узла крысы (НГУК). Культивирование клеток проводили по стандартной методике [8] на среде Игла МЕМ с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота, инактивированной 30 мин при +56°С. Для всех экспериментов клетки высевали в стандартной концентрации 2×105 кл/мл на 24-луночные планшеты и инкубировали 24 ч при 37°С и 5% СО2 в инкубаторе фирмы BINDER. После формирования 80% монослоя ростовую среду тщательно удаляли и заменяли раствором Хэнкса. Раствор Хэнкса служил основной средой для приготовления разведений фермента, который добавлялся непосредственно в лунки с клеточным монослоем. Проводили визуальное наблюдение изменения морфологии клеток и клеточного монослоя до и после обработки.

Цитотоксическое действие ферментов (ЦТД) определяли по степени дегенерации клеточного монослоя, а также по соотношению количества мертвых и живых клеток (подсчет в камере Горяева с использованием красителя трипановый синий). Через 24 ч производили подсчет выживших клеток в процентах, принимая количество клеток в лунках без образца за 100%.

Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием стандартного пакета программ Microsoft Excel. Результаты представлены как средние арифметические со стандартным отклонением. Статистическую значимость различий определяли по критерию Стьюдента (уровень значимости р < 0,05).

Результаты и обсуждение

Исследовали действие бактериальных сериновых протеиназ – субтилизиноподобной протеиназы и эндопептидазы – на клеточные культуры путем наблюдения за изменением морфологии клеток и клеточного монослоя до и после их обработки белками. Показано, что внесение субтилизиноподобной протеиназы в концентрациях в 270 мкг/мл и 135 мкг/мл через 2 ч инкубации с ферментом приводило к округлению клеток и зернистости цитоплазмы перевиваемых линий ЛЭК, Vero, РК-15, НГУК. Причем в линии Vero этот эффект выражен в большей степени. Через 24 ч культивирования с ферментом монослой линий ЛЭК и НГУК в присутствии концентраций фермента 270 мкг/мл и 135 мкг/мл полностью разрушался либо имел характерные деструктивные изменения (рис. 1, рис. 2, соответственно). В концентрации 27 мкг/мл фермент не оказывал заметного действия. Монослой клеточных линий Vero, РК-15 (рис. 3) полностью разрушался в присутствии всех исследуемых концентраций субтилизиноподобной протеиназы.

При исследовании действия другой сериновой протеиназы – глутамилэндопептидазы на те же перевиваемые линии ЛЭК, Vero, РК-15, НГУК установлено, что уже через 2 ч после внесения фермента в концентрации 130 мкг/мл наблюдалось округление клеток, вакуолизация цитоплазмы клеток все линий. В лунках, в которые фермент вносился в меньших концентрациях, морфология клеток не изменялась. Показано, что через 24 ч инкубации с глутамилэндопептидазой в концентрациях 130 мкг/мл наиболее чувствительными оказались линии ЛЭК (рис. 4) и Vero, их монослой бы полностью разрушен. Фермент в концентрации 65 мкг/мл вызывал вакуолизацию клеток данных линий, действие меньших концентраций не проявлялось. Линии НГУК и РК-15 оказались менее чувствительны к ферменту, и даже концентрация 130 мкг/мл не изменяла клеточного монослоя данных линий.

В результате добавления бактериальных белков в ростовую среду прикрепленные клетки открепляются и образуют агрегаты, но не погибают. Мы провели определение жизнеспособности клеток, для этого использовали прием изучения целостности мембраны путем окрашивания трипановым синим.

При определении жизнеспособности клеток показано, что деструктивные изменения монослоя линий ЛЭК, НГУК и РК-15 при внесении субтилизиноподобной протеиназы в концентрации 270 мкг/мл сопровождались снижением числа живых клеток на 60%, 86% и 35% соответственно (рис. 5). В меньших дозах (130 мкг/мл и 27 мкг/мл) фермент оказывал менее разрушающее действие на клетки данных линий (снижение количества живых клеток на 10–20%). Внесение субтилизиноподобной протеиназы во всех исследуемых концентрациях приводило к полному разрушению клеточного монослоя линии Vero, тем не менее, это не влияло на общее количество живых клеток (см. рис. 5).

Наиболее чувствительной линией к глутамилэндопептидазе в концентрации 130 мкг/мл оказалась линия клеточных культур Vero, количество живых клеток в этом случае снижалось на 40% (рис. 6). Несмотря на то, что клеточный монослой линии ЛЭК так же полностью разрушался через 24 ч инкубации с ферментом, как и монослой линии Vero, количество живых клеток ЛЭК оставалось выше (см. рис. 6).

На остальные клеточные линии глутамилэндопептидаза во всех исследуемых концентрациях не оказывала значительного цитотоксического действия.

Таким образом, полученные данные позволяют заключить следующее. Сериновые протеиназы бацилл способны оказывать цитотоксическое действие на перевиваемые линии клеток животных, однако не всегда разрушение клеточного монослоя сопровождается гибелью клеток. Исследуемые клеточные линии различаются по степени чувствительности к ферментам. К субтилизиноподобной протеиназе наиболее чувствительными оказались линии ЛЭК и НГУК, к глутамилэндопептидазе – линия Vero. Способность клеток по-разному реагировать на присутствие ферментов может быть связана со структурными особенностями в строении клеточных мембран.

Подняться вверх сайта