Поиск Кабинет

Децеллюляризованные артерии пуповины человека как основа тканеинженерных кровеносных сосудов малого калибра

Гены & Клетки: Том VIII, №1, 2013 год, стр.: 66-71

 

Авторы

Насрединов А.С., Лаврешин А.В., Анисимов С.В., Вавилов В.Н., Курапеев Д.И.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Достижения тканевой инженерии во многом связаны с появлением возможности получения соединительнотканных матриксов тканей и органов методом децеллюляризации. Децеллюляризованные ткани сохраняют механическую прочность и нативную структуру, что делает их подходящим субстратом для последующего заселения клетками реципиента. Методики децеллюляризации сильно различаются в зависимости от вида обрабатываемой ткани. Нами разработан оригинальный способ децеллюляризации сосудов малого калибра, в качестве которых использовали артерии пуповины человека. Эффективность децеллюляризации артерий оценивали с помощью гистологических и иммуногистохимических исследований, в ткани сосуда определяли количество нуклеиновых кислот. Полученные децеллюляризированные кровеносные сосуды могут быть использованы в качестве носителей для клеток в рамках создания тканеинженерных сосудистых графтов, востребованных в реконструктивной сердечно-сосудистой хирургии.

Сердечно-сосудистые заболевания являются ведущей причиной смертности во всем мире[1]. «Золотым стандартом» лечения сердечно-сосудистых заболеваний, обусловленных окклюзией сосудов, являются шунтирующие операции. В настоящее время существует острая потребность в сосудистых протезах, идентичных по свойствам нативным артериям человека[2–5]. Тканевая инженерия, быстро развивающаяся в последнее десятилетие, способна «предложить» способы создания сосудов, альтернативных использующимся в настоящее время синтетическим протезам и аутовенозным шунтам[5–7]. Такие «искусственные артерии», созданные при помощи методов тканевой инженерии, должны отвечать всем требованиям, предъявляемым к сосудистым заменителям сегодня, а именно: биосовместимость и биостабильность, тромборезистентность, устойчивость к инфекциям, нулевая хирургическая порозность, вазоактивность, оптимальные механические свойства, такие как прочность, эластичность, гибкость[2, 5]. Как ожидается, они будут хорошо приживляться, заселяться клетками реципиента, подвергаться ремоделированию, становясь фактически собственной артерией. К настоящему времени ни один из разработанных заменителей сосудов не обладает этими характеристиками в полной мере[2, 3, 8].

В качестве основы для создания будущего сосуда возможно использование как синтетических, так и естественных полимеров. Из естественных, преимущества которых очевидны, наиболее часто используют коллаген[9]. Однако синтезировать протяженную конструкцию из коллагена со структурой естественного сосуда до настоящего времени не удается[5]. С другой стороны, при элиминации клеточного компонента из стенки интактной донорской артерии останется только внеклеточный матрикс, состоящий из коллагена и эластина, с сохраненной естественной структурой, которая будет максимально благоприятной для последующей колонизации клетками реципиента, а отсутствие «чужих» клеток нивелирует возможный иммунный ответ после трасплантации тканеинженерного сосуда реципиенту[5, 10, 11]. В настоящее время большинство стратегий получения такого матрикса направлены как раз на разработку методов децеллюляризации донорского сосуда[2, 4, 12], то есть на полное удаление клеток и их остатков (клеточного дебриса) с минимальным повреждением экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ) сосуда. Децеллюляризированные сосуды должны быть лишены иммуногенных свойств, при этом сохранять структуру и механические свойства ЭЦМ, который может быть использован как носитель для клеток тканеинженерного графта.[7, 13–16].

Многочисленные опубликованные протоколы децеллюляризации[5, 15, 17–19] оказались неэффективны при обработке кровеносных сосудов малого калибра, так как они либо не полностью удаляют клетки из ткани, либо серьезно повреждают ЭЦМ, поэтому требуют серьезных доработок. В этой связи продолжаются поиски новых методов удаления клеток из нативных тканей. В результате испытания различных вариантов протоколов, в нашей лаборатории был разработан оригинальный способ децеллюляризации кровеносных сосудов малого калибра (3–4 мм), в качестве которых в эксперименте использовали артерии пуповины человека.

Материал и методы

Получение материала

Для изготовления внеклеточного матрикса кровеносного сосуда малого калибра использовали артерию пуповины человека. Материал получали в родильном зале Федерального специализированного перинатального центра ФГБУ «ФЦСКЭ им. В.А. Алмазова». Пуповину транспортировали в лабораторию в охлажденном фосфатно-солевом буферном растворе (Росмедбио, Россия) при температуре +4°С. Время доставки составило 1–2 ч. В стерильных условиях с помощью пинцета и ножниц из пуповины выделяли обе артерии, которые затем разделяли на участки длиной 5–6 см. Далее часть материала подвергали децеллюляризации, часть замораживали и хранили при температуре -80°С.

Методика децеллюляризации артерий пуповины

Разработанный способ удаления клеток из стенки кровеносных сосудов состоит из нескольких этапов со сменой децеллюляризирующих растворов (ДР), в составе которых используются детергенты и ферменты. После каждого этапа участок артерии трижды промывали в фосфатно-солевом буфере с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ФСБ-ЭДТА, Росмедбио, Россия) по 10–15 мин.

Все этапы децеллюляризации проводили при постоянном вращательном движении ДР в рабочей емкости, для чего последнюю устанавливали на орбитальном шейкере со скоростью 30 об/мин и амплитудой движений 10 мм (орбитальный шейкер GFL 3005, GFL, Германия), подвергали вибрации с помощью небольшого мотора с эксцентриком (вибромотор QX-6A-1, QX Motor, Китай). Предварительно замороженные фрагменты артерий размораживали на водяной бане при температуре +37°С в течение 10 мин. Первым этапом производили отмывание участка кровеносного сосуда от крови в деионизированной воде (Milli-Q, Millipore, Франция) в течение 1 ч при температуре +5°С. Затем материал на 1 ч при температуре 37°С помещали в 0,05% раствор трипсина (Самсон-Мед, Россия) в ФСБ-ЭДТА. Далее артерии обрабатывали в течение 22 ч. при комнатной температуре в 0,075% растворе додецилсульфата натрия (Amresco, США) в ФСБ-ЭДТА, затем еще в течение 22 ч также при комнатной температуре обрабатывали 0,25% раствором Тритон Х-100 (Amresco, США) в ФСБ-ЭДТА. На последнем этапе, в течение 6 ч при температуре +37°С материал подвергали воздействию нуклеаз (РНКаза А 20 мкг/мл, ДНКаза I 200 мкг/мл, Росмедбио, Россия) в питательной среде M199 (SigmaАldrich, США).

Изготовление микропрепаратов артерий для гистологического и иммуногистохимического исследования

Участки исследуемых артерий помещали в 4% формалин на 4 ч, дегидратировали в спиртах и заливали в парафиновые блоки по стандартной программе на автоматическом тканевом процессоре Leica TP 1020 (Leica, Германия). С помощью микротома делали серии из трех поперечных срезов артерий толщиной 5–10 мкм. Для определения равномерности проведённой децеллюляризации исследовали срезы, сделанные по краям и в центре препарата (рис. 1).

Приготовленные срезы депарафинировали и стандартно окрашивали гематоксилином и эозином для общей оценки препарата и визуализации ядер клеток. Для определения сохранности ЭЦМ срезы окрашивали по Ван Гизону. Изучение микропрепаратов проводили на световом микроскопе Leica DM1000 с фотокамерой с увеличением от ×10 до ×1000 (Leica, Германия).

Приготовленные срезы подвергали также иммуногистохимическому анализу, используя непрямой двойной метод визуализации EnVision (Dako, Дания). В качестве первичных антител были выбраны моноклональные антитела к антигенам CD31 (PECAM-1) и к α-гладкомышечному актину (α-SMA) (Dako, Дания). Для визуализации ядер клеток препараты дополнительно докрашивали гематоксилином. Изучение микропрепаратов проводили на световом микроскопе Leica DM1000 с фотокамерой с увеличением от ×10 до ×1000 (Leica, Германия).

Определение содержания ДНК в децеллюляризированных артериях

Исследовали 3 фрагмента децеллюляризированных артерий, фрагмент нативной артерии в качестве положительного контроля и фосфатно-солевой буферный раствор в качестве отрицательного контроля. Для экстракции ДНК фрагменты исследуемых артерий массой 250–300 мг гомогенизировали в аппарате TissueLyser (QIAGEN, США). Выделение ДНК из гомогенизата проводили с помощью набора QIAamp DNA Mini Kit (QUAGEN, США), согласно протоколу производителя. Количественный анализ ДНК проводили на спектрофотометре NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, США).

Определение содержания и состава РНК в децеллюляризированных артериях Для экстракции РНК фрагменты исследуемых артерий массой 100–120 мг гомогенизировали с тризолом (Ambion, США) в аппарате TissueLyser (QIAGEN, США). После хлороформенной экстракции, РНК преципитировали изопропанолом из водной фазы, отмывали 75% этанолом и сушили воздухом при комнатной температуре. После растворения РНК в чистой воде проводили количественный анализ на спектрофотометре NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, США) и качественный – на анализаторе BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, США) с использованием системы RNA nano chip (Agilent Technologies, США).

Результаты

Макроскопическая характеристика артерий пуповины человека

Всего было изготовлено 26 фрагментов децеллюляризированных артерий пуповины. В ходе морфологического исследования образцов артерий было отмечено, что после удаления клеток сосуды теряют свой естественной цвет, становятся белесыми, что характерно для всех децеллюлированных тканей[15, 17, 18, 20, 21]. Просвет артерий становился более широким из-за отсутствия гладкомышечных клеток. При этом интактные артерии пуповины имеют диаметр 2–3 мм, в норме они спазмированы.

Результаты гистологического и иммуногистохимическго исследования артерий пуповины человека

При световой микроскопии нативная артерия пуповины имела характерное для артерий мышечного типа строение, но у сосуда отсутствовала адвентиция – ее роль выполнял Вартонов студень (рис. 2А).

Просвет артерий был сужен из-за спазма гладкомышечных клеток, имел неправильную звездчатую форму. Внутренняя поверхность сосуда покрыта эндотелием. Средняя оболочка достаточно толстая, состояла из слоя продольно расположенных гладкомышечных клеток и внешнего слоя радиально ориентированных лейомиоцитов (рис. 2Б). После децеллюляризации сосуда клетки не определялись, артерии были дилатированы, а толщина сосудистой стенки несколько уменьшалась (рис. 3).

Гистологические препараты, окрашенные обзорными красителями (гематоксилином и эозином) дают наиболее наглядную картину состояния артерии: стенка нативного сосуда богата клетками с хорошо прокрашенными ядрами (рис. 3А), а в стенке децеллюляризованной артерии (рис. 3Б) ядра клеток не визуализированы, стенка сосуда имеет характерную пористую структуру. Серии поперечных срезов, сделанных по краям и в центре исследуемых артерий (см. рис. 1), позволяют говорить о равномерности проведенной децеллюляризации.

При окраске по Ван Гизону (рис. 3В, Г), тропной к соединительнотканным волокнам, было показано, что ЭЦМ, состоящий преимущественно из коллагена, оставался неизмененным.

Антиген CD31 (PECAM-1), экспрессирующийся эндотелиальными клетками, использовали в качестве маркера их остатков при иммуногистохимическом исследовании. На внутренней поверхности нативной артерии определялось специфическое окрашивание эндотелиального слоя в коричневый цвет (рис. 3Д). После обработки сосудов по разработанному нами протоколу этот антиген не определяется, что говорит о полной элиминации эндотелиоцитов и их остатков (рис. 3Е).

В качестве маркера гладкомышечных клеток использовали α-SMA. Артерия пуповины, являясь типичной артерией мышечного типа, богата гладкомышечными клетками (рис. 3Ж). После децеллюляризации (рис. 3З) α-SMA не обнаруживается, что косвенно подтверждает не только лизис гладкомышечных клеток, но и удаление клеточного дебриса из всей толщи сосудистой стенки.

Результаты исследования нуклеиновых кислот в децеллюляризованных артериях

Исследования содержания нуклеиновых кислот в образцах показало, что в нативной артерии уровень ДНК составляет 81,9 нг/мкл элюата, а во фрагментах децеллюляризированных артерий ДНК не определялось. В необработанной артерии уровень РНК был ожидаемо высоким и составил 98,4 нг/мкл элюата. После децеллюляризации определялись лишь следовые концентрации РНК, а в ряде случаев не детектировались вовсе. При качественном анализе РНК нативной артерии показатель уровня сохранности РНК (RNA Integrity number, RIN) составил 2,3, в то время как в образцах децеллюляризированных артерий RIN не определялся (т.е. был равен нулю). Обсуждение

Последние достижения тканеинженерного направления биотехнологий во многом связаны с появлением возможности создания ЭЦМ органов и тканей методом децеллюляризации. Децеллюляризованные ткани сохраняют механическую прочность и нативную структуру, что делает их подходящим субстратом для последующего заселения клетками реципиента. Качеству удаления клеток из ткани уделяется огромное внимание, поскольку именно это обеспечивает отсутствие иммунного ответа у реципиента[12]. Выбор оптимальной методики децеллюляризации сильно отличается в зависимости от вида обрабатываемой ткани. В нашей лаборатории разработан оригинальный способ удаления клеток из стенки кровеносных сосудов малого калибра, в качестве которых в эксперименте использовали артерии пуповины человека.

Артерии пуповины в качестве субстрата для изготовления ЭЦМ кровеносных сосудов малого калибра человека недостаточно изучены, однако имеют ряд достоинств, что делает их использование очень перспективным[22]. Прежде всего, пуповина легко доступна и может быть получена в стерильном виде, длина её достигает 40–80 см, артерии пуповины не имеют боковых ветвей, а диаметр их равен 3–4 мм. При выделении артерий из пуповины их стенка может быть легко повреждена, поэтому этот этап следует проводить с осторожностью. Нам удалось успешное препарирование артерий, несмотря на их «нежность» и малый диаметр, с использованием стандартного хирургического инструментария – пинцета и ножниц. Известна работа, в которой описан оригинальный способ автоматического выделения вены из пуповины[23], однако этот способ не применим к артерии, хотя автоматизация выделения артерии несомненно увеличила бы доступность этого материала.

Для децеллюляризации использована комбинация детергентов и ферментов, что не является новым, однако описанный нами способ отличается составом, последовательностью и длительностью применения децеллюляризирующих агентов, их более низкой концентрацией и наличием дополнительного физического воздействия – вибрации, что ранее не описано, но по нашему мнению повлияло на результат.

На первом этапе, при отмывании участка кровеносного сосуда от крови в деионизированной воде, которая является гипотоническим раствором, происходит осмотический шок и частичный лизис клеток.

Непродолжительное трехкратное (по 10–15 мин после каждого этапа) промывание обрабатываемой артерии в буферном растворе направлено на механическое удаление свободного клеточного дебриса. На втором этапе использован 0,05% раствор трипсина с ЭДТА, который широко применяется в клеточной биологии для отделения клеток от поверхности субстрата (пластик, стекло). Обычно для этих целей пользуются трипсином в концентрации 0,05% или 0,25%. Нами применена более низкая концентрация этого фермента для предотвращения протеолиза белков ЭЦМ. Трипсин приводит к отделению клеток от ЭЦМ и «разрыхлению» его микроструктуры, способствует глубокому проникновению детергентов и улучшению удаления клеток из толщи сосудистой стенки на дальнейших этапах децеллюляризации. ЭДТА связывает ионы Ca2+ и Mg2+, которые, во-первых, могут ингибировать действие трипсина, во-вторых, необходимы для адгезии клеток на ЭЦМ, и, в-третьих, ЭДТА неселективно ингибирует металлопротеиназы матрикса, что предотвращает саморазрушение ЭЦМ.

На третьем этапе обработки материала использовали 0,075% раствор додецилсульфата натрия. Лаурилсульфат натрия (SLS; также додецилсульфат натрия, SDS) – сильное анионоактивное поверхностно-активное вещество (ПАВ), которое применяется для солюбилизации белков клеточных мембран и лизиса клеток с последующим вымыванием клеточного дебриса из матрикса. В литературе для проведения эффективной децеллюляризации описано применение SDS в концентрации от 0,075% до 1%. В нашей работе отдано предпочтение минимально эффективной концентрации этого детергента с целью сохранения ЭЦМ и оказания минимального возможного токсического эффекта при последующем совмещении клеток реципиента и полученного матрикса.

Четвертый этап обработки материала 0,25% раствором Тритон Х-100 направлен также на солюбилизацию клеточных белков и лизис клеток с последующим вымыванием клеточного дебриса из матрикса, а также для удаления остатков SDS, который может проявить цитотоксичность при последующей рецеллюляризации. По данным литературы, рекомендуется использовать Тритон Х-100 в концентрации 1%[5, 13, 16, 21]. Мы установили, что минимально эффективная концентрация данного реагента при прочих равных условиях составляет 0,25%. Эффективность децеллюляризации с применением только 1% раствора Тритон Х-100, либо только раствора SDS в различных концентрациях оказалась недостаточной, что соответствует данным литературы[14, 15]. Комбинация анионного и неионного ПАВ является оптимальной[5, 15, 21]

Техника заключительного этапа децеллюляризации одинакова практически во всех вариантах протокола: этот этап направлен на разрушение нуклеиновых кислот с помощью нуклеаз, которые ответственны за иммунный ответ у реципиента[11, 12, 14, 15, 18, 21]. Результаты гистологического и иммуногистохимического исследований, а также отсутствие ДНК и РНК в децеллюляризированных артериях свидетельствуют о полном удалении клеток и клеточного дебриса из обрабатываемой ткани в нашем варианте протокола децеллюляризации.

Заключение

Разработанный нами способ децеллюляризации сосудов малого калибра обеспечивает эффективное удаление клеток, их «остатков» и нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) из ЭЦМ без его повреждения. Эффективность описанного способа проверена в серии из 26 последовательных экспериментов, при этом достигнуты воспроизводимые результаты. Полученные таким образом децеллюляризированные ткани могут использоваться в качестве матриксов для клеток тканеинженерных сосудистых графтов, пригодных для использования и востребованных в практике сердечно-сосудистой хирургии.

Подняться вверх сайта