Поиск Кабинет

Децеллюляризация пищевода низших приматов.

Гены & Клетки: Том IX, №4, 2014 год, стр.: 64-69

 

Авторы

Губарева Е.А., Сьоквист С., Сотниченко А.С., Лим М.Л., Н. Фелиу-Торрес, Даниленко К.А., Орлов С.В., Чвалун С.Н., Григорьев Т.Е., Крашенинников С.Н., Порханов В.А., Поляков И.С., Куевда Е.В., Гуменюк И.С., Маккиарини П.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Трансплантация является эффективным методом лечения пациентов, страдающих различными заболеваниями в терминальной стадии, но связана с постоянным недостатком донорских органов и необходимостью пожизненной иммунносупрессивной терапии. Получение тканеинженерных конструкций методом децеллюляризации с последующей рецеллюляризацией может стать альтернативным методом лечения за счет восстановления, замены и регенерации клеток, тканей и органов с нарушенными функциями. Основной целью данного исследования явилось получение децеллюляризированных матриксов пищевода у низших приматов и их последующая патоморфологическая характеристика. Для децеллюляризации пищевода был использован модифицированный детергентно-энзиматический метод с применением дезоксихолата натрия и ДНКазы. Проведенные морфологические исследования подтвердили сохранность архитектоники ткани, отсутствие клеток и ядерного материала. Изучение биомеханических свойств каркаса показало сходные прочностные характеристики нативного и децеллюляризированного образцов, однако, более высокую разрывную деформацию. Полученные результаты позволяют продолжать исследования по изучению возможности использования децеллюляризированного матрикса пищевода низшего примата для рецеллюляризации с последующей дифференцировкой, реваскуляризацией и реиннервацией при проведении гетеро- и ортотопических трансплантаций.

Введение

Во всем мире ежегодно более чем у 500 000 человек диагностируют рак пищевода [1] и по современному прогнозу эта цифра увеличится до 850 000 человек к 2030 г. [2]. Рак пищевода среди злокачественных заболеваний является одним из наиболее агрессивных по течению и неблагоприятных по прогнозу для жизни пациентов. В структуре всех злокачественных заболеваний рак пищевода составляет 3% и занимает 6-е место, среди опухолей желудочно-кишечного тракта – 3-е место (после рака желудка и прямой кишки). Пик заболеваемости приходится на возраст 50–60 лет [3]. Около 30% Введение Во всем мире ежегодно более чем у 500 000 человек диагностируют рак пищевода [1] и по современному прогнозу эта цифра увеличится до 850 000 человек к 2030 г. [2]. Рак пищевода среди злокачественных заболеваний является одним из наиболее агрессивных по течению и неблагоприятных по прогнозу для жизни пациентов. В структуре всех злокачественных заболеваний рак пищевода составляет 3% и занимает 6-е место, среди опухолей желудочно-кишечного тракта – 3-е место (после рака желудка и прямой кишки). Пик заболеваемости приходится на возраст 50–60 лет [3]. Около 30% образования стриктур и, как правило, нуждаются в повторных эндоскопических вмешательствах для бужирования пищевода [8].

Тканевая инженерия, которая позволяет создавать биологическую конструкцию для замены поврежденного или удаленного органа в лабораторных условиях, обладает огромным потенциалом для улучшения качества жизни таких больных. Кроме того, пациенты, которые сегодня считаются неоперабельными из-за плохого клинического статуса, могут получить шанс на выздоровление.

Предыдущие исследования в области тканевой инженерии пищевода были сосредоточены на применении децеллюляризированного матрикса подслизистой оболочки тонкого отдела кишечника свиньи для пластики пищевода. К сожалению, использование данного материала для замещения пищевода у свиней оказалось безуспешным [9] изза высокой частоты развития послеоперационных стенозов. Применение децеллюляризированного матрикса подслизистой оболочки тонкого отдела кишечника свиньи оказалось успешным лишь только при замещении им небольших дефектов в нативном пищеводе, в то время как сегментарная имплантация подобного каркаса была неудачной ввиду развивающейся дисфункции пищевода [10]. Также подобный матрикс использовался и у собак. Было показано отсутствие полной эпителизации и регенерации скелетной мускулатуры в трансплантате [11]. R. Ackbar и соавт. (2012) провели успешную децеллюляризацию пищевода овец с сохранением его ультраструктуры [12]. Totonelli G и соавт. в 2013 г. опубликовали работу, посвященную созданию децеллюляризированного пищевода свиньи при помощи детергентэнзиматического метода и изучили ультраструктуру полученного каркаса, успешно показав возможность использования подобного матрикса в тканевой инженерии пищевода [13].

S. Sjöqvist и соавт. (2014) описывают методику создания децеллюляризированного каркаса пищевода крысы, повторяющего архитектонику нативного органа, устойчивого к механическим нагрузкам и индуцирующего васкуляризацию [14]. Засеянные на каркас мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) были способны к спонтанной дифференцировке в эпителио- и мышечноподобные структуры. Рецеллюляризированный каркас использовали для ортотопической трансплантации иммунокомпетентным крысам. Все животные выживали в течение 14 дневного эксперимента с пересаженным графтом верхней трети пищевода. В эксплантированных трансплантатах показана регенерация всех основных клеток и тканей пищевода, в том числе эпителия, мышечных волокон, нервов и сосудов. Тканеинженерная конструкция пищевода, на создание которой направлена данная работа, при успешных доклинических исследованиях, может в будущем спасти жизнь и обеспечить ее высокое качество большому числу пациентов с приобретенными и врожденными заболеваниями пищевода, включая протяженный стеноз, атрезию пищевода, трахео-пищеводные фистулы, ожоги, рак.

Материал и методы

Эксплантация органов

Для создания децеллюляризированного матрикса тканеинженерного пищевода использовали органы 2 мужских особей макак-резус (Macaca mulatta). Все манипуляции с животными осуществляли с соблюдением правил проведения работ с использованием экспериментальных животных (протокол локального этического комитета № 30/1). Материал получили в условиях операционной ГБУЗ «Научно-исследовательский институт – краевая клиническая больница №1 имени профессора С.В. Очаповского» министерства здравоохранения Краснодарского края. Далее пищевод транспортировали в лабораторию в охлажденном растворе PBS -/- (Gibco, Англия) при температуре +4°С. Время доставки составило не более 2 ч. В стерильных условиях с помощью пинцета и ножниц пищевод отделяли от окружающей его соединительной ткани. Один пищевод децеллюляризировали, а другой использовали в качестве нативного контроля. Для проведения децеллюляризации краниальную и каудальную части пищевода канюлировали пластиковыми катетерами в соответствии с их диаметром. Орган присоединяли к перистальтическому насосу посредством соединительных трубок и помещали в специализированный биореактор ORCA (Harvard Apparatus, США).

Децеллюляризация пищевода

В оригинальном протоколе [14] проводилась децеллюляризация пищевода крысы детергент-энзиматическим методом, включающим в себя 2 цикла перфузии органа 4% раствором дезоксихолата натрия с 2000 ЕД ДНК-азы I в течение 30 мин и два цикла перфузии пищевода деионизированной водой также в течение 30 мин, причем во время второго цикла децеллюляризации в деионизированную воду был добавлен 2mM раствор ЭДТА. В завершение ткани перфузировали раствором PBS -/- в течение 60 мин. С целью оптимизации протокола для проведения последующей децеллюляризации пищевода, нами было увеличено время воздействия, состав и порядок перфузии децеллюляризирующими растворами. Таким образом, для децеллюляризации пищевода детергент-энзиматическим методом проводили 2 цикла обработки пищевода (деионизированная вода – 1 ч; дезоксихолат натрия 4% + 2mM раствор ЭДТА 1 час; PBS -/- – 10 мин; свиная панкреатическая ДНКаза-I 2000 ЕД /200 мл PBS +/+ – 1 ч ), PBS -/- 200 мл – 18 ч. Перфузию пищевода осуществляли со скоростью 150 мл/мин. Все растворы были стерильными, комнатной температуры (рис. 1 А, Б).

Патоморфологический анализ

Полученные образцы нативного и децеллюляризированного пищевода фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, дегидратировали и заключали в парафин по стандартной методике. С помощью микротома получали срезы толщиной 5 мкм. Для общегистологической оценки препаратов проводили окраску срезов гематоксилином и эозином (Histolab, Швеция). Клеточные ядра визуализировали с использованием флуорофора (4’,6-диамидино-2-фенилиндола) DAPI (SigmaAldrich, США). Для изучения структуры внеклеточного матрикса (ВКМ) срезы окрашивали по ван Гизону (Histolab, Швеция), трихромом по Массону (RichardAllan Scientific, США). Изучение микропрепаратов проводилось на микроскопе Olympus BX51 (Япония). Количественное определение содержания ДНК Количественную оценку содержания ДНК в нативных и децеллюляризированных органах проводили с использованием наборов реактивов (DneasyBlood and Tissue Kit, Qiagen, Швеция) по стандартным протоколам по описанной ранее методике [17]. Исследование материала осуществлялось на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific Inc., США).

Оценка биомеханических свойств

Сравнительные биомеханические тесты образцов нативного и децеллюляризированного пищевода проводили на универсальной испытательной машине фирмы «Инстрон» модели 5965 (США). Все испытания проводились в воздушной среде при комнатной температуре, до момента испытания образцы хранились в среде фосфатного буфера при 4°C. Препарированные образцы пищевода (рис. 2 А,Б) растягивали с постоянной скоростью 20 мм/мин в продольном направлении. Начальное расстояние между зажимами составляло 10 мм.

Статистический анализ

Статистическую обработку полученных данных осуществляли методами вариационной статистики на персональном компьютере с использованием программного обеспечения Excel for Office. Полученные результаты выражали в виде средних значений (M) и ошибки среднего (m). При сравнении средних значений изучаемых групп процент возможной ошибки находили по таблице t-критерия Стьюдента для парных сравнений, выражаемый в виде значений достоверности различия – «р», где р<0,05 считалось статистически достоверным.

Результаты

При морфологическом исследовании образцов нативного и децеллюляризированного пищевода было отмечено, что ткани органа после удаления клеток теряли характерный темно-красный цвет и становились молочно-белыми, что характерно для всех децеллюляризированных органов и соот носится с литературными данными [15–21]. Просвет пищевода становился более широким из-за отсутствия мышечной ткани.

Окраска нативных тканей гематоксилином и эозином (рис. 3) показала, что слизистая оболочка органа представлена многослойным плоским неороговевающим эпителием, подслизистая основа – рыхлой волокнистой соединительной тканью, мышечная оболочка состоит из циркулярного и продольного слоев мышечной ткани. В препаратах децеллюляризированной ткани пищевода не были визуализированы сохранные ядра клеток, стенка пищевода имела характерное пористое строение. Децеллюляризированная ткань в сравнении с нативной фактически не окрашивалась как оксифильным, так и базофильным красителями.

Окраски тканей нативного и децеллюляризированного пищевода по ван Гизону, трихромом по Массону, тропным к соединительнотканным волокнам, в нативной ткани позволила подробнее визуализировать волокна внеклеточного матрикса, их гистоархитектонику и локализацию в пищеводе. Окрашенные соединительнотканные волокна преимущественно локализовались в области базальной мембраны эпителия, в подслизистом, а также в мышечном слоях. В децеллюляризированной ткани внеклеточный матрикс, состоящий преимущественно из коллагена, оставался неизмененным (рис. 4 А–Г). Набухания либо иных патологических изменений структуры, архитектоники, ориентации волокон, тинкториальных свойств соединительной ткани обнаружено не было. При окрашивании флуорофором DAPI (4’,6-диамидино-2-фенилиндолом) в парафиновых срезах нативных органов отмечалось интенсивное свечение ядер, в децеллюляризированных – свечение полностью отсутствовало (рис. 4 Д–Е).

Для более полной и всесторонней морфологической характеристики тканевых структур децеллюляризированного матрикса проводили измерение его прочностных свойств при помощи механического тестирования. В результате проведения биомеханических испытаний были получены кривые растяжения в координатах напряжение-деформация. Типичные кривые растяжения приведены на рис. 6.

756n6umkrl5r

Из графика следует, что при данных условиях испытаний нативные и децеллюляризированные образцы имеют близкую прочность, однако различаются по модулю упругости и предельной деформации. Кривые растяжения имеют несколько характерных областей: начальная область до 75% характеризуется невысоким модулем упругости, затем наклон резко увеличивается, и наконец, при напряжении 750 МПа образцы начинают разрушаться. Децеллюляризированные образцы имели более низкое значение модуля упругости, но более высокую разрывную деформацию.

Определение остаточного содержания ДНК – важный этап оценки полученного матрикса после проведенной децеллюляризации. Количественный анализ показал, что содержание ДНК в децеллюляризированном пищеводе снижалось до 29% (293,59±27,09 нг/мг в нативном пищеводе и 75,49±7,46 нг/мг – в децеллюляризированном). Полученные результаты свидетельствовали об эффективности децеллюляризации, после которой матрикс был в значительной степени (p = 0,0011) очищен от ядерного материала (рис. 5).

Обсуждение

Имеющийся опыт децеллюляризации пищевода мелких лабораторных животных позволил транслировать данную методику с оптимизацией протокола по времени экспозиции и концентрации децеллюляризирующих растворов на наиболее приближенную к клинике модель низших приматов. В ходе проведения децеллюляризации пищевода нами, на основе литературных данных, были выбраны предварительные критерии оценки качества децеллюляризации матриксов, включающие в себя: отсутствие клеток, определяемых различными методами микроскопии; количественный анализ ДНК, указывающий на остатки ядерного материала; биомеханическую прочность матриксов.

Децеллюляризация – это процесс, направленный на удаление клеток из ткани с сохранением внеклеточного матрикса (ВКМ) и трехмерности структуры органа [19, 22], с использованием различных методов воздействия на клетки. Подробное рассмотрение данной проблемы показало, что внеклеточные матриксы обладают всеми характеристиками, необходимыми для создания естественного каркасa тканеинженерного органа или ткани [23].

Перспективы применения децюллюляризированных матриксов определяются выработкой специфичных для каждой ткани методов их получения, и является ключевым моментом комплексной их оценки. Именно поэтому так важен подбор правильного протокола децеллюляризации, при котором сводится к минимуму структурное повреждение, даже в пределах родственных видов тканей. Полученные децеллюляризированные каркасы по данным литературы способны стимулировать клеточную пролиферацию, хемотаксис, ответное ремоделирование тканей, однако, при этом они не должны содержать продуктов деградации клеток, остатков химических детергентов, которыми их обрабатывали [22, 24].

Для проведения децеллюляризации могут использоваться различные методы: физические, ферментативные и химические [22]. Каждый химический агент воздействует на орган определенным образом. При выборе правильной временной экспозиции детергентов, способа децеллюляризации ткани мы учитывали ее анатомо-гистологические особенности, так как неудачно и неправильно выбранный детергент мог привести к разрушению структуры матрикса и потере его механических и биологических свойств. В данной работе также принималось во внимание, что при выборе детергентно-энзиматического метода для децеллюляризации органа или ткани химический агент повреждает матрикс в той или иной степени, таким образом, важно было минимализировать последствия.

Децеллюляризированные донорские органы не должны содержать клеток, в том числе клеточных компонентов: цитоплазму и ядра. Их присутствие во ВКМ может способствовать нарушению клеточной биосовместимости in vitro и вызывать побочные реакции в условиях in vivo при последующей рецеллюляризации [24, 25]. Поскольку при методах децеллюляризации невозможно удалить 100% клеток, существуют различные методы количественной оценки оставшихся компонентов клеток, таких как двухцепочечная ДНК, митохондрии или мембранассоциированные молекулы, например, фосфолипиды. Пороговая концентрация остаточного клеточного материала в ВКМ, которая может быть достаточной для развития нежелательного эффекта, не была подробно изучена и может изменяться в зависимости от источника ВКМ, типа ткани, в которую он был имплантирован, и иммунной системы реципиента. В настоящее время не определены количественные критерии эффективности децеллюляризации. Анализ современной научной литературы показал, что изучение развития ремоделирующего эффекта и возникновения побочных явлений на клеточном и организменном уровнях, были предложены минимальные критерии для оценки эффективности децеллюляризации [22]. Эти критерии носят феноменологический характер, они были определены на основе многолетнего опыта изучения каркасов тонкой кишки и мочевого пузыря, которые способствовали тканеспецифичному ремоделированию тканей после имплантации. Более поздние работы поставили эти критерии под сомнение, так как менее эффективно децеллюляризированные ткани показывали аналогичные результаты после имплантации при сравнении с эффективно децеллюляризированными тканями. Хотя эти критерии дают много полезной информации, можно утверждать, что они определяют денуклеаризацию тканей, а не децеллюляризацию. Будущие исследования должны расширить знания в этой области, чтобы показать, насколько эффективно клеточно-ассоциированные белки удаляются и какие последствия эти белки оказывают при ответе на имплантацию для расширения нашего понимания адекватности децеллюляризации тканей [26].

При отработке протокола децеллюляризации пищевода низших приматов время экспозиции детергентов и энзимов было увеличено в два раза в сравнении с оригинальным протоколом децеллюляризации пищевода крыс [14], так как при меньшем времени воздействия световая микроскопия показывала наличие неразрушенных клеток и клеточных ядер. Увеличение же концентрации децеллюляризирующих растворов напротив приводило к разрушению внеклеточного матрикса с потерей механических свойств, поэтому исходная концентрация изменена не была. С учетом того, что внутриклеточные и мембранные компоненты являются антигенами, которые обладают возможностью инициировать иммунное отторжение при трансплантации [27, 28] был проведен количественный анализ ДНК в тканях, показавший снижение уровня ДНК в четыре раза по сравнению с исходным количеством.

Полученные данные механического тестирования образцов нативного и децеллюляризированного пищевода, вероятно, служат доказательством того, что в нативном образце прочные коллагеновые волокна погружены в клеточную матрицу, которая, обеспечивает связанность композиционной системы и придает образцу дополнительную жесткость. Большая деформируемость децеллюляризированных образцов пищевода, скорее всего, обусловлена значительным вкладом пластической деформации, при которой несвязанные коллагеновые волокна в условии отсутствия клеток могут легко выпрямляться и скользить друг относительно друга, обеспечивая высокую разрывную деформацию. Таким образом, несмотря на близкую прочность нативных и децеллюляризированных образцов, имеются различия в разрывной деформации, которая повышается после проведенной децеллюляризации.

Заключение

Тканеинженерные конструкции пищевода, полученные методом децеллюляризации и позволяющие создавать участки органа, пригодные для трансплантации, помогут снизить потребность в подобных реконструктивных вмешательствах с высокой степенью риска для пациентов и, как следствие, улучшить прогноз и выживаемость пациентов после операций. При этом разрабатываемые для оценки качества децеллюляризированных матриксов критерии должны быть комплексными и не ограничиваться только параметрами полного удаления клеток, способных вызвать иммунную реакцию отторжения, но и учитывать степень сохранности белков ВКМ, отсутствие токсичности, возможность восстановления биомеханических характеристик, каркас должен не нарушать клеточной адгезии, полностью воссоздавать трехмерную структуру органа, участвовать в клеточной дифференцировке in vivo, стимулировать реваскуляризацию и реиннервацию после трансплантации. Будущие исследования по децеллюляризации и рецеллюляризации пищевода низших приматов расширят представления о патофизиологических механизмах регенерации органов и тканей.

Подняться вверх сайта