Поиск Кабинет

Децеллюляризация как способ предотвращения активации иммунного ответа на аллогенные легочные клапаны сердца

Гены & Клетки: Том VIII, №4, 2013 год, стр.: 55-60

 

Авторы

Сергеевичев Д.С., Сергеевичева В.В., Субботовская А.И., Васильева М.Б., Докучаева А.А., Караськов А.М., Козлов В.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Изучение механизмов аллореактивности и разработка методов профилактики отторжения трансплантированных органов являются приоритетными задачами клинической иммунологии. Освобождение сосудистых и клапанных протезов от клеточного детрита является эффективным способом снижения их иммуногенности в посттрансплантационный период и, как следствие, продления их функциональной полноценности. Однако ключевые механизмы реализации иммунной реактивности реципиента при имплантации бесклеточных биоматриксов изучены мало.

Нами предложен биоинженерный способ предотвращения активации лимфоцитов в ответ на стимуляцию аллогенными тканями. В данной работе исследовано влияние предимплантационной децеллюляризации клапанов сердца человека на in vitro экспрессию регуляторов активации лимфоцитов CD28 и CD152. Ко-инкубирование мононуклеарных клеток крови с фрагментами нативных аллогенных клапанов сердца приводило к достоверному повышению экспрессии лимфоцитами CD8+28+ с 37,9% до 44,5%, CD8+152+ с 0,3% до22,6%, CD4+28+с 96,4% до 98,4%, CD4+152+с 0,04% до 43,8%, (p<0,05). Аналогичные результаты были получены при ко-культивировании мононуклеарных клеток крови с фрагментами криоконсервированных клапанов сердца. Напротив, не было выявлено различий в количественной экспрессии CD28+ и CD152+ Т-лимфоцитами после инкубирования мононуклеарных клеток с децеллюляризованными клапанами в сравнении с контролем, что свидетельствует об отсутствии реакции на бесклеточный аллогенный соединительнотканный матрикс клапанов сердца.

На основании результатов данного исследования с позиций прикладной иммунологии показано трансплантационное преимущество децеллюляризованных клапанных аллопротезов в сравнении с нативными и криоконсервированными, а также выявлены перспективные молекулы-мишени реализации трансплантационного иммунитета, представляющие возможный терапевтический интерес.

Протезирование и трансплантация клапанов сердца и магистральных сосудов в настоящее время являются обычными способами лечения их необратимой дисфункции. Несмотря на разнообразие вариантов механических, синтетических, биологических и комбинированных протезов, проблема создания «идеального» клапанного либо сосудистого протеза остаётся актуальной задачей биоинженерии[1].

При всех преимуществах биологических клапанов по сравнению с искусственными остаётся нерешённым вопрос предотвращения динамической биодеградации аллографта после имплантации реципиенту вследствие развития иммуноопосредованного воспаления[2]. Это имеет важное значение в ранние сроки после имплантации, когда само оперативное вмешательство приводит к появлению множества воспалительных медиаторов, что и создает основу для локального воспаления. Основными антигенами в реализации отторжения при имплантации клапанных аллографтов являются их белковые структуры и HLA-комплексы[3, 4]. В то же время, сведений о клеточных реакциях реципиента в ответ на ацеллюлярные соединительнотканные структуры недостаточно. Существуют отдельные публикации, подтверждающие отсутствие индукции гуморального иммунного ответа при трансплантации децеллюляризованного клапана[4]. В плане снижения иммуногенности трансплантата перспективным является способ децеллюляризации графтов и удаление вместе с клеточными элементами максимального количества антигенных детерминант[5, 6].

Значимость сигнального пути CD28/B7 в формировании трансплантационного иммунитета неоспорима и активно изучается. Только при костимуляции CD28 в процессе презентации антигена Т-лимфоцит становится функционально активным, пролиферирует и синтезирует интерлейкин-2. Недостаточная экспрессия CD28 на лимфоцитах, либо конкурентное блокирование рецептора растворимыми формами В7, вызывают анергию Т-лимфоцитов[7].

Роль рецептора CTLA-4 не столь однозначна и в последнее время его изучению посвящено множество исследований[8–10]. Общепринятым считается, что экспрессия CTLA-4 неконститутивна и наблюдается при активации лимфоцитов, а его связывание с В7 на антиген-презентирующих клетках (АПК) приводит к противоположному для СD28 эффекту: ингибированию роста и пролиферации активированных CD4+ и CD8+ лимфоцитов, что рассматривается как механизм негативной регуляции иммунного ответа и поддержания толерантности иммунитета. Механизм этого процесса точно не установлен. Предположительно, происходит нарушение процессов распознавания Т-клеточными рецепторами чужеродного пептида или взаимодействие ко-стимуляторных молекул (CD28, CD80, CD86), либо активируется супрессорная функция T-регуляторных лимфоцитов.

Понимание реализации этих механизмов и их терапевтическая коррекция может стать клинически значимым подходом в индукции аллотолерантности реципиента при трансплантации органов. Поэтому цель нашего исследования заключалась в сравнительном исследовании способности аллоантигенных структур клапана сердца индуцировать экспрессию активационных молекул лимфоцитов в аллогенной системе мононуклеарных клеток (МНК) in vitro до и после децеллюляризации.

Материал и методы

Проведение исследований было одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России. Легочные клапаны сердца (ЛК) были выделены из трупного материала с помощью метода прецизионной микродиссекции с использованием «чистого», но не стерильного способа забора. Время теплой ишемии составляло менее 12 ч, общий период отсутствия кровообращения не превышал 18 ч. Критерии забора тканей, противопоказания к применению и условия выбраковки были определены согласно рекомендациям Европейского Банка Тканей[11]. Клапаны первой группы (нативные, n = 5) хранились 14 сут. в питательной среде RPMI 1640 (Биолот, Россия) с добавлением цитотоксических дозировок антибиотиков широкого спектра действия. ЛК второй группы (криосохраненные, n = 4) были помещены в индивидуальные полимерные криопакеты в растворе, содержащем RPMI 1640, 10% ДМСО (Sigma, США), 1% альбумина человека (Микроген, Россия) и 10000 ед. гепарина (Синтез, Россия). С помощью градиентной заморозки клапаны сердца были криоконсервированы и хранились 2 нед. при -150°С. Непосредственно перед началом эксперимента ткани были разморожены на водяной бане и трижды отмыты от криопротектора в фосфатном буфере ex tempore. Третья группа клапанов (n = 5) была децеллюляризована согласно методике, предложенной М.Б. Васильевой (2012) с модификациями Д.С. Сергеевичева (2013) с последующим микроскопическим контролем эффективности децеллюляризации[12, 13].

Гистологический контроль ЛК осуществлялся до и после децеллюляризации. Фиксацию материала проводили в течение 24 ч в 10% забуференном формалине, гистологическую проводку и подготовку парафиновых блоков – по стандартным методикам. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм были получены с помощью полуавтоматического ротационного микротома Microm HM340 (Carl Zeiss, Германия). Препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическую реакцию с антителами к виментину (клон V9) проводили в автоматическом иммуностейнере Ventana Benchmarck XT с системой детекции Ultra View Alkaline Phosphatase Red (Roche, США). Для визуализации и документирования результатов использовали микроскоп Axioskop 40FL с видеокамерой Axiocam MRc и комплект программного обеспечения Axiovision 4.7 (Carl Zeiss, Германия).

Из краевых участков створок клапанов всех групп методом штампования были получены фрагменты одинакового размера, около 4×4 мм, и помещены в 24-луночный планшет. Мононуклеарные клетки (МНК) были выделены из крови здоровых волонтеров с помощью центрифугирования на градиенте Limpholyte-H (Cedarlane, Канада) по общепринятым методикам.

После отмывки и оценки жизнеспособности, составлявшей более 96%, МНК были перенесены на фрагменты ЛК в 24-луночные планшеты в концентрации 105 кл/лунку с добавлением 2 мл питательной среды, Megacell RPMI 1640 (Sigma, США), содержавшей 10% фетальной сыворотки (Stem Cell, Канада), 50 мМ L-глутамина и 100 мкг гентамицина. В качестве одной контрольной группы (группа 4) были использованы МНК, культивированные без добавления фрагментов ЛК. Для оценки неспецифической функциональной экспрессии мембранных маркеров во второй контрольной группе (группа 5) был использован митоген конканавалин А (conA) в концентрации 10 мкг/мл также без добавления ЛК. Планшеты инкубировали в CO2-инкубаторе 72 ч.

На 3 сут. МНК из каждой лунки были собраны в отдельные пробирки и дважды отмыты фосфатным буфером. Для исследования популяции Т-лимфоцитов во взвеси МНК к ним добавляли моноклональные антитела CD4-APC, CD8-APC-A700, CD3APC-A750, CD45-KrOr CD152-PE, CD28-PC5.5 (Beckman Coulter, США) и инкубировали согласно рекомендациям производителя. Анализ содержания лимфоцитов, несущих маркеры CD4+/CD28+, CD8+/CD28+, CD8+/CD152+ и CD4+/CD152+ выполнен с помощью цитофлюориметра Navios и программного обеспечения Kaluza v.1.2 (Beckman Coulter, США).

Полученные данные были обработаны с использованием программы Statistica 8.0 (StatSoft, США). Для всех имеющихся выборок данных проверяли гипотезу нормальности распределения по критерию Шапиро – Вилка. Для оценки статистической значимости различий показателей между группами использовали U-критерий Манна – Уитни при уровне значимости p<0,05.

Результаты

При микроскопическом анализе гистологических препаратов стенки ЛК после децеллюляризации клеточные элементы (клетки, их фрагменты) не определялись, при этом базальная мембрана была хорошо сохранена и четко визуализирована. Сохранялось нормальное строение, распределение и взаимоориентация волокон соединительнотканного каркаса легочного аллографта. Для иммуногистохимического исследования были использованы антитела к виментину, белку промежуточных филаментов цитоскелета, что позволило более наглядно оценить эффективность децеллюляризации. Остатки клеточных мембран, коньюгированные с красным хромогеном, в небольшом количестве обнаруживались преимущественно в среднем слое (рис. 1).

При исследовании популяционного состава Т-лимфоцитов различий в экспрессии CD3, CD4 и CD8 в экспериментальных группах 1–3 выявлено не было. Показана закономерно высокая стабильная конститутивная экспрессия CD28 на CD4+ лимфоцитах во всех группах (около 97%), но только треть СD8+ лимфоцитов экспрессировали CD28 в контрольной группе 4 (табл.). Стимуляция conA (контрольная группа 5) достоверно увеличивала экспрессию СD28 как на CD4+ так и СD8+ лимфоцитах, что свидетельствует об их функциональной полноценности и способности отвечать на экзогенные воздействия.

Следует отметить, что экспрессия CTLA-4 CD3+/ CD4+- и CD3+/CD8+-лимфоцитами в контрольной группе 4 практически отсутствовала (0,04% и 0,3% соответственно), а conA не влиял на его экспрессию (рис. 2). Однако инкубирование МНК доноров с необработанными фрагментами клапанов (группы 1 и 2) через 72 ч приводило к достоверному увеличению экспрессии как CD28, так и CD152 СD4+- и СD8+лимфоцитами в сравнении с контрольной группой 4. В то же время, если индукция экспрессии CD28 возрастала на несколько процентов (при этом статистически значимо), то экспрессия CD152 увеличивалась на порядок. Следует особенно отметить, что инкубирование МНК с бесклеточными аллогенными тканевыми матриксами не приводило к экспрессии Т-лимфоцитами активационных маркеров CD28 и CD152.

Обсуждение

Успехи прикладной биоинженерии могут быть достижимы только при тщательном и детальном понимании антигенных взаимоотношений тканей, клеток иммунного ответа, биоматриксов и синтетических материалов в создаваемой биоинженерной конструкции как на клеточном, так и молекулярном уровне.

Роль постимплантационной воспалительной биодеградации клапана в современной кардиохирургии, возможно, не столь актуальна, так как абсолютная потребность в повторных операциях относительно невелика. Однако имплантация аллографта является хорошо отработанной и клинически эффективной моделью для изучения фундаментальных механизмов формирования дисфункции не только сердечно-сосудистых протезов, но и других тканевых трансплантатов. Механизмы реализации отторжения через антигены систем АВО и HLA известны. Но роль минорных антигенов в стимуляции иммунного ответа в период состояний, сопровождающихся системным воспалительным ответом, до конца не изучена, а способы их профилактики не разработаны.

Значимым механизмом формирования трансплантационного иммунитета является активация СD28/CTLA-4/B7 – рецепторного комплекса на лимфоцитах и АПК[14-16]. Увеличение в культуре доли как CD4+-, так и CD8+ -лимфоцитов, экспрессирующих CD28 и CD152, является отражением активации иммунного ответа. Причём, взаимодействие ко-стимуляторной молекулы CD28 c лигандами В7 (СD80/86) на АПК приводит к активации Т-клеток, а связывание CTLA-4 на лимфоцитах индуцирует Т-клеточную анергию[16]. Превалирование того или иного взаимодействия в процессе презентации антигена может определять исход иммунной реакции: либо формирование клона активных Т-клеток и реализация отторжения, либо формирование толерантности[7]. Показано, что дисбаланс в экспрессии или гиперстимуляции CD28 реализуется как в виде трансплантационных неудач, так и в развитии аутоиммунных заболеваний[17, 18]. Экспрессия маркера негативной регуляции иммунного ответа – CD152 (CTLA-4) – отражает одновременное формирование механизма обратной связи, ограничивающего чрезмерную активацию эффекторных Т-лимфоцитов.

Рассматривается ряд механизмов CTLA-4опосредованного ингибирования иммунного ответа. Рецептор CTLA-4 является членом семейства CD28активационных молекул, и через конкурентное авидное связывание с CD80 и CD86 на АПК CTLA-4 и CD28 реализуют оппозитные влияния на Т-хелперы[19, 20]. Если СD28 конститутивно экспрессируется на мембране лимфоцитов, то СTLA-4 появляется спустя некоторое время после активации лимфоцитов, что и было показано в эксперименте.

В нашем исследовании в качестве комплекса антигенов, стимулирующих иммунный ответ, были использованы фрагменты клапанов сердца. Клеточные мембраны эндотелия, фибробластов и др., в норме находящихся на поверхности и в пространстве соединительнотканного матрикса и несущих детерминанты HLA, являются естественными аллоантигенами для АПК и лимфоцитов реципиента. Поэтому, повышение экспрессии CD4+/CD28+ лимфоцитов реципиента в присутствии клеточного детрита донорского клапана является логичным. Оно отражает формирование аллореактивной популяции лимфоцитов в присутствии АПК, что в условиях in vivo может являться патогенетическим фактором инициации асептического воспаления клапана.

Функциональный антагонизм CD28 и CTLA-4 на Т-лимфоцитах может говорить как о развитии иммунной реакции против аллоантигенов, так и о реализации механизмов, ограничивающих ее в рамках поддержания гомеостаза иммунной системы. Поэтому следует предположить, что в ответ на аллоантиген иммунная система реципиента реализует как аллореактивные, так и толерогенные механизмы формирования иммунного ответа.

Отсутствие достоверной стимуляции активационных Т-клеточных рецепторов CD28 и CTLA-4 при культивировании МНК с бесклеточным клапаном экспериментально обосновывает иммунологическую целесообразность децеллюляризации алло- и ксенобиопротезов для предотвращения их воспалительной деградации после имплантации. В настоящее время изучаются терапевтические эффекты анти-CD28 и анти-CTLA-4 моноклональных антител при лечении онкологических и аутоиммунных заболеваний[14, 15, 18]. Использование для регуляции пострансплантационного иммунитета блокаторов рецепторных путей CD28 и CTLA-4 перспективно и представляет несомненный интерес, однако нуждается в дополнительных исследованиях.

Подняться вверх сайта