Поиск Кабинет

Децеллюляризация аортальных гомографтов и их морфологическая оценка

Гены & Клетки: Том IX, №1, 2014 год, стр.: 64-71

 

Авторы

Лаврешин А.В., Насрединов А.С., Курапеев Д.И., Анисимов С.В., Митрофанова Л.Б., Бещук О.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Большое количество осложнений, ассоциированных с имплантацией искусственных клапанов сердца, диктует необходимость развития новых технологий в производстве и применении артифициальных клапанов. В статье рассматривается эффективность одного из методов тканевой инженерии – децеллюляризации. Предложена новая комбинация реагентов для быстрого и эффективного удаления клеток из структуры корня аорты без повреждения экстрацеллюлярного матрикса.

Корень аорты человека подвергался децеллюляризации с использованием комбинации детергентного и энзиматического методов. Оценивалось их влияние на структуру створок и стенки аорты с помощью гистологических и иммуногистохимических методов.

Получены оптимальные комбинации реагентов, позволяющие эффективно удалять клеточные элементы из структур корня аорты с минимальным воздействием на матрикс. Были апробированы различные комбинации реагентов для децеллюляризации корня аорты. Протокол децеллюляризации требует дополнительного совершенствования для унификации и достижения аналогичного эффекта на восходящей аорте.

Операции по поводу заболеваний клапанного аппарата сердца занимают весомую долю среди всех кардиохирургических вмешательств. Несмотря на то, что качество, дизайн и свойства протезов клапанов сердца постоянно совершенствуются, они не могут сравниться по своим свойствам с нативными клапанами [1]. Наиболее частыми осложнениями после имплантации механических протезов являются тромбоэмболии и протезный эндокардит, профилактика которых требует проведения постоянной антикоагулянтной терапиии, которая сопряжена с кровотечениями и гемодинамическими расстройства. Применение биологических протезов позволило решить некоторые из этих осложнений, однако их применение связано с развитием кальцификации и биодеградации, требующих репротезирования через 10–15 лет, отсутствием возможности роста и протезным эндокардитом [2]. Необходимость устранения этих осложнений, а также максимального приближения к структуре и функции естественных клапанов сердца, побуждает сделать следующий шаг в разработке и производстве протезов клапанов сердца. Этим логическим шагом является использование методов тканевой инженерии [3]. Клапан сердца, изготовленный с применением тканеинженерных подходов, должен не только успешно адаптироваться к функциональным нагрузкам, но также обладать соответствующими гибкостью, прочностью, быть легко имплантируемым, долговечным, устойчивым к инфекции, атромбогенным, и, что особенно актуально для детской кардиохирургии, обладать способностью к ремоделированию и росту вместе с ростом других структур сердца.

Одним из вспомогательных методов тканевой инженерии клапанов сердца является децеллюляризация. Задачей данного метода является создание бесклеточного матрикса, обладающего схожими с нативными тканями биомеханическими свойствами, способностью к заселению стволовыми клетками реципиента, а также минимальной антигенностью. Для снижения антигенного потенциала ткани во время процесса децеллюляризации необходимо полное устранение клеточных компонентов, а именно: мембран и связанных с ней мембранных белков, клеточных органелл, ядер и содержащихся в них нуклеиновых кислот (ДНК и РНК). Кроме того, клетки донора и их элементы могут служить источником различных заболеваний, например, вирусных, способных передаваться через молекулы РНК [4]. Удаление клеток из донорской ткани позволяет клеткам реципиента мигрировать в трехмерный матрикс клапана и инициировать процессы ремоделирования с восстановлением гистотипической архитектоники.

Наша работа посвящена поиску оптимального метода децеллюляризации створок аортального клапана и восходящей аорты для создания бесклеточного матрикса с целью дальнейшего ее использования в качестве основы тканеинженерного аллографта.

Материалы и методы Эксплантация корня аорты

Створки аортального клапана и участок восходя щей аорты длиной 5 см забирали единым блоком с фрагментом миокарда левого желудочка. Эксплан тация осуществлялась во время проведения секционного исследования на базе патологоанатомических отделений, согласно разрешению Министерства Здравоохранения РФ и РАМН (приказ №596/76, регистрационный номер 10330 от 11.09.2007, приказ № 223н/38 от 6.05.2008).

Критерии включения доноров: – давность смерти не более 12 ч; – возраст: 18–65 лет.

Критерии исключения доноров: – трансмиссивные инфекции (ВИЧ, гепатиты B и C, сифилис, туберкулез); – протозоонозные инфекции (Бруцеллез, лихо радка Q); – наличие активного инфекционного процесса, септицемии; – отягощенный онкологический анамнез; – заболевания соединительной ткани; – неустановленная причина смерти; – врожденные пороки сердца.

После изъятия сердца во время патологоанатомического исследования производилось отсечение выходного отдела левого желудочка с участком восходящей аорты длиной 5 см от окружающих тканей. Препарат обрабатывался раствором хлорида натрия (физиологический раствор) (БиоЛот, Россия) для эвакуации крови и ее свертков и помещался в стерильный контейнер объемом 100 мл, содержащий фосфатно-солевой буферный раствор без ионов кальция и магния (ФСБ Ca-/Mg-) (БиоЛот, Россия) в сочетании с антибактериальными средствами [5]:

– ванкомицин (Лек, Словения) 6 мг/мл; – метронидазол (Гедеон Рихтер, Венгрия) 6 мг/мл; – амикацин (Синтез, Россия) 6 мг/мл; – ципрофлоксацин (KRKA, Словения) 1,5 мг/мл; – амфотерицин (Гедеон Рихтер, Венгрия) 25 мг/мл.

После забора тканей в протоколе исследования фиксировались ФИО донора, возраст, причина смерти, дата смерти и вскрытия, диагноз. Контейнеры с материалами доставляли в лабораторию и помещали в холодильник при температуре +4°С на срок не менее 24 ч для стерилизации.

Выделение аллографта

Выделение аллографта производили в специальном помещении, в ламинарном шкафу 2 класса. Микробиологический контроль фильтра, помещения, рабочей установки, проверка систем кондиционирования воздуха проводились каждые 6 мес. Аллографт рассекали по комиссуре между правой коронарной и некоронарной створками с использованием пинцета и ножниц (рис. 1А). Затем оценивали макроскопические свойства створок клапана и аорты на предмет наличия атеросклеротических изменений и кальциноза створок, фиброзного кольца и восходящей аорты, фиброза створок и комиссур, фенестраций и вегетаций на створках, расширения синусов Вальсальвы. В случае отсутствия вышеуказанных признаков аллографт признавалсягодным к дальнейшему исследованию. Все створки отсекались от фиброзного кольца клапана, из восходящей аорты выкраивали 2 полоски размером 5×2 см.

Оставшаяся часть аллографта утилизировалась. Створки аортального клапана и участки восходящей аорты обильно отмывались в стерильном ФСБ Ca-/Mg- от крови, сгустков и инородных тел. Одна створка аортального клапана и один участок аорты забирали как материалы контроля. Их помещали в контейнер объемом 25 мл со стерильным буферным раствором и антибиотиками и хранили в холодильнике при +4°С, либо сразу фиксировали в формальдегиде. Остальные створки аортального клапана и участок аорты после отмывки были готовы к последующим исследованиям (рис. 1Б).

Децеллюляризация аллографтов

Методика децеллюляризации аллографтов включает в себя ряд последовательных действий, приводящих к полной элиминации клеток из тканей при условии минимального влияния на экстрацеллюлярный матрикс.

Первый этап децеллюляризации состоял в обработке тканей с целью разрушения клеточных мембран комбинацией детергентов (для створки аортального клапана), а также детергентами и трипсином (для восходящей аорты). На этом этапе использовались следующие реагенты в различных концентрациях: трипсин (Самсон-Мед, Россия; Gibco, США), додецилсульфат натрия, дезоксихолат натрия (Sigma, США), 0,2% этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (БиоЛот, Россия). Все растворы готовились на основе стерильного ФСБ Ca-/Mg- (БиоЛот, Россия). Этот этап децеллюляризации осуществлялся в течение 48 ч при +37°С в условиях постоянного перемешивания.

Второй этап децеллюляризации заключался в разрушении нуклеиновых кислот, содержащихся в образцах. Для этого использовались растворы ДНКазы в концентрации 150 мкг/мл и РНКазы в концентарции 100 мкг/мл (БиоЛот, Россия) вместе с раствором 50 ммоль хлорида магния (MgCl2) (БиоЛот, Россия) и 0,2% ЭДТА. В качестве пермеабилизатора в раствор добавлялся 0,1% Тритон Х-100 (Sigma, США). Этап разрушения нуклеиновых кислот проводился в течение 24 ч при +37°С в условиях постоянного перемешивания [6].

Третий этап децеллюляризации – отмывка образцов от реагентов и клеточного дебриса. Для этого участки аорты и створки аортального клапана последовательно помещались в 3 стерильные емкости по 50 мл с ФСБ Ca-/Mg- (время экспозиции в каждой из них – 15 мин при комнатной температуре), а затем переносились в емкость с 50 мл ФСБ Ca-/Mg- на 24 ч при +4°С в условиях постоянного перемешивания [6]. Хранение тканей производили в растворе ФСБ Ca-/Mg- с добавлением антибиотиков в комбинации, описанной выше.

Гистологическая и иммуногистохимическая оценка Участки исследуемых тканей помещали в 4% формалин на 4 ч, дегидратировали в спиртах и заливали в парафиновые блоки по стандартной программе на автоматическом тканевом процессоре Leica TP 1020 (Leica, Германия). С помощью микротома делали серии поперечных срезов тканей толщиной 5 мкм. Для определения равномерности проведённой децеллюляризации исследовали срезы, выполненные по краям и в центре препарата.

Гистохимическое исследование.

Изготовленные срезы депарафинировали и окрашивали гематоксилином и эозином для общей оценки препарата и визуализации ядер клеток. Оценивалось количество сохраненных ядер в исследуемых образцах тканей по сравнению с контролем, а также наличие повреждений и целостности экстрацеллюлярного матрикса. Изучение микропрепаратов проводится на световом микроскопе Leica DM1000 с фотокамерой с увеличением от ×10 до ×1000 (Leica, Германия). Эффективность децеллюляризации оценивали по количеству ядер, оставшихся после обработки тканей, по сравнению с контрольной створкой аортального клапана или участком аорты того же донора. Также оценивалось наличия или отсутствия повреждений, разрывов, пустот экстрацеллюлярного матрикса по сравнению с контролем.

Иммуногистохимическое исследование. Использовали непрямой двойной метод визуализации EnVision (Dako, Дания). В качестве первичных антител применяли моноклональные антитела к антигенам CD34 (PECAM-1) и к α-гладкомышечному актину (α-SMA) (Dako, Дания). Иммуногистохимические препараты дополнительно докрашивали гематоксилином. Изучение микропрепаратов проводится на световом микроскопе Leica DM1000 с фотокамерой с увеличением от ×10 до ×1000 (Leica, Германия). Позитивная окраска тканей считалась неудовлетворительным эффектом децеллюляризации, негативная окраска свидетельствовала об эффективной и успешной децеллюляризации.

Флуоресцентное исследование. Для оценки наличия нуклеиновых кислот в образцах тканей использовали реакцию с DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид), тропным к ДНК и РНК фрагментов нефиксированных тканей в проходящем поляризованном свете. Контрольные и децеллюляризированные створки аортального клапана отмывались от красителя в ФСБ Ca-/Mg-, децеллюляризированные створки аортального клапана окрашивались раствором красителя в течение 20 мин, после чего снова отмывались. Отсутствие характерного свечения ядер клеток в поляризованном свете считалось удовлетворительным эффектом выполненного протокола децеллюляризации.

Результаты и обсуждение Поиск эффективного протокола децеллюляризации

В процессе нашей работы стало понятно, что часто описываемые в литературе протоколы децеллюляризации, основанные на использовании детергентов [6–11] (первый этап), не способны полностью элиминировать клетки из структур створки клапана и стенки аорты. В поисках эффективного протокола децеллюляризации мы проводили определение минимально необходимых концентраций и времени воздействия реагентов для достижения эффекта децеллюляризации и оценивали клеточный состав тканей путем подсчета оставшихся ядер клеток при их окраске гематоксилином и эозином, а также с использованием других методов, описанных выше.

За основу была взята методика, описанная E. Rieder в 2005 г. [6]. В этом исследовании на первом этапе децеллюляризации створки аортального клапана и участка аорты использовался только 0,05% раствор дезоксихолата натрия (протокол 1, табл. 1). Мы апробировали данную методику, однако полученные результаты показали, что в структуре створки аортального клапана и участках аорты сохранялось до 90% ядер клеток, что является неудовлетворительным результатом. Поэтому была проведена модификация протокола децеллюляризации.

Вначале мы решили увеличить концентрацию дезоксихолата натрия и проверить модифицированный метод на створке аортального клапана. Нами были опробованы протоколы с увеличением концентрации используемого детергента в 2, 4 и в 10 раз (протокол 2, табл. 1), но они не привели к желаемому результату: по-прежнему при окраске обзорными красителями в структуре створки аортального клапана и стенке аорты сохранялось около 80–90% ядер клеток. Использование гипотонического 0,45% раствора хлорида натрия или дистиллированной воды (протокол 3, табл. 1) в качестве веществ, вызывающих осмотический шок и лизис клеток, в течение 6 и 12 ч перед обработкой детергентом также не имело результата.

В процессе дальнейшего поиска эффективного протокола децеллюляризации створки аортального клапана, несмотря на имеющиеся указания в литературе о негативном влиянии раствора додецилсульфата натрия и раствора трипсина на свойства матрикса [12–14], было решено попробовать протоколы с их использованием. Были апробированы методы децеллюляризации створки аортального клапана с использованием комбинации растворов додецилсульфата натрия и дезоксихолата натрия в концентрациях 0,05%, 0,075% и 0,1%, с добавлением и без добавления 0,05% раствора трипсина. Также на первом этапе обработки тканей мы добавили 0,2% раствор ЭДТА. Оказалось, что использование трипсина в концентрации 0,05% в течение 3 ч ускоряет процесс удаления клеток из структуры створки аортального клапана, а последующая обработка створок аортального клапана 0,05% раствором детергентов и 0,2% ЭДТА в течение 48 ч (протокол 4, табл. 1) приводит к полной децеллюляризации. Однако при этом отмечалось повреждение матрикса створки аортального клапана: «разрыхление» структуры створки и увеличение промежутков между слоями по сравнению с контролем (рис. 2Б). При этом использование 0,05% раствора детергентов с 0,2% ЭДТА без предварительной обработки трипсином (протокол 5 , табл. 1) не приводило к удалению клеток из структуры створки аортального клапана (рис. 2В).

Использование детергентов в концентрации 0,075% (протокол 6, табл. 1) в сочетании с 0,2% ЭДТА в ряде случаев сопровождалось полной децеллюляризацией створки аортального клапана, при этом предварительная обработка 0,05% раствором трипсина в течение 3 ч была необязательна (рис. 2Г).

Использование детергентов в концентрации 0,1% (протокол 7, табл. 1) в сочетании с 0,2% ЭДТА вне зависимости от предварительной обработки створок аортального клапана 0,05% раствором трипсина приводит к полной децеллюляризации.

Таким образом, мы сделали вывод, что минимально достаточной концентрацией детергентов для достижения эффекта полной децеллюляризации является 0,05% в сочетании с 0,2% ЭДТА и предварительной обработкой 0,05% трипсином (протокол 4, табл. 1), либо необходимо использование 0,1% раствора детергентов и 0,2% ЭДТА без предварительной обработки трипсином (протокол 7, табл. 1, рис. 3).

Учитывая разрушающее влияние трипсина на матрикс, предпочтительным является использование комбинации додецилсульфата натрия и дезоксихолата натрия в концентрации 0,1% в течение 2 сут. с последующей обработкой раствором нуклеаз. Итоговый эффективный протокол децеллюляризации створки аортального клапана выглядит следующим образом:

Этап I (разрушение клеточных мембран): 0,1% додецилсульфат натрия + 0,1% дезоксихолат натрия + 0,2% ЭДТА в течение 48 ч при +37°С в условиях постоянного перемешивания.

Этап II (элиминация нуклеиновых кислот): ДНКаза 150 мкг/мл + РНКаза 100 мкг/мл + 0,2% ЭДТА + 50 ммоль MgCl2 + 0,1% Тритон Х-100 в течение 24 ч при +37°С в условиях постоянного перемешивания.

Этап III (отмывка матрикса от детергентов и клеточного дебриса): отмывка тканей в 3 стерильных емкостях с 50 мл с ФСБ Ca-/Mg-. Время экспозиции в каждой из них – 15 мин при комнатной температуре. Затем перемещение в емкость с 50 мл ФСБ Ca-/Mg- на 24 ч при +4°С в условиях постоянного перемешивания.

Хранение производится в растворе ФСБ Ca-/Mgс добавлением антибиотиков при +4°С.

Далее мы апробировали полученный эффективный протокол децеллюляризации створок аортального клапана для обработки участков восходящей аорты (протокол 1, табл. 2). При окраске гематоксилином и эозином препаратов стенки аорты, обработанной таким способом, была выявлена сохраненность ядер всех слоев сосуда. Учитывая тот факт, что минимально достаточные для децеллюляризации створки аортального клапана концентрации и комбинации детергентов не способны элиминировать клетки из структуры стенки восходящей аорты, мы приняли решение отказаться от единого протокола децеллюляризации створок аортального клапана и аорты, и проводить децеллюляризацию этих тканей по разным протоколам.

Приступив к поиску эффективного протокола децеллюляризации восходящей аорты, мы вновь использовали метод увеличения концентраций используемых детергентов. Было показано, что использование 1%, 2% и даже 3% растворов детергентов (протокол 2, табл. 2) не приводит к полной децеллюляризации стенки аорты. При этом отмечалось удаление клеток из интимы и адвентиции, но сохранение их в структуре медии (рис. 4Б).

Однако предварительное использование 0,5% трипсина с 0,2% ЭДТА в течение 5 ч в комбинации даже с небольшими концентрациями (0,1%) детергентов (протокол 3, табл. 2) способствовало более «глубокой» децеллюляризации, устранению клеток медии. При этом эффект повреждения внеклеточного матрикса, наблюдаемый во время использования трипсина в протоколе децеллюляризации створок аортальных клапанов, отсутствовал. Матрикс аорты, обладая более прочными свойствами, демонстрирует сохранность структуры после трипсинизации (рис. 4В). Использование 0,25% раствора трипсина также является эффективным в случае более длительной экспозиции.

Таким образом, итоговый протокол децеллюляризации аортальной стенки отличается от протокола децеллюляризации створок аортального клапана необходимостью предварительной обработки тканей 0,5% трипсином и 0,2% ЭДТА в течение 5 ч.

Иммуногистохимическое исследование

Окраска препаратов створки аортального клапана и стенки аорты, обработанных по нашим протоколам, на α-SMA и CD34, показала негативную реакцию исследуемых образцов по сравнению с контролем (рис. 5), что означает отсутствие в структуре децеллюляризированных тканей гладкомышечных волокон и эндотелиальных клеток.

Окраска DAPI

Окрашивание створок аортального клапана с помощью DAPI подтвердило отсутствие нуклеиновых кислот в их структуре. При этом в контрольной нативной створке определялось характерное свечение ядер в поляризованном свете (рис. 6).

Заключение

Многочисленные работы, посвященные проблеме децеллюляризации клапанов сердца, свидетельствуют о том, что единого «рецепта» для получения экстрацеллюлярного матрикса с оптимальными свойствами не существует. Очевидно, что минимизация воздействий на донорские ткани позволяет максимально сохранить их качества и приблизить аллографт по своим морфологическим, биомеханическим и гемодинамическим свойствам к нативному клапану. В числе подобных работ существуют и те, успехи которых позволили исследователям дойти до клинических испытаний и опробовать свой продукт в реальных операциях. Так, D. Gabbieri с соавт. (2007) опубликовали не только результаты успешного применения полученных в результате децеллюляризации аллографтов в операциях Росса у детей [15], но и удовлетворительные показатели работы этих клапанов спустя 10 лет после имплантации [16]. F.D. da Costa и соавт. (2005) сообщили об 11 успешно выполненных операциях Росса с использованием децеллюляризованных аллографтов, изготовленных по авторизированной технологии AutoTissue [17]. При этом техника децеллюляризации использует всего один детергент – дезоксихолат натрия [18].

Нам не удалось достичь желаемого результата с использованием одного детергента. Апробация различных протоколов децеллюляризации створок клапана аорты позволила нам сделать вывод, что минимально достаточной концентрацией детергентов для полного устранения клеток и клеточного дебриса из структуры створки аортального клапана и стенки восходящей аорты человека является 0,1% для дезоксихолата натрия и додецилсульфата натрия. Использование этих компонентов по отдельности даже в больших концентрациях и при большей экспозиции не приводят к желаемому результату. Единого протокола децеллюляризации створок аортального клапана и восходящей аорты нет [18–20]. Для достижения эффекта полной децеллюляризации восходящей аорты к протоколу децеллюляризации створок аортального клапана требуется добавить 0,5% раствор трипсина.

Для уточнения влияния предложенного метода на биомеханические свойства ткани и ее способности к рецеллюляризации in vitro и in vivo необходимы дополнительные исследования. Однако очевидно, что прогресс на данном этапе достижим.

Подняться вверх сайта