Поиск Кабинет

C-kit-позитивные клетки островков поджелудочной железы крысы как клетки-предшественницы эндокриноцитов при аллоксановом диабете

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 138-141

 

Авторы

Плюшкина А.С., Калигин М.С., Андреева Д.И., Титова А.А., Валеева И.Х., Демьянов А.В., Гумерова А.А., Киясов А.П.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

На сегодняшний день одним из наиболее перспективных маркёров клеток-предшественниц эндокриноцитов поджелудочной железы является рецептор фактора стволовых клеток C-kit или CD117, который участвует в дифференцировке этих клеток в эндокриноциты в пренатальном развитии и сохраняется у взрослого человека в клетках островков поджелудочной железы. Однако до сих пор остаётся неизученным участие C-kit+-клеток-предшественниц в восстановлении популяции клеток островков Лангерганса при сахарном диабете I типа. Поэтому целью исследования стало изучение динамики экспрессии С-kit в клетках островков поджелудочной железы крысы при экспериментальном аллоксановом диабете. Работа была проведена на 33 белых беспородных крысах самцах с экспериментальным диабетом, у которых определяли уровень глюкозы, инсулина и глюкагона в сыворотке крови, а также изучали эскпрессию С-kit, инсулина и глюкагона в ткани поджелудочной железы при экспериментальном аллоксановом диабете. В результате исследования уже на 1 сут. экспериментальной гипергликемии нами была обнаружена экспрессия C-kit в клетках островков поджелудочной железы, которая сохранялась на всех исследованных сроках. При этом клетки, имеющие на своей мембране C-kit, экпрессировали также инсулин и глюкагон. Таким образом, C-kit+-клетки, синтезирующие инсулин, могут способствовать коррекции нарушений углеводного обмена, возникающих при экспериментальном аллоксановом диабете.

Сахарный диабет I типа представляет собой хроническое заболевание, причиной которого является поражение эндокринной части поджелудочной железы (ПЖ), а именно β-клеток островков Лангерганса. В последнее время отмечается большой подъём заболеваемости сахарным диабетом [4]. Кроме того, сахарный диабет имеет большую социальную и экономическую значимость, поскольку приводит к ранней инвалидизации работоспособной части населения [4]. На сегодняшний день одним из основных методов лечения сахарного диабета I типа является заместительная терапия. Её суть сводится к постоянному введению в организм экзогенного инсулина или инсулиноподобных препаратов. Однако это не даёт гарантии отсутствия у пациентов осложнений диабета, ведущих к инвалидизации.

Весьма перспективным решением проблемы сахарного диабета может стать применение клеточных технологий, открывающих возможности этиологического лечения диабета за счет восстановления популяции β-клеток островков Лангерганса. Одна из основных проблем, затрудняющих применение стволовых клеток, заключается в их идентификации и выделении из-за отсутствия чётких сведений об их фенотипе. На сегодняшний день одним из наиболее перспективных маркёров клеток-предшественниц эндокриноцитов ПЖ является рецептор фактора стволовых клеток C-kit, или CD117. Ранее нами была показана его важная роль в пренатальном развитии островков ПЖ человека [1]. Однако значение C-kit при сахарном диабете I типа остаётся неизученным.

Регенерация β-клеток и островков ПЖ исследуется на различных экспериментальных моделях [2]. Наиболее близкой по патогенезу развития гипергликемии является модель диабета, вызванного введением аллоксана, который повреждает β-клетки островков ПЖ, не нарушая работу её внешнесекреторного аппарата [3]. В связи с этим целью исследования стало изучение популяции С-kit-позитивных клеток ПЖ крысы при экспериментальном аллоксановом диабете.

Материал и методы

Исследование проведено на 33 белых беспородных крысах самцах, которые были разделены на группы. Животным 1-й группы внутрибрюшинно вводили аллоксан (Sigma-Aldrich, США) в 1 мл 0,02 М ацетатного буфера рН = 4,0 в дозе 180 мг/кг, животным 2 группы вводили ацетатный буфер (контроль действия растворителя). Животным 3 группы ничего не вводили (норма). Через 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 28 сут. у животных забирали кровь для биохимического исследования, животных выводили из эксперимента и эксплантировали ПЖ для морфологического анализа. Парафиновые срезы ПЖ окрашивали иммуногистохимически с антителами к С-kit, инсулину – маркёру дифференцированных β-клеток – и глюкагону – маркёру дифференцированных α-клеток. Уровень глюкозы определяли в сыворотке крови глюкозооксидазным методом [5], уровень инсулина и глюкагона определяли методом иммуноферментного анализа.

Результаты

В крови крыс второй и третьей группы уровни глюкозы, инсулина и глюкагона сохранялись в пределах нормы. В ткани ПЖ морфологических изменений в этих группах не выявлено.

Через сутки после введения аллоксана в крови крыс 1 группы наблюдали повышение уровня глюкозы, что свидетельствовало о развитии гипергликемии. Уже на этом сроке в одиночных клетках островков ПЖ крыс мы выявили экспрессию C-kit (рис. А), и она сохранялась в этих клетках на всех исследованных сроках. В других клетках ПЖ экспрессии C-kit мы не наблюдали.

При изучении экспрессии инсулина через 2 сут. эксперимента было обнаружено явное уменьшение количества инсулин+-клеток по сравнению с нормой – они становились единичными (рис. Б). К 5–7 сут. число инсулин+-клеток приближалось к норме. Следовательно, после однократного введения аллоксана и вызванного этим повреждения β-клеток ПЖ возможно восстановление синтеза этого гормона. Данный вывод подтверждался снижением уровня глюкозы в крови начиная со вторых суток эксперимента и одновременным повышением уровня инсулина в крови на этом же сроке.

При исследовании экспрессии глюкагона мы наблюдали противоположную картину. В норме позитивное окрашивание на глюкагон в поджелудочной железе крысы наблюдается по периферии островков в одном-двух рядах клеток. На 2 и 3 сут. эксперимента количество глюкагон+-клеток возрастало. Глюкагон+-клетки располагались не только по периферии, но и занимали площадь практически всего островка (рис. В). Однако после 5 сут. в островках ПЖ крыс количество глюкагон+-клеток уменьшалось, они вновь располагались лишь по периферии. Такая морфологическая картина коррелировала с показателями уровня глюкозы и глюкагона в крови: на 2 сут. эксперимента уровни глюкагона и глюкозы в крови повышались, а после 3 сут. – снижались.

Интересно, что при сопоставлении результатов морфометрических исследований серийных срезов, окрашенных на инсулин и глюкагон, оказалось, что в островках некоторых образцов сумма площадей инсулин+- и глюкагон+-частей островка была более 100%. Такие показатели могут быть связаны с тем, что при экспериментальном диабете в островках появляются клетки, одновременно синтезирующие оба гормона – инсулин и глюкагон, и области окрашивания перекрываются. Это предположение было подтверждено при двойном окрашивании на инсулин и глюкагон (рис. Г).

При окрашивании серийных срезов на глюкагон и C-kit мы обнаружили, что C-kit+-островки и глюкагон+-островки имели сходную форму и одинаковую локализацию. При проведении двойного окрашивания на С-kit и глюкагон мы обнаружили C-kit+/глюкагон+-клетки (рис. Д). При анализе серийных срезов, окрашенных на C-kit и инсулин, подобной закономерности выявлено не было. Однако проведение двойного окрашивания на инсулин и C-kit позволило обнаружить единичные C-kit+/инсулин+клетки (рис. Е).

Таким образом, C-kit+-клетки островков ПЖ могут участвовать в коррекции морфологических изменений в островках и уровня глюкозы в крови крысы при экспериментальном аллоксановом диабете путём дифференцировки в β-клетки через стадию глюкагон-продуцирующих клеток.

Обсуждение

На основании полученных результатов мы предполагаем, что восстановление популяции β-клеток происходит следующим образом. После повреждения β-клеток в крови повышается уровень глюкозы, что является стимулом для активации стволового компартмента островков. На мембране клетокпредшественниц островков появляется С-kit, который связывается со своим лигандом – фактором стволовых клеток, что запускает процесс дифференцировки C-kit+-клеток. При этом процесс дифференцировки происходит через стадию C-kit+/глюкагон+-клеток. Далее C-kit+-клетки начинают синтезировать глюкагон и инсулин, и постепенно эти клетки становятся только инсулин-продуцирующими. Самое интересное, что эта последовательность дифференцировки C-kit+-клеток очень напоминает пренатальное развитие эндокриноцитов поджелудочной железы человека, когда C-kit+-клетки протоков ПЖ начинают сначала синтезировать глюкагон с 8,5 нед. гестации, а затем в этих же клетках появляется инсулин. При этом в островках также имеются C-kit+клетки, одновременно синтезирующие глюкагон и инсулин [1]. Таким образом, результаты нашего исследования опровергают данные о том, что развитие популяций β- и α-клеток происходит независимо друг от друга [6]. Наоборот, они подтверждают существование одной общей клетки-предшественницы β- и α-клеток островков ПЖ [7]. По мере дифференцировки эндокринных клеток количество C-kit на мембране уменьшается, и образуются дифференцированные эндокриноциты.

Обнаружение одной клетки-предшественницы для β- и α-клеток ПЖ, которая сначала синтезирует глюкагон, а затем и инсулин, требует дальнейшего изучения и пересмотра патофизиологических основ развития сахарного диабета I типа. Данный факт позволяет предположить, что при сахарном диабете I типа гипергликемия является следствием не только недостатка инсулина, но и избытка глюкагона. То есть клетки-предшественницы начинают дифференцироваться, чтобы восполнить недостаток инсулина. Однако при этом они сначала начинают синтезировать глюкагон, который еще более усугубляет ситуацию. То, что C-kit+-клетки способны дифференцироваться в α- и β-клетки ПЖ позволяет утверждать, что именно этот маркёр действительно характерен для клеток-предшественниц эндокриноцитов, что открывает перспективы для разработки новых методов лечения сахарного диабета I типа путём трансплантации C-kit+-клеток ПЖ, которые будут синтезировать гормоны и корректировать нарушения углеводного обмена. Кроме того, поскольку C-kit – это трансмембранный рецептор, то он является наиболее привлекательным и перспективным маркером с точки зрения выделения этих клеток для последующего культивирования и трансплантации.

Подняться вверх сайта