Поиск Кабинет

Биопластический материала на основегиалуроновой кислоты как матрица для создания биомедицинских клеточных экспресс-продуктов для восстановления кожи

Гены & Клетки: Том IX, №2, 2014 год, стр: 68-75

 

Авторы

Калмыкова Н.В., Спичкина О.Г., Эллиниди В.Н., Рахматуллин Р.Р., Моисеев С.И.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Представлены результаты исследования возможностей совмещения фибробластов и кератиноцитов кожи человека на биопластическом материале «G-DERM». Определена жизнеспособность и пролиферативная активность клеток кожи на матрице, а также секреция клетками кожи интерлейкина-6 и фактора роста кератиноцитов на разных сроках культивирования. Было показано, что «G-DERM» не является токсичным для клеток кожи обоих типов, обеспечивает их адгезию и распластывание. Гистологический анализ продемонстрировал, что свойства и пористая структура матрицы обеспечивают распределение клеток в соответствии с клеточным типом. Фибробласты в составе матрицы, находясь в состоянии покоя, сохраняют свою синтетическую активность, секретируя характерные для них биологически активные факторы – регуляторы раневого заживления. Результаты выполненной работы позволяют рассматривать материал «G-DERM» как трехмерный клеточный носитель для целей регенеративной медицины.

Введение

Кожа является наибольшим по площади поверхности органом человека, ее обширные повреждения приводят к драматическим последствиям и требуют незамедлительного закрытия и восстановления нормальной структуры и функций. Наилучшие результаты достигаются при использовании аутогенной или донорской кожи, однако основной проблемой является ее нехватка или недоступность. В качестве альтернативы рассматривают тканеинженерные продукты, содержащие различные клетки кожи. Тканевая инженерия как часть регенеративной медицины начала свое успешное распространение именно с создания тканевых аналогов кожи – эпидермального эквивалента «Epicell» (Genzyme Biosurgery, США) и полного эквивалента кожи «Apligraf» (Organogenesis Inc., США). В настоящее время существует большое разнообразие продуктов, являющихся кожными эквивалентами; оно основано на использовании различных типов клеток, разнообразных матриц и их сочетаний [1, 2].

Первые кожные тканеинженерные продукты создавали, стараясь в основных чертах воспроизвести строение кожи, поэтому процесс «созревания» такого продукта с формированием стратифицированного эпидермиса был длительным, трудоемким и затратным. В настоящее время специалисты сходятся во мнении, что основное действие, которое продукты с использованием клеток оказывают на раны, заключается в стимуляции репаративных процессов за счет секреции различных факторов (цитокинов, матриксных белков и протеаз). Поэтому затраты на создание сложных тканеинженерных продуктов не всегда оправданы и на рынке появились такие экспресс-продукты, как спреи на основе клеток кожи (линейка продуктов «CellSpray» (Avita Medical, Австралия)) или суспензии клеток в фибриновом клее (продукт «BioSeed-S» (BioTissue Technologies, Германия)). Однако, будучи нанесенными на рану, клетки сами нуждаются в условиях, обеспечивающих их жизнеспособность и функционирование, а именно: влажная среда и механическая защита. Это требует специфического послеоперационного ведения раны (использование неадгезивных повязок, создание влажной камеры, исключение механического травмирования) и является очередным лимитирующим фактором широкого распространения данных технологий. В этой связи нам представляется оптимальной технология использования в качестве носителей для клеток кожи биопластических материалов. Биопластические материалы – это новая группа раневых покрытий, которые разрабатываются на основе макромолекулярных полимеров с учётом следующих критериев: морфологическое сходство с эквивалентными тканями организма; заданный период биодеградации естественными метаболическими путями; способность поддерживать ключевые физико-химические параметры газообмена и гидробаланса, а также обеспечивать оптимальные условия для адгезии, миграции и пролиферации трансплантируемых клеток.

Целью настоящего исследования было тестирование биопластического материала «G-DERM» (ДЖИ-Групп, Россия) для последующего создания биомедицинского клеточного продукта. Материал «G-DERM» представляет собой биополимер на основе гидроколлоида гиалуроновой кислоты и адгезивного пептидного комплекса (Arg-Gly-Asp) [3]. Материал «G-DERM» соответствует большинству требований, предъявляемых к раневым покрытиям: нетоксичен, проницаем для влаги и газов, механически прочен и эластичен, при этом обладает заданным периодом биодеградации и выраженной адгезией к подлежащим тканям [4, 5]. Данные характеристики делают «G-DERM» подходящими кандидатом для использования в качестве основы при создании клеточного экспресс-продукта для восстановления кожных покровов.

Материал и методы

Выделение и культивирование клеток кожи человека. Клетки были получены из биоптатов кожи здоровых доноров, полученных в ходе проведения пластических операций. Фибробласты выделяли путем ферментативной обработки кожи с использованием 0,1% раствора коллагеназы (Панэко, Россия) с последующим стандартным культивированием в среде DMEM с 10% сыворотки эмбрионов (плодов) коров (Hyclone, США), содержащей смесь пенициллина/ стрептомицина (100 мкг/мл) (Hyclone, США). Пассировали клетки с использованием 0,25% раствора трипсина в 0,02% ЭДТА (Hyclone, США). В эксперименте использовали фибробласты взрослых доноров на 4–6 пассажах культивирования.

Кератиноциты человека были выделены ферментативным методом с использованием смеси ферментов 0,5% диспазы (Gibco, США) и 0,05% коллагеназы (Панэко, Россия). После разделения эпидермиса и дермы по линии базальной мембраны, эпидермис обрабатывали 0,25% раствором трипсина и 0,02% ЭДТА (Hyclone, США) до получения суспензии клеток. Клетки высевали на предварительно сформированный фидерный слой фибробластов. Для формирования фидерного слоя фибробласты за сутки до посева кератиноцитов высевали на чашки Петри с плотностью 10 тыс./см2. Так как конечной целью исследования было сформировать на матрице слой синтетически и пролиферативно активных клеток обоих типов, то фибробласты перед посевом не облучали и не обрабатывали митомицином С. Кератиноциты культивировали в специализированной бессывороточной среде с ростовыми добавками для кератиноцитов «Defined keratinocytes-SFM» (Invitrogen, Великобритания).

Формирование трехмерных эквивалентов кожи. Для формирования трехмерных эквивалентов кожи в качестве носителя использовали «G-DERM» (далее по тексту-матрица) или фибриновый гель, заселенные фибробластами. Фибриновый гель готовили из плазмы крови человека при добавлении тромбина 5 МЕ/мл (Ренам, Россия). Фибробласты вносили в гель/на матрицу в концентрации 100 тыс./мл. На следующие сутки на поверхность эквивалентов высевали клетки первичной культуры кератиноцитов в концентрации 1×106/мл.

Оценка жизнеспособности и пролиферативной активности клеток кожи. Жизнеспособность и пролиферативную активность клеток кожи оценивали колориметрическим методом с использованием МТТ (- 3-(4, 5-диметил-2-тиазолил)-2, 5-дифенил2H-тетразолия бромид) (Sigma, США). Для определения жизнеспособности фибробластов клетки высевали на чашки Петри в концентрации 20 тыс./см2, кератиноциты первичной культуры высевали в концентрации 250 тыс./см2 на предварительно сформированный фидерный слой фибробластов. Через определенные промежутки времени в среду культивирования добавляли раствор ММТ (0,5 мг/мл). Жизнеспособность оценивали визуально по формированию в цитоплазме клеток различимых окрашенных кристаллов формазана.

Для определения пролиферативной активности культуру фибробластов инкубировали с МТТ в течение 4 ч при 37°С в СО2-инкубаторе. Клетки промывали PBS и добавляли DMSO (Sigma, США). После полного растворения формазана (30 мин) производили измерение оптической плотности раствора при длине волны 540 нм.

Гистологические и иммуногистохимические исследования. Гистологические и иммуногистохимические исследования проводили на парафиновых срезах. Образцы эквивалентов кожи фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, проводили стандартную проводку в изопропаноловом спирте с последующей заливкой в парафин. Для гистологического исследования срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование проводили полимерным методом с использованием набора полимера Novolink Min Polymer Detection System (Leica Biosystems, Германия). Наличие в клетках виментина – маркера клеток соединительнотканного происхождения – и панцитокератина – маркера эпителиальных клеток – определяли с применением мышиных антител к виментину (Primary antibody Vimentin, Clone SRL 33, Leica Biosystems, Германия) и панцитокератину (Primary antibody Multi-Cytokeratin, Clone AE1/AE3, Leica Biosystems, Германия). Результат реакции проявляли хромогеном диаминобензидином (DAB из набора Novolink Min Polymer Detection System), препараты докрашивали гематоксилином и заключали под покровное стекло. Исследование препаратов проводили при помощи прямого микроскопа Leica DM. Определение цитокинов в среде культивирования. Секрецию ростовых факторов и цитокинов в среде культивирования оценивали методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) согласно инструкции производителей наборов. В работе использовали наборы для определения фактора роста кератиноцитов (ФРК) (Human KGF Quantikine ELISA Kit (R@D, США), набор для определения интерлейкина-6 (ИЛ-6) и интерлейкина-10 (ИЛ-10) (Цитокин, Россия).

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ Microsoft Excel и Statistica 10.0 с использованием параметрических критериев. Результаты представлены в виде значений средних арифметических и стандартных отклонений.

Результаты

Оценка жизнеспособности клеток кожи на матрице. «G-DERM» представляет собой тонкую хрупкую пергаментнообразную пленку, стерильную, хорошо смачиваемую жидкостями. После контакта с водой она становится эластичной. Структура матрицы (пористая, волокнистая) и свойства делают ее непрозрачной, что усложняет визуализацию адгезировавшихся клеток без их предварительной окраски. В качестве красителя был выбран МТТ, который позволяет одновременно оценивать жизнеспособность клеток и окрашивать клетки без фонового прокрашивания самой матрицы. «G-DERM» имеет две разные поверхности: гладкую, обращенную к внешней среде, и шероховатую, обращенную к ране. Клетки высевали на шероховатую поверхность. В качестве контроля использовали культивирование клеток кожи на пластике (Nunc, Дания). Наблюдения показали, что фибробласты, прикрепившиеся к поверхности матрицы, распластываются с характерной для данного типа клеток морфологией и остаются живыми на всем сроке испытания (до 7 сут.) (рис. 1).

Кератиноциты начинают свой рост из агрегатов и растут в виде колоний. В контрольном варианте на фидере из фибробластов колонии легко различимы по округлой морфологии эпителиальных клеток, формирующих «булыжную мостовую» (рис. 2А). В то же самое время кератиноциты на матрице остаются, по-видимому, в виде суспензии и гибнут, что определяется отсутствием эпителиальных клеток, окрашенных МТТ (рис. 2Б). При этом фибробласты фидерного слоя к 5 сут. культивирования на матрице остаются живыми и сохраняют характерную для них веретеновидную морфологию. Окраска МТТ не позволяет четко различить два типа клеток кожи: кератиноциты и фибробласты, – т. к. сам МТТ реагент приводит к постепенному изменению морфологии клеток (округлению). Чтобы сделать окончательный вывод о поведении клеток кожи на «G-DERM», провели гистологические и иммуногистохимические исследования.

Оценка пролиферативной активности фибробластов. Как видно на графике оптической плотности (рис. 3), фибробласты в контроле активно пролиферируют, демонстрируя достоверный прирост клеток каждые двое суток, при этом значения оптической плотности раствора, отражающие количество клеток на матрице, за 7 сут. культивирования не изменились. На основании этих данных можно сделать вывод, что «G-DERM» не способствует активному размножению фибробластов кожи.

Гистологические и иммуногистохимические исследования. Биопластический материал «G-DERM» имеет толщину 350 мм и пористую структуру и может рассматриваться как матрица для трехмерного культивирования. В качестве контроля поведения клеток в трехмерной матрице использовали фибриновый гель. Как видно на гистологическом препарате (рис. 4А), фибриновый гель с клетками кожи представляет собой классический пример полного эквивалента кожи, так как в основных чертах воспроизводит ее гистологическое строение. Полный эквивалент состоит из двух слоев – дермального, сформированного из геля и фибробластов, и эпидермального слоя, сформированного в результате дифференцировки и стратификации эпидермальных клеток. В эпидермальном слое видны многочисленные клетки с пикнотическими ядрами и гипертрофированные клетки с разрушенными ядрами, что отражает нормальную картину клеток, проходящих терминальную дифференцировку (рис. 4Б). При этом на границе с гелем видны растущие кератиноциты с четко очерченными ядрами, формирующие колонию. На этом же самом сроке (7 сут.) гистологическая картина клеток кожи на матрице «G-DERM» сильно отличается (рис. 5А). При сохранении дермального слоя, в данном варианте отсутствует многослойный пласт кератиноцитов. Эпидермальный слой представлен отдельными мелкими агрегатами, среди которых можно наблюдать только клетки с пикнотическими или разрушенными ядрами (рис. 5Б). Эти агрегаты могут быть как результатом клеточной дифференцировки, так и результатом гибели клеток после посева. Для того, чтобы подтвердить распределение клеток кожи в образцах, было произведено имуногистохимическое окрашивание с использованием антител к виментину и панцитокератину.

Распределение маркеров соответствует характеру расположения клеточных типов в трехмерных образцах: виментин преимущественно выявляется в клетках, распределенных по всей толщине образцов – фибробластах (рис. 6А и 7А), панцитокератин – в клеточных агрегатах и многослойных пластах на поверхности образцов – кератиноцитах (рис. 6Б и 7Б). При этом в препаратах «G-DERM» при окраске антителами на кератин, кроме агрегатов, выявляются участки, содержащие по несколько клеток, распластанных на поверхности матрицы (рис. 7Б). Очевидно, что это базальные кератиноциты, прикрепившиеся и распластавшиеся на поверхности матрицы, но не сформировавшие полного монослоя. Эти исследование показали, что клетки кожи, будучи посеянными на «G-DERM», распределяются характерным для их клеточного типа способом: фибробласты проникают в толщу матрицы, кератиноциты распластываются на ее поверхности.

Определение секреции цитокинов.

Предварительный анализ данных показал, что ФРК выявляется только в вариантах с фибробластами, но не с кератиноцитами. Количество ФРК, синтезируемое фибробластами в контроле (пластик) и на матрице через сутки культивирования не различаются (68±2,8 и 68±20,4 пг/мл соответственно) (рис. 8). К трем суткам культивирования наблюдается тенденция к увеличению концентрации в обоих вариантах, однако эти значения статистически не достоверны (79±13,6 и 103±16,8 пг/мл соответственно).

Анализ данных секреции ИЛ-6 показал, что наибольшие значения ИЛ-6 определяются в вариантах с фибробластами (рис. 9), но не кератиноцитами. При этом разницы между матрицей и контролем нет (1070±10,0 и 1110±17,3 пг/мл соответственно), также нет разницы между 1 и 3 сут. культивирования. По-видимому, при данной плотности посева фибробластов, уже к первым суткам культивирования достигается максимум концентрации интерлейкина. В контрольном варианте кератиноцитов на фидере на первые сутки культивирования в среде появляется детектируемый уровень ИЛ-6 (40±17,3 пг/мл), который увеличивается к третьим суткам до 193±51,3 пг/мл, однако его количество существенно ниже вариантов с одними фибробластами. Данные различия вполне объяснимы. В качестве фидерных клеток фибробласты сеяли в плотности в 10 раз ниже плотности, используемой в других вариантах, соответственно, при начальном низком уровне цитокина, его значение в среде по мере роста клеток постепенно нарастало. В аналогичном варианте с матрицей ИЛ-6 не обнаружен.

В среде культивирования клеток кожи, вне зависимости от варианта (матрица, контроль, сроки, комбинация клеток) ИЛ-10 не выявлен. ИЛ-10 использовали в качестве негативного контроля, его секреция присуща клеткам кроветворного ряда (моноцитам и лимфоцитам).

Таким образом, при культивировании клеток кожи на биопластическом материале «G-DERM» выявлена секреция фибробластами двух цитокинов – ФРК и ИЛ-6. При этом уровень секреции данных цитокинов не отличается в вариантах фибробластов, посеянных на культуральный пластик и на матрицу.

Обсуждение

Использование клеток кожи для восстановления кожных покровов является признанным и широко используемым методом в лечении ожогов, трофических язв и других кожных ран [6–8]. Разработка продуктов с использованием клеток кожи идет в двух направлениях – в направлении усложнения состава и упрощения применения базовых продуктов. Усложнение заключается в максимальном приближении тканеинженерных продуктов по клеточному и внеклеточному составу к строению нормальной кожи с их предварительной васкуляризацией [9–12]. Полагают, что усложнение технологии должно окупиться получением результата, сравнимого с трансплантацией донорской кожи. Упрощение технологии идет по пути минимизации расходов, времени и используемых компонентов и основано на понимании механизмов действия клеточных продуктов. В таких экспресс-продуктах используют один-два типа клеток; эпидермальные клетки часто используют в виде первичной культуры или с минимальным сроком культивирования [13–16]. В настоящем исследовании использовали протокол смешанной культуры кератиноцитов и фибробластов (в соотношении 10 к 1) без предварительного культивирования эпидермальных клеток и без облучения фидерных клеток [17, 18]. В такой системе фибробласты выступают, с одной стороны, как фидерные клетки для кератиноцитов, с другой стороны, как самостоятельные полноценные биологически активные агенты. Биопластический материал «G-DERM» (на основе гидроколлоида гиалуроновой кислоты и особого пептидного комплекса) продемонстрировал высокую клиническую эффективность при лечении длительных и рефрактерных к традиционной терапии трофических язв на фоне варикозной болезни и сахарного диабета I типа, а также при термических травмах [19, 20]. Гиалуроновая кислота является одним из элементов внеклеточного матрикса соединительной ткани, сама кислота и ее производные активно используют при создании тканеинженерных продуктов, в том числе и с клетками кожи [21]. Так, итальянская фирма Fidia Advased Biopolymers производит два вида продуктов для оптимизации заживления кожных ран: эпидермальный аналог «Laserskin» в виде пористой мембраны с растущими кератиноцитами и дермальный эквивалент «Hyalograft 3D» в форме геля, заселенный фибробластами.

В целях клинического использования достаточно 1–2 сут., чтобы получить готовый экспресс-продукт из свежевыделенных или криоконсервированных клеток. В нашем исследовании фибробласты на матрице на всем сроке испытания (до 7 сут.) оставались жизнеспособными, но находились в состоянии покоя. В норме в организме активно пролиферируют только клетки постоянно обновляющихся тканей, в том числе клетки эпидермиса, в то время как резидентные клетки дермы – фибробласты – находятся в состоянии покоя. Стимулом для пролиферации фибробластов может служить изменение нормального гомеостаза ткани, приводящее к изменению микроокружения, в частности, в процессе повреждение кожи. Перевод клеток в условия in vitro также является стимулом для активного размножения. К факторам, влияющим на размножение клеток, относятся практически все составляющие микроокружения, начиная от ростовых факторов и цитокинов, заканчивая элементами матрикса, их химией и архитектоникой. Поверхность культуральной посуды представляет собой модель двухмерного культивирования. Материал «G-DERM» предоставляет возможности одновременно как двухмерного, так и трехмерного культивирования (на поверхности и в толще матрицы). Особенностью «G-DERM» является его двухфазная система, при которой внутренняя сторона формирует гидроколлоид. По литературным данным, влияние гиалуроновой кислоты на клетки в культуре, в том числе на их пролиферацию, может быть в разных модельных системах прямо противоположным и определяется физико-химическими свойствами ее производных [22]. В классических работах F. Grinnel (2008) по поведению фибробластов в коллагеновом геле было показано, что пролиферативная активность и синтез белков внеклеточного матрикса напрямую зависят от сил натяжения в геле. При слабом натяжении фибробласты находятся в состоянии покоя, что соответствует состоянию клеток в «мягких тканях» в обычных условиях. Напротив, сильное механическое натяжение приводит к формированию стресс-фибрилл и активации фокальных киназ, результатом является стимуляция пролиферации и синтез и (или) ремоделирование белков матрикса [23]. Данное состояние отражает процессы, происходящие с фибробластами при заживлении ран. По-видимому, физические свойства гидроколлоида «G-DERM» не обеспечивают должных механических свойств и, соответственно, сигналов для клеточной пролиферации клеток. По этим показателям материал «G-DERM» будет неэффективен при создании полных эквивалентов кожи, так как не обеспечивает пролиферации кератиноцитов и, соответственно, формирования полноценного эпидермального слоя. С другой стороны, активное размножение клеток в матрице, предназначенной для трансплантации, и последующее размножение клеток в организме после трансплантации – явление неоднозначное с точки зрения онкобезопасности.

Известно, что клетки кожи в культуре синтезируют ряд биологически активных факторов: ФРФ (факторов роста фибробластов), ФРГ (фактор роста гепатоцитов), ФРТ (фактор роста тромбоцитов), ФРК, ТФР β (трансформирующий фактор роста бета), ИЛ-6, ИЛ-8 и другие [24–26]. При культивировании клеток кожи на материале «G-DERM» выявлена секреция фибробластами двух цитокинов – ФРК и ИЛ-6.

ФРК, известный также как ФРФ-7, экспрессируется клетками мезенхимного происхождения (фибробластами, мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками, гладкомышечными клетками и др.), оказывает паракринное действие на клетки эпителиального происхождения. Так, в частности, в коже ФРК синтезируется дермальными фибробластами и стимулирует процессы пролиферации и дифференцировки эпидермальных клеток. При раневом заживлении под влиянием факторов воспаления, таких как ИЛ-6 и ИЛ-1, происходит стимуляция секреции ФРК фибробластами [27]. ИЛ-6 продуцируется клетками лимфоидного и нелимфоидного происхождения, в том числе фибробластами и кератиноцитами. Являясь основным медиатором воспаления, он обладает множественным биологическим действием. Было показано, что ИЛ-6 вызывает пролиферацию кератиноцитов и его повышенная экспрессия связана с патологическими состояниями кожи [28]. В нашем исследовании синтез ИЛ-6 в варианте с кератиноцитами на матрице, в отличие от контроля, не обнаружен. Судя по контрольному варианту, присутствие цитокина в среде обеспечивается на данных сроках, по-видимому, только секреторной активностью фидерных фибробластов. Матрица имеет поры со средним размером 252,16±98,73 мкм, часть посеянных клеток пассивно проходит сквозь матрицу. Клеточные потери при изначально низкой плотности посева фидера могли сказаться на суммарном синтезируемом количестве цитокина в среде. Учитывать клеточные потери в образцах не представляется возможным, т. к. поры в матрице имеют гетерораспределение.

Таким образом, совместное действие ФРК и ИЛ-6 при их секреции клетками кожи в составе клеточных продуктов должны способствовать нормальному течению процессов раневого заживления, начиная с фазы воспаления и заканчивая эпителизацией раневой поверхности.

Результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что биопластический материал «G-DERM» является подходящим и доступным для использования в качестве матрицы для создания экспресс-продуктов на основе клеток кожи. Свойства и пористая структура покрытия обеспечивают прикрепление и распластывание клеток кожи не только на его поверхности, но и в толще, при этом клетки сохраняют свою жизнеспособность и синтетическую активность, секретирую характерные для них биологические факторы-регуляторы раневого заживления.

Подняться вверх сайта