Поиск Кабинет

Биологические свойства эндотелиальных клеток-предшественниц и их репаративный потенциал для клеточной терапии

Гены & Клетки: Том III, №4, 2008 год, стр.: 36-40

 

Авторы

Кескинов АА., Ерёмин И.И., Щербюк А.Н., Рагимов А.А., Насонов Е.Л., Быковская С.Н.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Высокая распространенность заболеваний, связанных с атеросклеротическим поражением сосудов нижних конечностей, их прогрессирующее течение, часто приводящее к инвалидизации, обуславливает потребность в дальнейшем совершенствовании не только хирургической помощи, но и консервативной и малоинвазивной терапии пациентов с данной патологией. Среди консервативных и малоинвазивных методов особое место занимает терапия стволовыми клетками-предшественницами эндотелия как многообещающий метод для лечения пациентов, которым оперативное лечение не может быть предложено в силу характера поражения сосудистых бассейнов либо соматического статуса. В статье рассмотрены биологические свойства эндотелиальных клеток-предшественниц, патофизиологические основы их применения для терапии поражения эндотелия, приведен опыт клинических исследований.

Эндотелий — важнейший компонент сосудистой стенки, состоящий примерно из 1013 эндотелиальных клеток и занимающий около 7 м2 по площади в организме взрослого человека [1]. Эндотелий сосудов представляет собой динамическую структуру на границе между кровью и окружающими тканями и выполняет множество функций: регулирует питание, трафик компонентов крови, продуцирует ряд важнейших регуляторных факторов, таких как простагландины и оксид азота [NO], препятствует адгезии тромбоцитов и лейкоцитов, участвует во многих физиологических процессах, протекающих в организме, в том числе в гемостазе, воспалении и ангиогенезе [1, 2]. Повреждение эндотелия приводит к потере сосудистой стенкой антитромботических свойств, быстрому увеличению числа циркулирующих поврежденных эндотелиальных клеток, что может являться первоначальным критическим этапом, инициирующим развитие атеросклеротической бляшки [3, 4].

Таким образом, вопросы изучения, характеристики и поиска подходов к регенерации поврежденного эндотелия имеют исключительную значимость для терапии широкого спектра заболеваний, таких как ишемия нижних конечностей, инфаркт миокарда, системная склеродермия и др.

Процесс образования новых кровеносных сосудов носит название неоангиогенеза. По традиционным представлениям считалось, что в постнатальный период ангиогенез идёт исключительно за счет пролиферации, миграции и трансформации полностью дифференцированных эндотелиальных клеток из стенки уже сформированных кровеносных сосудов [5, 6]. Однако зрелые эндотелиальные клетки — это терминально дифференцированные клетки с низким пролиферативным потенциалом, их способность замещать поврежденные эндотелиальные клетки и образовывать новые сосуды относительно ограниченна. Следовательно, в процессах восстановления эндотелия и ангиогенеза должны принимать участие другие клетки. Накопленные за последнее десятилетие знания показывают, что в крови взрослых людей содержатся клетки костномозгового происхождения по своим свойствам схожие с эмбриональными ангиобластами [7—10]. Эти клетки обладают способностью к дифференцировке в зрелые эндотелиальные клетки. Они были названы эндотелиальными клетками-предшественницами (ЭКП), а процесс образования из них кровеносных сосудов — васкулогенезом. Получены экспериментальные доказательства того, что эндотелиальные клетки-предшественницы экспрессируют эндоте-лий-специфические поверхностные маркеры (VEGFR, CD144, CD146, CD31 и др), обладают функциональными свойствами эндотелиальных клеток, принимают участие в поддержании целостности эндотелиальной выстилки сосудов и сосудистого гомеостаза [2, 11, 12], а также постнатальной неоваскуляризации в условиях ишемии in vivo [7, 8, 13-17].

Помимо прямого включения этих клеток в стенку сосуда, ЭКП обеспечивают также неоваскуляризацию и регенерацию тканей посредством синтеза сосудистых ростовых факторов, усиливающих локальный ангиогенез и вызывающих их дополнительную мобилизацию из костного мозга [18]. Клетки-предшественницы участвуют как в микроваскулярном ангиогенезе, так и в восстановлении эндотелия крупных сосудов [19—21].

Клетки-предшественницы эндотелия могут быть как гемопоэтического CD34+CD133+VEGFR+, так и мезенхимального происхождения. В терапевтических целях описано использование клеток обоих типов.

Гемопоэтические эндотелиальные клетки-предшественницы CD34^CD133'VEGFFt [ЭКП] Эти клетки можно получить из фракции мононукле-арных клеток костного мозга. Впервые ЗКП были выделены Т. Asahara с соавт. в 1997 г. из мобилизованной крови путем магнитной селекции, либо клеточного сор-тинга по характерному поверхностному маркеру CD34+. Помимо CD34+ нативные ЗКП экспрессируют на своей поверхности CD133 и VEGFR (рецептор фактора роста эндотелия сосудов). Но даже в очищенной популяции CD34+ клеток здоровых доноров количество ЗКП (CD34+CD133+VEGFR+) составляет несколько сотых долей процента [8, 22]. Поэтому используется культивирование in vitro CD34+ клеток в условиях, способствующих их дифференцировке в ЗКП. После культивирования подавляющее большинство клеток дифференцируются в ЗКП: меняется их морфология (клетки становятся вытянутыми), появляется экспрессия специфических для эндотелия маркеров (CD31, VEGFR2, vWF, Tie-2, E-selectin, CD144, CD146, CD184) и клетки приобретают способность связывать липопротеины низкой плотности (Dil—Ac—LDL, UEA—1), что является специфическим свойством эндотелиальных клеток [7, 8].

Основные условия, необходимые для эндотелиальной дифференцировки CD34+ клеток, заключаются в обязательном наличии субстрата: фибронектина или коллагена [23], а также среды с набором ангиогенных ростовых факторов. Срок культивирования составляет от 10 до 30 сут.

Способность ЗКП (CD34+) участвовать в восстановлении поврежденного эндотелия сосудов, а также образовывать новые функционально активные капилляры доказана в многочисленных экспериментальных работах [7, 8, 13—17, 24]. Вместе с тем, получение достаточного для терапевтического использования количества CD34+ у взрослого человека — трудоемкая и дорогостоящая процедура. Поэтому в настоящее время большое внимание уделяется поиску клеток-предшественниц негемопоэтического происхождения, способных дифференцироваться в эндотелий.

Мультипатентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК)

С целью получения эндотелий-подобных (endothelial-like) клеток используются ММСК и общая фракция мо-нонуклеарных клеток крови (МНЮ. Получение ММСК в необходимых для терапии количествах не представляет больших проблем. Кроме того, их довольно просто культивировать in vitro в течение достаточно длительного времени (более 20 пассажей), что позволяет увеличить их количество в 200—300 раз [25]. Срок культивирования составляет от 10 до 30 сут. и зависит от количества клеток, которое необходимо получить.

В настоящее время становится все более очевидным, что нативные ММСК и предифференцированные в эндотелиальные клетки способны принимать участие в восстановлении миокарда, повреженного в результате инфаркта, как за счет секреции проангиогенных цитокинов и антиапоптотических белков, так и за счет непосредственного замещения собой поврежденного эндотелия и мышечных клеток. В работе S.M. Nassiri с соавт. [26] сравнивается эффект трансплантации на восстановление миокарда после инфаркта недифференцированных ММСК и предифференцированных ММСК и их дифференцировка в клетки эндотелия. Инфаркт был смоделирован на кроликах путем перевязки передней левой коронарной артерии. Затем кроликам пересаживали дифференцированные и недифференцированные клетки. Контрольную группу составляли животные, которым вводили чистую культуральную среду. Через 28 сут. после трансплантации восстановление функции левого желудочка, усиление перфузии и уменьшение зоны инфаркта было обнаружено во всех группах, кроме контрольной. Статистически значимых отличий между группами, получившими дифференцированные или нативные ММСК, обнаружено не было.

Использование ММСК в терапевтических целях возможно сразу после экспансии. Но такой вариант может повлечь за собой осложнения. Поскольку ММСК — по-липотентные клетки, в организме они могут дифференцироваться в различные ткани: хрящевую, костную или жировую. Чтобы избежать дифференцировки в нежелательных направлениях, после экспансии in vitro проводят предифференцировку ММСК в эндотелий-подоб-ные клетки. Для этого в среду для экспансии добавляют ангиогенные ростовые факторы, включая VEGF, или полностью заменяют ее на специальную среду, содержащую набор факторов эндотелиальной дифференцировки. В большинстве случаев для культивирования достаточно 10—14 сут., после чего меняется морфология ММСК, клетки уплощаются, становятся более вытянутыми, начинают экспрессировать эндотелиальные (CD31, CD54, CD105, CD44, CD144, CD166, VEGFR) и гладкомышечные маркеры, такие как клеточный актин и десмин. Такая предифференцировка делает невозможной нежелательное развитие ММСК [25] и, следовательно, обеспечивает безопасность трансплантации эндотелий-подобных клеток больному.

Мононуклеарные клетки (МНК] костного мозга или мобилизованной крови

Трансплантация МНК — наиболее простой и доступный вариант клеточной терапии. Положительный эффект от такой терапии достигается при участии различных механизмов. Во-первых, МНК — это гетерогенная группа клеток, которые секретируют огромное количество цитокинов и ростовых факторов, что при локальном введении обеспечивает активацию и пролиферацию эндогенных стволовых клеток [18, 27]. Во-вторых, в составе МНК присутствуют в небольших количествах гемопоэ-тические и мезенхимальные стволовые клетки (в большей степени в МНК костномозгового происхождения), которые при локальном введении способны дифференцироваться в клетки эндотелия под воздействием факторов микроокружения. Положительный эффект терапии МНК сохраняется в течение 9—18 мес. [28—30]. Наиболее вероятной причиной ограниченного срока позитивных изменений является недостаточное количество стволовых клеток и клеток-предшественниц в составе мнк.

При культивировании МНК периферической крови можно выделить две популяции эндотелиальных кле-ток-предшественниц: ранние ЭКП и поздние (зрелые) ЭКП [1, 31, 32]. Обе субпопуляции происходят из мо-нонуклеарных клеток и экспрессируют эндотелиальные маркеры, но отличаются по своей морфологии и динамике роста [32, 33]. Ранние ЗКП имеют веретеновидную форму и большинство из них происходит из моноцитов (CD14+) [1, 18, 33, 34]. Поздние ЗКП, называемые так из-за позднего (20—30 сут.) их появления в культуре, формируют характерный вид культуры — «булыжную мостовую» и происходят из фракции CD14~CD34+ [31, 33]. Обе эти популяции характеризуются выработкой VEGF, экспрессией VEGF-рецептора (VEGFR), секрецией цитокинов и формированием капилляроподобных структур in vitro и in vivo [33].

Результаты пилотных испытаний безопасности и эффективности применения ЭКП для лечения заболеваний периферических сосудов Основным симптомом поражения периферических артерий является перемежающаяся хромота (ПХ). Прева-лентность ПХ составляет 3—10% в популяции, возрастая до 15—20% среди пациентов старше 70 лет. Факторами риска данного заболевания являются курение, диабет и артериальная гипертензия. У 40430% пациентов с заболеваниями периферических артерий имеются сочетанная цереброваскулярная патология, что увеличивает риск осложнений при оперативных вмешательствах.

Данные, полученные из крупных международных исследований, показывают, что в год на 1 млн людей производится 120^500 ампутаций конечностей. Около 1—3,3% от общего числа пациентов с ПХ нуждаются в таком виде лечения в течение 5 лет с момента постановки диагноза. В среднем у 25% пациентов заболевание носит прогредиентно-злокачественный характер — т.е. имеется высокий риск развития критической ишемии нижних конечностей.

Следует отметить, что способы общепринятой консервативной терапии не затрагивают основное патогенетическое звено заболевания — поражение эндотелия. Поэтому в последнее время все большее внимание уделяется методам, направленным на восстановление эндотелия, возобновление его функций и развитие коллатерального кровообращения. Таким методом является трансплантация аутогенных стволовых клеток, содержащих клетки-предшественницы эндотелия.

В целях терапевтического ангиогенеза используются как гемопоэтические, так и мезенхимальные стволовые клетки костного мозга и мобилизованной крови. Также рядом авторов сообщается об успешном применении фракции мононуклеарных клеток [29, 35—37].

Е. Tateshi-Yuyama с соавт. [35] было проведено пилотное исследование эффективности и безопасности применения аутогенных костномозговых мононуклеаров на 25 пациентах с ишемией одной конечности и 22 пациентах с ишемией обоих конечностей. По прошествии 4-х нед. у всех пациентов, которым были трансплантированы МНК, значительно повысился лодыжечно-плечевой индекс, чрескожное давление кислорода, уменьшились боли покоя и увеличилась дистанция безболевой ходьбы.

С помощью трансплантации стволовых клеток мо-нонуклеарной фракции периферической крови возможно успешное лечение пациентов с атеросклеротическим поражением артерий нижних конечностей [38]. По данным обследования 64 пациентов (34 из которых имели синдром диабетической стопы) в 87,1% случаев наблюдалось исчезновение болей в покое, у 40% пациентов отмечалось улучшение заживления язв стопы, лодыжечно^плечевой показатель увеличивался у 34,3% больных, чрескожное напряжение кислорода повысилось в 42,3% случаев.

Даже при наличии у больного тяжелой сочетанной патологии (почечной недостаточности, сахарного диабета) возможно успешное лечение серьезных атеросклеротических поражений периферических артерий [39]. После обследования 92 больных исследователи пришли к выводу о высокой эффективности применения аутогенных стволовых клеток мононуклеарной фракции периферической крови как средства лечения критической ишемии и стимуляции неоангиогенеза при III и более ранних стадиях заболевания по Фонтейн — Покровскому, отметив, однако, что в IV стадии эффективность метода снижалась.

Японские ученые [40] провели трансплантацию мононуклеарных клеток периферической крови дважды с разницей в 1 мес. 29 пациентам с облитерирующим атеросклерозом и облитерирующим тромбангиитом. Восьмидесяти процентам больных была рекомендована ампутация из-за длительно незаживающих язв, рефрактерных к проводимой терапии. У 50% пациентов имелась хроническая почечная недостаточность, в связи с чем им проводился гемодиализ 3 раза в нед. Результаты проведенного через год контрольного обследования выявили увеличение и сохранение на новом «позитивном» уровне дистанции безболевой ходьбы, практически полное исчезновение ишемических болей покоя у всех пациентов, улучшение заживления ишемических язв у 16 из 24 пациентов, увеличение лодыжечно-плечевого показателя в 31% случаев. Только трем пациентам (11,1%) пришлось произвести ампутацию.

Заживление трофических язв отмечено после аутологичной трансплантации МНК у 7 больных с критической ишемией нижних конечностей [29]. Для трансплантации были использованы МНК костного мозга, которые вводились внутримышечно в ишемизированные конечности. Оценка эффективности терапии проводилась с использованием субъективного индекса боли, пальцеплечевого индекса давления и заживления трофических язв по прошествии 6 мес. после терапии. Среднее количество введенных МНК составило 3,7x10° клеток. Осложнений отмечено не было. Через 6 мес. после трансплантации у всех больных значимо увеличился пальце-плечевой индекс, снизился болевой индекс и частично зажили язвы.

По похожей схеме было проведено исследование S. Durdu с соавт. в 2006 г. [36]. В исследование были включены 28 пациентов с облитерирующим тромбангиитом, страдающих критической ишемией нижних конечностей. У всех пациентов отмечались боли покоя и незаживающие ишемические язвы конечностей. После аутогенной трансплантации МНК костного мозга, в течение 16,6±7,8 мес. только одному больному потребовалась ампутация пальца ноги. У 8 пациентов по прошествии 3 мес. и 14 пациентов по прошествии 6 мес. наблюдалось достоверное повышение лодыжечно-плечевого индекса. Через 6 мес. после трансплантации у всех больных объективно уменьшились болевые ощущения, увеличилась дистанция безболевой ходьбы и повысилось качество жизни. Заживление трофических язв конечностей было отмечено в 83%, а у 78,5% больных наблюдалось развитие коллатеральных сосудов.

Авторы исследования сделали заключение об эффективности и безопасности применения аутогенных МНК костного мозга в целях терапевтического ангиогенеза.

Вопросу о различии в эффективности введения стволовых клеток мононуклеарной фракции периферической крови и стволовых клеток, полученных из костного мозга, посвящена работа P.P. Huang с соавт. [41]. В данном исследовании было задействовано 150 пациентов с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей. Равным по количеству группам больных вводили аутогенные стволовые клетки, полученные одним из упомянутых способов. При детальной оценке через 12 нед. после имплантации было выявлено, что в группе больных, где проводилась трансплантация аутогенных стволовых клеток костного мозга, отмечался более выраженный рост таких параметров, как лодыжечно-плечевой показатель, температура кожи, уменьшение болей в покое, однако при сравнении показателей чрескожного напряжения кислорода, скорости заживления язв, дистанции безболевой ходьбы и частоты ампутаций, существенного различия между двумя группами не наблюдалось. Это позволило авторам сделать вывод о целесообразности применения трансплантации аутогенных стволовых клеток, полученных из мононуклеарной фракции периферической крови как клинически более практичного метода.

В отдельных случаях улучшения клинического состояния тяжелых больных достичь не удается [37]. При сравнении результатов применения аутогенных МНК при облитерирующем тромбангиите и облитерирующем атеросклерозе по прошествии 4 нед. после трансплантации положительные изменения в клинической картине (ослабление болей, заживление язв) были отмечены только у больных с облитерирующим тромбангиитом, тогда как у больных, находящихся длительное время на гемодиализе, никаких изменений состояния отмечено не было. Наличие в анамнезе процедур гемодиализа, исходно тяжелое состояние таких больных вместе с небольшим (4^70x108) количеством вводимых клеток явились основой для несостоятельности клеточной терапии у больных с облитерирующим атеросклерозом, находящихся на хроническом гемодиализе.

Исследования ряда авторов [33, 42] показывают, что проангиогенный эффект, получаемый от введения моно-нуклеарных и CD34+ клеток-предшественниц эндотелия, обусловлен не их дифференцировкой в зрелые эндоте-лиоциты, а способностью модулировать состояние уже существующих сосудов. ЭКП и МНК активируют синтез N0 по зависимому от эндотелиальной-1МО-синтазы пути, вызывая вазодилатацию и диссоциацию комплекса эндотелий сосуда-кадгерин/р-катенин. В локусе ишемии данный процесс существенно увеличивает проницаемость стенки сосуда и приводит к насыщению ишемизированных тканей циркулирующими в крови факторами роста и восстановлению активности неполноценной (у данной категории пациентов) системы обратного регулирования ангиогенеза. В составе МНК присутствуют стволовые клетки из костного мозга (гемопоэтические и мезенхимальные), которые могут дифференцироваться в различные ткани, но их количество ничтожно мало (0,01^1%).

Непосредственное введение истинных ЭКП и/или фракции гемопоэтических стволовых клеток CD34+ (обогащенной ЭКП), является наиболее безопасным и терапевтически наиболее эффективным, несмотря на трудоемкость и высокую стоимость процедуры выделения и/или культивирования CD34+.

Впервые трансплантация CD34+ клеток при критической ишемии нижних конечностей была успешно проведена F.A. Kudo [43]. В группу исследования были включены двое больных, не поддающихся традиционным методам лечения. Суспензию CD34+ клеток получали из мобилизованной крови и вводили в ишемезированное бедро и икроножную мышцу в 50 точках. Концентрация CD34+ xx ветственно. Никаких осложнений после трансплантации отмечено не было. По прошествии двух недель было отмечено небольшое повышение чрескожного давления кислорода и появление новых капилляров по данным ангиографии. Этот метод был использован и в исследовании, проведенном в 2005 г. немецкими учеными из Лейпцигского университета [44]. Семь пациентов с критической ишемией, обусловленной окклюзивным поражением периферических артерий подверглись внутри-артериальным трансфузиям аутогенных циркулирующих клеток-предшественниц, взятых из периферической крови после стимуляции гранулоцитарным колониестимулирующим фактором. Согласно результатам исследования, функциональные показатели динамически улучшились. В частности, дистанция безболевой ходьбы увеличилась с 6 ± 13 метров до 195±196 метров. У одного пациента в начале исследования имелся некроз стопы, в связи с чем ему была произведена ампутация на 3-й нед. лечения, однако отмечено успешное заживление тканей. У остальных 6 пациентов отмечено значительное улучшение состояния тканей и явный регресс трофических изменений.

В настоящее время авторами (на базе Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова) проводится пилотное исследование по лечению облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей путем имплантации аутологичных CD34+ клеток мононуклеарной фракции мобилизованной крови.

Использование CD34+ и ММСК является новым перспективным направлением в клинической практике, уже принесшим определенные обнадеживающие результаты. Безусловно, необходимо дальнейшее проведение крупномасштабных рандомизированных исследований для структурирования показаний и выявления противопоказаний к данному методу лечения, который со временем способен занять достойное место в арсенале средств современного врача.

Подняться вверх сайта