Поиск Кабинет

Биофотонный механизм активации клеточных программ: колониеобразование в мягком агаре

Гены & Клетки: Том VII, №1, 2012 год, стр.: 92-96

 

Авторы

Владимирская Е.Б., Мильман В.Д.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В статье анализируется биофотонный механизм активации клеточных программ. Исследования были проведены на модели индукции пролиферации кроветворных предшественников в культуре и апоптоза мононуклеаров периферической крови ex vivo. В качестве индуктора пролиферации и ингибитора апоптоза использовали гранулоцитарный колониестимулирующий фактор в широком диапазоне доз, включая ультрамалые (гомеопатические) концентрации. На изучаемой модели была показана высокая эффективность воздействия малых и сверхмалых концентраций действующих веществ. Основная гипотеза заключается в том, что клетки и отдельные молекулы излучают волны, близкие к монохроматическим (т.е. обладают узким диапазоном частот излучения), а рецепторы клеток, со своей стороны, специфически воспринимают определенные монохроматические сигналы. При оценке интенсивности излучения необходимо учитывать законы распространения электромагнитных волн, в частности, конструктивную и деструктивную интерференцию, а также принципы фотонного излучения, лежащие в основе «биорезонансного поглощения» и формирования цепочки сигнального пути.

Жизнь и функциональная активность всех эукариотических клеток обеспечивается основными программами жизнедеятельности: пролиферация, дифференцировка, апоптоз. При этом апоптоз – основная из программ, которая включается множеством внутренних и внешних факторов. Осуществление других программ возможно только при ее блокировании. Современные достижения биохимии, молекулярной биологии и молекулярной генетики позволили определить основные этапы каждой из этих программ, молекулы, отвечающие за индукцию и проведение сигнала, а также транскрипционные факторы, обеспечивающие экспрессию определенных генов и связь между матричной ДНК и РНК-полимеразой. Внутриклеточные белки, экспрессируемые генами в результате реализации такого сигнального каскада, являются ключевыми для выполнения той или иной клеточной программы и определяют дальнейшую судьбу клетки. При этом решающую роль в выборе и реализации программы жизнедеятельности играет сама клетка. Это связано с тем, что пути активации сигнальных молекул в клетке многовариантны, затрансфокальной микроскопии и прижизненной визуализации [2, 3]. Жизненная важность сигнальных молекул подтверждается тем фактом, что из 26 383 известных генов человека 42% кодируют белки сигнального каскада (рецепторы, сигнальные молекулы, киназы, протоонкогены, ионные каналы и др.) [4].

Однако многие механизмы инициации и проведения внутриклеточных сигналов не поддаются расшифровке с позиций молекулярной биологии. Это становится очевидным при сопоставлении некоторых цифр: на поверхности клеток может быть экспрессировано от 10 до 100 тыс. молекул рецепторов, в формировании сигнальных путей участвуют около 4 тыс. молекул. Следует признать также, что при движении молекул внутри клеток им приходится преодолевать огромные относительно своих размеров расстояния: диаметр молекул порядка 2–10 нм, а диаметр клеток порядка 10 мкм и более. Закономерно возникают следующие вопросы:

– как молекулы сигнального каскада распознают и находят друг друга?

– что определяет направление движения внутриклеточных молекул при инициации и формировании сигнальных путей?

На эти вопросы трудно дать ответы с общепринятых позиций молекулярной биологии. Нужна другая парадигма.

Такой парадигмой может стать биофотонное энергетическое поле. В соответствии с этой гипотезой, окончательно сформулированной F. Popp и J. Chung в 1998 г., все живые объекты представляют собою открытые динамические системы, обменивающиеся информацией и энергией на всех уровнях; информация является формой энергетического обмена [5].

Изучение биоэнергетики началось почти столетие назад, прочно связано с именем A.Г. Гурвича, который в 1923 г. описал «митогенетические лучи», излучаемые делящимися клетками корней лука [6]. В многочисленных экспериментах было показано, что эти лучи, распространяясь горизонтально, при действии в течение 1–2 ч на расстоянии 1,5–2,0 мм от воспринимающих их делящихся корней лука другого образца, вызывают в последних прирост митотической активности на 20–25%. Позднее эти лучи были отнесены к UV спектру с длиной волны между 190 и 300 нм. «Золотой век» митогенетических лучей продолжался около двух десятилетий, по этим исследованиям были опубликованы около тысячи статей и несколько книг, затем интерес к этим работам постепенно угас и вновь возник в 50-х годах в связи с разработкой фотоумножителей (photomultiplier – PM tubes), способных улавливать и измерять очень слабый свет [7].

Использование фотоумножителей в последующие годы показало, что все растительные и животные объекты излучают энергию в очень широком диапазоне (180-1000 нм), перекрывающим ультрафиолетовый, видимый и близкий к IR спектры, с частотой 3×1014 – 1,6×1015 Гц [8]. Было также показано, что живые организмы могут утилизировать различные формы энергии, частично трансформируя ее в собственные энергетические запасы [9].

Изучение «информационного характера» ультраслабой фотонной эмиссии живых систем было стимулировано исследованиями F. Popp в 70-х годах [10]. Им же было введено понятие «биофотоны» и сформулировано положение о том, что электромагнитные взаимодействия используются для передачи необходимых сигналов, выполняя роль регуляторов биологических систем. При этом каждая внутриклеточная молекула характеризуется собственным спектром биофотонной эмиссии и тем же спектром резонансного поглощения. Примером этого могут служить исследования, проведенные Т. Karu (1999): внутриклеточная молекула Cyt-C в процессе метаболизма проходит 4 формы: 2 окисленные (CuA и CuB) и 2 восстановленные (CuA и CuB). Каждая из них излучает фотоны с длиной волны 820, 760, 680 и 620 нм соответственно и поглощает фотоны той же характеристики [11].

В подтверждение этого положения в конце прошлого века были получены данные, демонстрирующие возможность обмена биоинформацией между клетками без химических медиаторов и специальных передающих молекул, таких как гормоны, ростовые факторы и нейротрансмиттеры. Еще в 60-е годы прошлого века В.П. Казначеев c соавт. (1985) провел серию экспериментов, показавших, что монослой фибробластов, выращенный в герметически закрытом сосуде на кварцевой пластинке, расположенной на дне сосуда, способен повторять уникальный узор такой же культуры, выращенной в другой камере, при прижатии этих камер дном друг к другу [12 ]. В 1988 г. G. Albrecht-Buehler опубликовал данные, подтверждающие результаты работы В.П. Казначеева и указывающие на то, что фибробласты в культуре могут определять ориентацию других по сигналам, проникающим через стекло, но не через металлическую пластинку, т.е. переданных электромагнитным излучением [13]. V. Golantsev с соавт. (1993) показали, что эксплантат грудной железы мыши, стимулированный введением гормонов, вызывающих секрецию, может индуцировать секрецию протеина в другом эксплантате грудной железы мыши, отделенном от первого кварцевым стеклом [14]. X. Shen с соавт. (1994) продемонстрировали, что стимуляция «респираторного взрыва» у нейтрофилов, может вызвать аналогичную реакцию в другой популяции нейтрофилов, химически отделенной, но оптически связанной с первой [15].

Эти и другие данные, свидетельствующие о возможной биофотонной активации клеточных программ, косвенно подтверждаются наличием высокого энергетического потенциала внутри клетки. Нановольтметр с диаметром 30 нм выявил в цитозоле клеток электрическое поле высокой напряженности: 15 млн вольт на 1 м, что составляет 150 вольт в пересчете на 1 клетку с диаметром 10 мкм. Для сравнения, в обычном доме – 5–10 вольт на 1 м, под высоковольтной линией 10 тыс. вольт на 1 м [16]. Позднее было показано, что напряженность электрического поля внутри клеток значительно выше, чем в межклеточном пространстве [17].

В данной работе мы сделали попытку проанализировать зависимость активации колониеобразования гранулоцитарно-макрофагальных предшественников от концентрации гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) в культуральной среде. Эти данные, полученные и опубликованные немногим более 10 лет назад [18, 19], не нашли в то время своего концептуального объяснения. Предлагаем интерпретацию этих опытных данных с позиций современных представлений о биофотонной регуляции клеточных программ.

Материал и методы

В эксперименте использовали Г-КСФ (Граноцит, Aventis) в разведениях 0,002 мкг/мл; 0,02 мкг/мл; 0,2 мкг/мл и 2 мкг/мл (Г-КСФф). Для получения ультрамалых концентраций Граноцита была использована гомеопатическая методика разведения на воде – потенцирование, выполненное сотрудниками лаборатории компании «Буарон». Из Граноцита был получен гомеопатический потенцированный препарат (Г-КСФп) в разведениях 10–12 (6СН) и 10–60 (30СН).

Влияние различных концентраций этого препарата на программу пролиферации изучали в клеточной культуре. В качестве клеток-мишеней были использованы клетки-предшественницы, выделенные из пуповинной крови новорожденных 35–36 нед. гестации.

Культивирование проводили в системе «агаровая капля – жидкая среда» [20]. Мононуклеарные клетки, выделенные из пуповинной крови на градиенте плотности Фиколла 1077, культивировали в агаре (0,5 мл 0,3% агара) в концентрации 2×105 клеток в 1 мл. Смесь лейкоцитов 2 здоровых доноров в концентрации 1×106 кл/мл добавляли в жидкую фазу культуры в качестве источника ростовых факторов (фидерные клетки) в 2,5 мл полной среды Mc’Coy (Gibco Laboratories, США).

Клетки культивировали в 35 мм пластиковых чашках при температуре 37°С в условиях абсолютной влажности и 7% СО2 в течение 7 дней. Каждое культивирование проводили параллельно в 8 пробах: с фидерными клетками (стандартное колониеобразование); в среде, не содержащей фидерных клеток (спонтанное колониеобразование); при добавлении в среду с фидерными клетками Г-КСФ в 6 концентрациях: 30СН; 6СН; 0,002 мкг/мл; 0,02 мкг/мл; 0,2 мкг/мл и 2 мкг/мл. Каждую пробу проводили в 2–3 повторах.

Колониеобразующую способность (КОС) и кластерообразующую способность (КлОС) оценивали по числу колоний (более 20 клеток в агрегатах) и кластеров (от 5 до 19 клеток). Эффективность клонирования (ЭК) определяли по сумме числа колоний и кластеров в расчете на 1×105 эксплантированных клеток. Пролиферативный потенциал (ПП) предшественников оценивали по соотношению числа колоний и кластеров в культурах и процентному содержанию больших и средних колоний. Для сравнительной оценки полученных данных было введено 2 показателя: «По» – процентное отклонение изучаемого показателя под действием препарата от значения его при «стандартном колониеобразовании»; «К» – кратность изменения изучаемого показателя под действием препарата по сравнению с тем же контролем. Всего было проведено 70 серий исследования.

Влияние различных концентраций Г-КСФф и Г-КСФп на апоптоз изучали на модели спонтанного апоптоза в мононуклеарах периферической крови, выделенных на градиенте фиколла. Уровень апоптоза определяли методом количественного измерения ДНК в пермеабилизированных и окрашенных пропидиум иодидом клетках на проточном цитофлуориметре. За долю апоптоптических клеток принимали процент клеток с содержанием ДНК менее диплоидного. Всего было выполнено 32 серии подобных исследований.

Статистический анализ полученных данных проводили методами вариационной статистики с помощью программы Microsoft Excel 7.0.

Результаты и обсуждение

Результаты влияния Г-КСФ в фармакологических и гомеопатических концентрациях суммированы в табл.1.

Как следует из данных, представленных в табл. 1, ЭК при действии Г-КСФф несколько нарастает при уменьшении концентрации в 10 раз (статистически незначимо) при отсутствии изменения пролиферативного потенциала клеток-предшественниц. Дальнейшее разведение препарата в указанных пределах не меняло результатов культивирования. Использование Г-КСФп в концентрации 6СН приводило к заметному возрастанию ЭК и увеличению пролиферативного потенциала клеток. При сравнении действия Г-КСФп 30СН с действием Г-КСФф обращает внимание отсутствие изменения ЭК при увеличении пролиферативного потенциала клеток-предшественниц.

Для уточнения механизма действия ГКС-Фп мы оценили его действие на апоптоз мононуклеаров периферической крови по методике, описанной в разделе «Материалы и методы». Результаты представлены в табл. 2 и 3.

Как свидетельствуют данные, представленные в табл.2 и 3, потенцированный препарат Г-КСФ обладает выраженной антиапоптотической активностью, при этом существенных различий в активности разных разведений не выявлено.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что уменьшение стандартной концентрации препарата (2 мкг/мл – соответствует его «пиковой» концентрации в крови при лечении больных) в 10, 100 и 1000 раз не оказывает существенного влияния на пролиферативную активность клеток в культуре. Однако очень высокие разведения препарата с использованием технологии «потенцирования», применяемого в гомеопатии (10–12 и 10–60), приводило к резкому увеличению пролиферации предшественников. Те же высокие разведения препарата Г-КСФ оказывали существенный антиапоптотический эффект на мононуклеары периферической крови человека даже в разведении 10–60. Эти парадоксальные данные, противоречащие, на первый взгляд, утвердившемуся в фармакологии положению о прямой зависимости доза – эффект, не поддаются объяснению с ортодоксальных позиций биохимии и молекулярной биологии.

Для объяснения полученных нами результатов мы предлагаем использовать биофотонную модель, разработанную во второй половине ХХ в. F. Popp, R. VanWijk, G. Albrecht- Buehler и др. [5–13], согласно которой информация в биологических системах передается фотонным излучением в широком световом диапазоне (от UV до IR).

Исходя из этого, наша основная гипотеза заключается в том, что клетки и отдельные молекулы излучают определенные монохроматические волны, а рецепторы клеток их воспринимают в соответствии с принципом биорезонансного поглощения. По-видимому, так же строится и сигнальный путь: молекула-индуктор испускает специфический монохроматический луч, который воспринимает только соответствующая ей молекула-мишень, что приводит последнюю к активации ее собственного излучения, превращая ее из молекулы-мишени в молекулуиндуктор. Этот процесс происходит по цепочке, формируя соответствующий сигнальный путь.

Полученные нами данные позволяют предположить, что между монохроматическими лучами, испускаемыми молекулами Г-КСФ, возникает взаимодействие еще до достижения ими рецептора, что влияет на восприятие и активацию рецептора. В соответствии с законами волновой физики, между монохроматическими лучами в когерентном поле (согласованное протекание волновых процессов) возникает конструктивная (амплификация излучения при однонаправленности волн) и деструктивная (аннигиляция лучей при разнонаправленности их волн) интерференция. При увеличении числа источников излучения (в нашем случае количества молекул Г-КСФ, т.е. увеличения его концентрации) увеличивается площадь деструктивной интерференции, что мешает проведению сигнала и снижает его воздействие на мишень.

Однако эти предварительные замечания не объясняют влияния раствора Г-КСФ в разведении 10–60, поскольку в таком растворе, скорее всего, отсутствуют молекулы оригинального препарата (по закону Авогадро, молекулы в растворе отсутствуют при разведении выше 10–23).

В работе В. Корпачева (2005) подробно описано, как при последовательном разведении исчезают молекулы изначального вещества и постепенно заменяются молекулами многочисленных примесей [21]. Напомним, 30СН означает, что разведение (в соответствии с гомеопатической методикой) проводилось 30 раз, при этом каждый раз брали по 1 мл раствора предшествующей концентрации, доводили его объем до 100 мл, многократно встряхивая и тщательно перемешивая. В результате в растворе присутствуют многочисленные молекулы примесей.

До сих пор мы использовали лишь классическое, волновое свойство излучения. Однако теперь мы обратимся к квантовой, т.е. фотонной, природе излучения. Мы считаем, что фотоны, излучаемые молекулами активного вещества (скажем, Г-КСФ) могут захватываться определенными молекулами примесей (резонансное поглощение). Это, естественно, происходит, когда частота фотона соответствует излучаемой частоте данной молекулы (либо близко к ней). После резонансного поглощения энергетический уровень молекулы возрастает и тот же фотон (либо близкий к нему по частоте) излучается. Однако такое вторичное излучение происходит не немедленно, но по законам «времени полураспада» (аналогично ядерному полураспаду), и это время не обязательно очень мало. Излучение может произойти и через значительное время, хотя, возможно, с очень малой вероятностью. Однако при наличии в растворе миллионов молекул события эти будут происходить достоверно. Таким образом, излучаемые фотоны определенной длины волны «переходят» из одного этапа разведения в другой и в конце процесса принимаются рецепторами клеток. Иными словами, в данном случае примеси могут играть роль активного посредника.

Заключение

Проведенный анализ нашей экспериментальной модели позволяет предположить, что, кроме непосредственного контакта двух молекул (лиганд и рецептор), существует и другой вид взаимодействия. Молекулы много меньше клеток, расположение их хаотично. Для воздействия молекулы на клетку необходимо, чтобы клетка оказалась на расстоянии «радиуса видимости» этой молекулы. Чем больше молекул, тем, казалось бы, вероятнее попадание в этот радиус большего числа клеток. Но при увеличении числа молекул начинают все больше проявляться явления их взаимодействия друг с другом, в частности, явления деструктивной интерференции. Ожидаемого увеличения числа реагирующих клеток не происходит, т.к. они могут попасть в немые зоны, где монохроматические лучи, исходящие от молекул, гасят друг друга. Задача – найти такое достаточно большое число молекул, при котором деструктивная интерференция не занимает еще значительной площади в пределах радиуса видимости, а следовательно, под влияние этих молекул может попасть наибольшее число клеток. Это и будет являться предметом наших дальнейших исследований.

Было показано, как применение новой, биофотонной парадигмы организации информационной связи в живых системах помогает расшифровке некоторых неясных феноменов. Однако многое остается нераскрытым и требует дополнительных исследований, в частности, более подробной градуировки концентраций действующего вещества для установления более четкой границы оптимального «понимания» биофотонных сигналов рецепторами клеток. Возможно, в будущем это поможет лучше разобраться во многих физиологических и патологических процессах организма человека. Наиболее важным и интересным направлением такого рода исследований нам представляется иммунология, в частности, развитие иммунной толерантности, предупреждение резистентности к химиотерапии, цитокиновая терапия, точечная противоопухолевая терапия и многие другие процессы.

Подняться вверх сайта