Поиск Кабинет

Биобезопасная модель аденовирусной инфекции: влияние бактериальных протеаз на инфицирование клеток человека in vitro

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 105-107

 

Авторы

Мартынова Е.В., Данилова Ю.В., Анохин В.А., Хайбуллина С.Ф., Ризванов А.А., Шарипова М.Р.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Для определения противовирусной активности различных биологически активных соединений предложена модель аденовирусной инфекции на основе культуры клеток человека HEK293A и рекомбинантного аденовируса Ad-EGFP, экспрессирующего зеленый флуоресцентный белок EGFP. Аденовирусы имеют белковый капсид размером 70–90 нм и способны инфицировать делящиеся и неделящиеся клетки in vitro и in vivo. Рекомбинантные аденовирусы являются репликационно-дефектными в клетках человека и животных. Разработанная модель позволила нам определить действие бактериальных протеаз на инфицирование культуры клеток аденовирусом. Данная модель также может быть использована для скрининга препаратов с потенциальной протививовирусной активностью.

В педиатрической практике аденовирусная инфекция является одной из наиболее часто встречающихся вирусной респираторной инфекцией, на долю которой приходится до 34% от всех респираторных заболеваний [1–2]. В этиологии острых вирусных диарей аденовирусы занимают, по разным источникам, от шестого до четвертого места. Особенностью этой инфекции является склонность к рецидивированию, хроническому течению и персистенции в лимфоидной ткани. Поэтому аденовирусной инфекции принадлежит важная роль в формировании хронической ЛОР-патологии у детей (хронические рецидивирующие тонзиллиты, назофарингиты, ангины) и образовании контингента часто болеющих детей, что в настоящее время является актуальной проблемой педиатрии [2].

Несмотря на современное разнообразие средств этиотропной химиотерапии, специфического лечения аденовирусной инфекции не существует. С точки зрения доказательной медицины, ни один из противовирусных препаратов не рекомендован для лечения аденовирусной инфекции, т.к. не проведено убедительных клинических и доклинических исследований, несмотря на наличие ряда перспективных препаратов. Поскольку аденовирусная инфекция является антропонозной инфекцией и исследования на животных моделях ограничены, то с целью проведения доклинических испытаний имеющихся и вновь синтезированных этиотропных препаратов для лечения аденовирусной инфекции, мы предлагаем модель аденовирусной инфекции in vitro на основе рекомбинантного аденовируса Ad-EGFP и культуры клеток человека. Такой аденовирус используют для доставки генетической информации в генной терапии [3]. Данная модель позволяет работать в стандартной лаборатории второго класса биобезопасности и может упростить скрининг потенциальных различных противовирусных препаратов для проведения их доклинических и клинических исследований.

Материал и методы

Культивирование клеток HEK293A. Все работы с культурой клеток проводили в стерильном ламинарном боксе биологической безопасности класса II с соблюдением общепринятых правил работы с эукариотическими клетками. Эмбриональные клетки почки человека HEK293A (Invitrogen, США) культивировали в среде DMEM с добавлением 10% сыворотки крови плодов коровы и пенстрепа (Sigma, США). Клетки инкубировали при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2. Пересев клеток проводился при плотности клеточного монослоя 60% с применением 0,25% раствора трипсина-ЭДТА (БиоЛот, Россия).

Получение рекомбинантного аденовируса. Генетическую модификацию клеток линии НЕК293А с помощью рекомбинантной плазмиды pAd-EGFP, полученной на основе генетического вектора pAd/CMV/ V5-DEST (Invitrogen, США), проводили трансфекционным реагентом TurboFect (Fermentas Inc., Канада). TurboFect – раствор положительно заряженных полимеров, образующих компактные, стабильные, положительно-заряженные комплексы с молекулами нуклеиновых кислот. Для трансфекции применяли 12-луночные культуральные планшеты. Использовалась культура клеток НЕК293А с плотностью монослоя 60–70%. К 200 мкл культуральной среды DMEM без сыворотки добавляли 2,6 мкл трансфекционного реагента TurboFect, смесь тщательно перемешали на вортексе. В смесь добавляли 2 мкг плазмидной ДНК, смесь тщательно перемешивали, осаждали и инкубировали при комнатной температуре в течение 15–20 мин. Затем 200 мкл трансфекционной смеси добавляли в лунки культурального планшета. Планшеты инкубировали 3 часа в инкубаторе при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2, после чего в лунке меняли среду на свежую DMEM (1 мл на лунку), содержащую 10% FBS и 1% смеси антибиотиков пенициллина и стрептомицина. Анализ экспрессии зеленого флуоресцентного белка (англ. enhanced green fluorescent protein, EGFP) проводился с помощью флуоресцентной микроскопии на инвертированном флуоресцентном микроскопе исследовательского класса AxioOberver.Z1 (Carl Zeiss, Германия). После трансфекции каждые 2–3 сут. меняли среду на свежую, пока не стали заметны области цитопатического эффекта. Цитопатический эффект является следствием продукции рекомбинантного аденовируса Ad-EGFP, при которой нарушается нормальная жизнедеятельность клеток. При этом клетки становятся округлыми и открепляются от поверхности чашки. На 10 сут. после трансфекции клетки снимали в культуральной среде, суспензию из лунки собирали в стерильную 2 мл пробирку, подвергали криолизу (замораживание-размораживание), отделяли обломки клеток центрифугированием и супернатант использовали в дальнейших экспериментах.

Тестирование препаратов. В 24-луночный планшет в 12 лунок посеяли клетки HEK293A из расчета 30 тыс. клеток на лунку. Планшет находился в инкубаторе при температуре 37°С, содержании СО2 5%. Через 24 ч были добавлены ферменты и рекомбинантный аденовирус Ad-EGFP в двух концентрациях. Перед добавлением ферменты и рекомбинантный аденовирус Ad-EGFP в течение часа находились в инкубаторе. В это время белок капсида аденовируса подвергался протеолизу с помощью бактериальных протеолитических белков.

В работе использовали следующие протеолитические ферменты бацилл: глутамилэндопептидаза Bacillus рumilus – сериновая химотрипсиноподобная протеиназа с молекулярной массой 23 кДа, узкой субстратной специфичностью (выраженное предпочтение к связям, образованным глутаминовой кислотой). Белок получен из рекомбинантного штамма B. subtilis JB 2036(d58.21), несущего плазмиду с геном соответствующего фермента (ANY15136) по методу, описанному в работе [4].

Метцинкиновая металлоэндопептидаза B. pumilus – неспецифический фермент с молекулярной массой 19 кДа. Белок очищен до гомогенного состояния из культуральной жидкости рекомбинантного штамма B. subtilis JB 2036 (рСМ4), несущего плазмиду с геном фермента (ANEU678894.2) по методу, описанному в работе [5].

Результаты

Получение рекомбинантного вируса. Для получения рекомбинантного аденовируса Ad-EGFP клетки НЕК293A трансфицировали линейной формой плазмиды pAd-EGFP. Оценку эффективности трансфекции проводили с помощью флюоресцентной микроскопии по интенсивности экспрессии EGFP, которая составила до 90%. Для определения титра полученного вирусного раствора проводили подсчет клеток в контрольной лунке 24-луночного планшета. По результатам подсчета количества клеток в камере Горяева каждая лунка содержала по 60 тыс. клеток. Идентификацию инфицированных клеток с содержанием рекомбинантного аденовируса Ad-EGFP проводили с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. Е, Ж). Наибольшее количество инфицированных EGFP-позитивных клеток наблюдали в неразведенном образце.

Скрининг действия препаратов на инфицирование рекомбинантным аденовирусом Ad-EGFP. Клетки НEК293A обработали предварительно подготовленным рекомбинантным аденовирусом Ad-EGFP с протеазами в различных концентрациях и инфицировали раствором, как описано в разделе «Материал и методы».

Интенсивное свечение, сравнимое с положительным контролем (рис. З, И), наблюдалось в лунках с добавлением ферментов глутамилэндопептидазы и метцинкиновой металлоэндопептидазы с концентрацией рекомбинантного аденовируса Ad-EGFP 104 (рис. Б–Г). Кроме того, EGFP-позитивные клетки наблюдали при применении препаратов и концентрации рекомбинантного аденовируса Ad-EGFP 103 (рис. Д–Ж).

Обсуждение

Разработка моделей аденовирусной инфекции необходима для поиска новых этиотропных препаратов для лечения данного заболевания. Предложенная нами модель может быть использована не только для тестирования химио- и биопрепаратов, но и для скрининга новых способов воздействия на клетки человека, включая генную терапию.

Данный рекомбинантный аденовирус Ad-EGFP содержит белковый капсид, который, как предполагалось, в процессе взаимодействия с бактериальными протеазами должен разрушаться, как и у вируса дикого типа. Из полученных данных можно сделать вывод о том, что бактериальные ферменты не способны гидролизировать белки вирусного капсида, о чем свидетельствует эффективная трансдукция клеток рекомбинантным вирусом после обработки бактериальными протеазами. В то же время наблюдалось увеличение эффективности вирусной инфекции в культуре клеток, т.е. тестируемые бактериальные белки способствовали проникновению вирусов внутрь клеток.

Ранее коллективом авторов была разработана клеточная модель ВИЧ-инфекции для скрининга антиретровирусных препаратов на основе рекомбинантного лентивирусного вектора и культуры клеток человека [6]. Тестирование антиретровирусных препаратов показало положительный результат: препараты эффективно подавляли экспрессию рекомбинантного белка GFP. В настоящей работе нами создана новая тест-система для поиска и тестирования препаратов, способных влиять на процесс развития аденовирусной инфекции.

Подняться вверх сайта