Поиск Кабинет

Аутологичные фибробласты кожи стимулируют восстановление дегенеративно-измененных ахилловых сухожилий

Гены & Клетки: Том IX, №1, 2014 год, стр.: 35-40

 

Авторы

Волкова Н.А., Юхта М.С., Блонский Р.И., Коструб А.А., Гольцев А.Н.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Альтернативой или дополнением к стандартному лечению дегенеративных изменений сухожилий может стать клеточная терапия с применением аутологичных фибробластов кожи.

Целью работы была оценка в динамике терапевтического эффекта локального введения культивированных и криоконсервированных аутологичных фибробластов кожи при тендопатии. Крысам со смоделированным дегенеративно-дистрофическим повреждением ахилловых сухожилий в зону дефекта вводили по 0,25×106 нативных или криоконсервированных аутологичных фибробластов кожи. Контролем служили животные с введением физиологического раствора. На 21 и 45 сут. после терапии проводили гистологическое, иммунофлюоресцентное и биомеханическое исследования. Анализ данных показал, что культивированные и криоконсервированные аутологичные фибробласты кожи способствуют активизации репаративного процесса в поврежденных сухожилиях. Через 21 сут. после применения криоконсервированных клеток наблюдался менее выраженный терапевтический эффект по сравнению с культивированными фибробластами. На 45 сут. исследования в гистологическая структура ахилловых сухожилий животных с введением как культивированных, так и криоконсервированных аутологиных фибробластов кожи характеризовалась наличием специализированных клеток, уменьшением явлений дезорганизации, нормализацией структуры и расположения волокон коллагена I типа. Кроме того, сухожилия животных после терапии культивированными и криоконсервированными аутологичными фибробластами кожи имели положительную динамику биомеханических показателей: наблюдали постепенное восстановление прочности при натяжении, которое на 45 сут. лечения достоверно не отличалась от соответствующих показателей у интактных животных.

Сухожилия мышц и связки суставов на протяжении жизни человека подвергаются высокие биомеханические нагрузки. В большей степени это касается спортсменов, работников тяжелого физического труда и лиц зрелого возраста [1, 2]. Тактика лечения больных с дегенеративным повреждением сухожилий на сегодняшний день не имеет четкого патогенетически обоснованного алгоритма и характеризуется несогласованностью применения различных методов лечения и их недостаточной эффективностью [1, 3, 4]. Поиск оптимальных лечения терапии повреждений сухожильно-связочного аппарата остается актуальной задачей биологии и медицины.

За последние десятилетия в ортопедии активно развивается новое новое, биотехнологическое направление. В его основу легло использование факторов роста, продуцируемых многими клетками, а также самих клеток (культивированных in vitro или минимально манипуллированных), в частности, аутогенных фибробластов, для стимуляции регенерации тканевых структур [5–7].

Следует отметить, что самым распространенным клеточным типом для восстановления поврежденных тканей сухожильно-связочного аппарата являются мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), полученные из костного мозга или жировой ткани [5, 8, 9]. К недостаткам можно отнести травматическую процедуру при заборе материала для получения клеток. Биопсия кожи, на наш взгляд, является более простой процедурой, а получаемое в ходе культивирования количество фибробластов значительно превышает ММСК при сопоставимых сроках лабораторного процессинга. При проведении экспериментального исследования наш выбор остановился на аутогенных фибробластах кожи. Фибробластам свойственно формирование внеклеточного матрикса, синтез биологически активных веществ, способность вызывать миграцию и пролиферацию различных типов клеток при повреждениях, что делает их перспективными для клинического применения. Особое внимание к фибробластам обусловлено тем, что они являются основным клеточным компонентом волокнистой соединительной ткани [7, 10–12]. Показано, что фибробласты, полученные из кожи, имеют фенотипическую гетерогенность, могут способствовать регенерации тканей за счет продукции проколлагена, проэластина, фибронектина и гликозаминогликанов, формирующих экстрацеллюлярный матрикс, а также различных факторов роста [11–14]. Кроме того, аутогенные фибробласты в отличие от аллогенных, не вступают в конфликт с собственной иммунной системой и, соответственно, не вызывают аллергических реакций и прочих побочных эффектов. Привлекательным является и то, что современные технологии культивирования и криоконсервирования позволяют получить запас аутогенных фибробластов кожи с последующим длительным хранением при низких температурах [15].

Таким образом, актуальным является проведение сравнительного исследования оценки лечебного эффекта локального введения культивированных (КАФК) и криоконсервированных (криоАФК) аутогенных фибробластов кожи при дегенеративных повреждениях сухожилий.

Материал и методы

Целью работы была оценка влияния КАФК и криоАФК на регенерацию дегенеративно-дистрофически поврежденных ахилловых сухожилий (АС) при локальном введении. Исследование проведено на 64 крысах массой 250–300 г с соблюдением международных правил гуманного обращения с лабораторными животными [16].

Получение клеточных культур

Первичную суспензию фибробластов получали из биоптатов кожи крыс путем ферментативной дезагрегации образцов. Для этого биоптаты кожи промывали раствором Хэнкса (PAA, Австрия) с гентамицином (150 мкг/мл) (Фармак, Украина), иссекали на фрагменты 0,5–1 мм, добавляли раствор 1,5 мг/мл коллагеназы II типа (ПанЕко, Россия) на среде IMDM (PAA, Австрия) и оставляли на ночь при температуре 4°С. Клетки получали из биоптатов путем ресуспендирования с последующим центрифугированием при 1500 об./мин (834 g) в течение 3 мин. К осадку добавляли среду культивирования и высевали на культуральный пластик. Плотность посева составляла 1×104 кл./см2 культурального флакона площадью 25 см2 (РАА, Австрия) [17]. Культуральная среда содержала IMDM (РАА, Австрия), 10% фетальной сыворотки (ФС) крупного рогатого скота (HyClone, США), гентамицин (150 мкг/мл) (Фармак, Украина) и амфотерицин Б (10 мкг/мл) (РАА, Австрия). Ростовую среду меняли каждые 3 сут. В работе были использованы стандартные условия культивирования при 37°С в атмосфере 5% СО2 с использованием СО2 инкубатора (Sanyo, Япония). По достижению монослоя культуры клеток пассировали.

Криоконсервирование и разморозка

Для криоконсервации клеток использовали среду IMDM (РАА, Австрия) с добавлением 10% криопротектора ДМСО (ПанЭко, Россия) и 25% ФС (РАА, Австрия).

Полученную суспензию клеток разливали по 1 мл в криопробирки (Nunc, США). Скорость охлаждения составляла 1°С/мин до -80°С с последующим погружением в жидкий азот [15]. Размораживание осуществляли на водяной бане при 40°С до появления жидкой фазы. Удаление криопротектора проводили путем медленного добавления к суспензии клеток раствора Хэнкса (РАА, Австрия) в соотношении 1:9 с последующим центрифугированием при 1500 об/мин (834 g) в течение 5 мин. Жизнеспособность клеток оценивали по тесту на включение суправитального красителя трипанового синего (Sigma, США).

Эксперимент in vivo

Моделирование дегенеративно-дистрофического процесса в сухожилиях крыс проводили путем инъекционного введения в толщу обоих АС 0,03 мл раствора Дипроспана каждые 7 сут. на протяжении 4 нед. [18, 19]. На 28 сут. моделирования в оба АС подопытных животных с тендопатией, отступив на 0,25 см от пяточного бугра, вводили либо КАФК в количестве 0,25×106 клеток (экспериментальная группа 1, n = 16), либо криоАФК в количестве 0,25×106 клеток (экспериментальная группа 2, n = 16), либо 0,9% раствор NaCl в количестве 0,025 мл (контрольная группа 3, n = 16). После проведения терапии животных выводили из эксперимента на 21 и 45 сут. Кроме того, в эксперименте были использованы животные с дегенеративно-дистрофическим процессом без какой-либо терапии (контрольная группа 4, n = 8) и интактные здоровые животные (контрольная группа 5, n = 8).

Гистологические исследования

Для гистологического, иммунофлюоресцентного и биомеханического исследований выделяли АС вместе с местом прикрепления к бугру пяточной кости. Полученные материалы для гистологического исследования фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и после обезвоживания и обезжиривания в спиртах нарастающей концентрации заливали в целлоидин. Гистологические срезы получали в сагиттальной плоскости и окрашивали гематоксилином и эозином. Плотность клеток (фибробластов и теноцитов) определяли как отношение среднего количества ядер к единице площади среза сухожилий (0,102 мм2) с последующим пересчетом на 1 мм2.

Оценку содержания коллагена І типа проводили на криостатных срезах АС (7 мкм) с использованием моноклональных антител к коллагену І типа (1:2000, COL-1, Sigma, США) и CFТМ488A (Sigma, США), согласно инструкции фирмы-производителя. Люминесцентную микроскопию препаратов АС проводили на флуоресцентном микроскопе (Микмед 2, Россия).

Биомеханическое исследование

Прочность сухожилий при тендопатии и в условиях введения аутогенных фибробластов кожи определяли с помощью разрушающей нагрузки при натяжении в динамике. После измерения высоты и ширины АС их фиксировали в зажимах устройства для определения прочности (рис. 1).

Результаты

На первом этапе работы была проведена оценка целостности мембран фибробластов после криоконсервирования. Жизнеспособность криоАФК составляла 78,5±6,2%, что в 1,2 раза ниже, чем у КАФК – 95,2±3,5%.

Гистологический анализ препаратов АС животных с дегенеративно-дистрофическим процессом без терапии (группа 4) свидетельствовал о нарушении тинкториальных качеств на фоне ослабления интенсивности окраски волокон и клеточных элементов. Участками наблюдали разволокнение и дезорганизацию пучков коллагеновых волокон, отсутствие клеточных элементов сухожилий (рис. 2). Плотность клеток составляла 2,31±0,19×103 кл./мм2.

Путем плавного вращения маховика (приложение силы) нагружали исследуемые препараты. В момент полного разрыва образца фиксировали значение динамометра – приложенная нагрузка. Разрушающую нагрузку при натяжении определяли по формуле: F = N/S (МПа), где F – разрушающая нагрузка при натяжении; N – приложенная нагрузка, приводящая к разрыву сухожилия; S – площадь сечения сухожилия [20, 21]. Разрушающую нагрузку при натяжении измеряют в паскалях (Па). 1 Паскаль равен механическому напряжению, вызываемому силой, равной одному ньютону, равномерно распределённой по нормальной к ней поверхности площадью один квадратный метр.

Статистический анализ

Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерных программ Exсel и Statistica 8 (StatSoft, США) с использованием непараметрических критериев. Результаты представлены в виде средних арифметических и стандартных ошибок средних (M±m), критическое значение уровня значимости принималось равным 0,05.

Рис. 2. Ахиллово сухожилие с индуцированным дегенеративно-дистрофическим повреждением. Окраска: гематоксилин, эозин. Результаты гистологического и иммунофлюоресцентного исследований АС контрольной группы 3 показали, что через 21 сут. после введения 0,9% раствора NaCl в исследуемой ткани определялись нарушения тинкториальных качеств, ацеллюлярные зоны, дезорганизация коллагеновых волокон с редкими участками содержания коллагена I типа низкой плотности (рис. 3А) без достоверного увеличения плотности клеточных элементов (2,14±0,25×103 кл./мм2) по сравнению с показателем на момент введения 0,9% раствора NaCl.

У животных с введением КАФК на 21 сут. наблюдения в АС отмечали увеличение интенсивности окрашивания клеточных элементов в зоне дегенеративно-дистрофического процесса, улучшение четкости контуров, уменьшение явлений разволокнения и дезорганизации коллагеновых волокон. Плотность клеточных элементов составляла 4,15±0,32×103 кл./мм2, что в 1,9 раза (р≤0,05) превышало значения исследуемого показателя в контрольных группах 3 и 4 на том же сроке наблюдения. Количество участков коллагена I типа, которые располагались по краям и центру препаратов АС, было увеличено по сравнению с контролем (рис. 3Б).

В группе животных, получивших криоАФК, на этом же сроке отмечали скопления клеточных элементов по краям АС. Пучки волокон приобретали упорядоченную организацию и характеризовались расположением участков коллагена I типа по краям препаратов (рис. 3В). Плотность клеток составляла 3,82±0,42×103 кл/мм2, что достоверно (р≤0,05) превышало значения исследуемого показателя в группах 1, 3 и 4. Следует отметить, что плотность участков коллагена I типа в случае КАФК была выше по сравнению с криоАФК на сроке 21 сут.

Локальное введение так КАФК, так и криоАФК в дегенеративно-дистрофически поврежденные АС на 21 сут. наблюдения приводило к восстановлению четкости контуров пучков коллагеновых волокон, уменьшению количества поврежденных и дезорганизованных структур, а также увеличению количества клеточных элементов, что свидетельствует об активизации восстановительных процессов в поврежденном сухожилии.

На 45 сут. наблюдения в АС животных контрольной группы 3 наблюдали более выраженные нарушения тинкториальных свойств и дезорганизации пучков коллагеновых волокон на фоне общего снижения их количества по сравнению с предыдущим сроком наблюдения, бесклеточные участки приобретали большую распространенность, а количество волокон с участками коллагена I типа было снижено по сравнению с предыдущим сроком наблюдения (рис. 4А). Плотность клеток составляла 1,46±0,15×103 кл./мм2 и достоверно (р≤0,05) отличалась от показателя, полученного на сроке 21 сут.

В АС животных, получивших КАФК, на 45 сут. наблюдали уменьшение интенсивности окраски волокон и клеточных элементов в месте патологического процесса по сравнению с предыдущим сроком. Плотность клеток составляла 3,27±0,17×103 кл/мм2 и статистически значимо (р≤0,05) отличалась от результатов, полученных на 21 сут. При этом отмечали участки с практически отсутствующими признаками разволокнения и дезорганизации на фоне восстановления четкости контуров пучков коллагеновых волокон (рис. 4Б). Последние имели упорядоченное расположение с равномерным, четким и интенсивным иммуногистохимическим окрашиванием коллагена I типа по всей площади препаратов.

Признаки реализации репаративного процесса наблюдали на 45 сут. и в АС животных с введением криоАФК: наличие клеточных элементов в участках зоны ремоделирования ткани, подвергшейся индукции дегенеративно-дистрофического процесса, улучшение четкости контуров волокон, увеличение количества нормальных волокон коллагена I типа, которые были равномерно распределены по всей плоскости среза (рис. 4В). Плотность клеток составляла 2,97±0,21×103 кл/мм2 и достоверно (р≤0,05) отличалась от данных, полученных на 21 сут. после терапии.

Для оценки прочности сухожилий при тендопатии и в условиях введения фибробластов проводили определение разрушающей нагрузки при натяжении в динамике. Полученные результаты приведены в таблице.

Из таблицы видно, что у животных контрольной группы прочность сухожилий уменьшалась и была достоверно ниже, чем у интактных животных на всех сроках наблюдения. Применение КАФК приводило к увеличению прочности сухожилий по сравнению с соответствующими показателями в контрольной группе 3: в 2,3 раза на 21 сут. и в 3,2 раза на 45 сут., достигая значений интактных животных. Аналогичные изменения прочности АС наблюдали у животных с терапией криоАФК, а именно: увеличение в 2,1 раза на 21 сут., в 3,1 раза на 45 сут., по сравнению с контрольной группой 3.

Таким образом, после локального введения как КАФК, так и криоАФК происходило постепенное восстановление показателя прочности дегенеративно-дистрофически измененных АС, что является одним из объективных критериев эффективности клеточной терапии при данной патологии.

Обсуждение

Приведенные результаты свидетельствуют, что локальное введение аутогенных фибробластов кожи стимулировало репаративный процесс в зоне дегенеративно-дистрофических изменений АС с постепенной нормализацией их структурно-функциональной организации, восстановлением содержания коллагена I типа и прочности сухожилий. Следует отметить, что в случае применения КАФК репаративные процессы имели более интенсивный характер, что выражалось в наличии большего количества клеточных элементов в целевой зоне, ростом в динамике показателя прочности и содержания коллагена I типа. Через 21 сут. после применения криоАФК выявлялся менее выраженный эффект, однако на крайнем сроке наблюдения (45 сут.) достоверных различий в исследуемых показателях между экспериментальными группами (гистологическая структура, содержание коллагена I типа, прочность, плотность клеток) не определялось. Увеличение времени восстановления поврежденных АС при применении криоАФК, возможно, связано с замедлением метаболических процессов в клетках после их замораживания-размораживания.

Вероятно, терапевтическая эффективность аутогенных фибробластов кожи в оптимизации репаративной регенерации плотной волокнистой соединительной ткани обусловлена как родством фибробластов по своим морфофункциональным характеристикам с теноцитами, так и их паракринной активностью – продукции компонентов межклеточного матрикса и регуляции пролиферации и дифференцировки клеток реципиентного ложа секретируемыми цитокинами [11–13, 22–25].

На данный момент в терапии дегенеративно-дистрофических повреждений АС наиболее часто используют аутогенную плазму, обогащенную тромбоцитами, которая является простым и недорогостоящим методом, который приводит к транзиторному восстановлению поврежденной ткани, а наилучшие результаты наблюдаются у реципиентов молодого возраста [26, 27]. Аутогенные ММСК костного мозга и жировой ткани приводят к быстрому (30–45 сут.) и эффективному (структура, прочность, синтетические процессы) восстановлению Ахиллового сухожилия, но данный материал не всегда доступен в короткий срок [5, 9, 27]. Использование аутогенных фибробластов кожи в терапии дегенеративных повреждений АС является более редким подходом, но имеющиеся данные [28] и полученные нами результаты позволяют считать их эффективной альтернативой ММСК.

Выводы

1. Иммунофлюоресцентный анализ показал, что применение КАФК и криоАФК ускоряет синтетические процессы в ткани сухожилия и приводит к восстановлению содержания коллагена I типа. 2. Прочность сухожилий с дегенеративно-дистрофическими изменениями после терапии КАФК и криоАФК имела положительную динамику восстановления c нормализацией к 45 сут. 3. Локальное введение КАФК и криоАФК животным с тендопатией привело к активизации репаративных процессов в зоне дегенеративно-дистрофического повреждения сухожилия.

Подняться вверх сайта