Поиск Кабинет

Аутогенные IL-10-модифицированные дендритные клетки в иммунотерапии рассеянного склероза: анализ первых результатов клинических исследований

Гены & Клетки: Том V, №3, 2010 год, стр.: 90-95

 

Авторы

динак М.М., Чирский В.С., Бисага Г.Н., Пащенков М.В., Балдуева И.А., Моисеенко В.М., Нехаева Т.Л., Калинина Н.М., Давыдова Н.И., Бычкова Н.В., Поздняков А.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Проблема поиска методов эффективной терапии рассеянного склероза (PC), наиболее часто встречающегося прогрессирующего демиелинизирующего заболевания центральной нервной системы, остается чрезвычайно актуальной. Накопленные экспериментальные данные, а также клиническое применение дендритных клеток IДК1 в онкологии позволили начать клиническое испытание возможности применения аутогенных IL-10-модифицированных ДК в иммунотерапии PC. В настоящее время проанализирован опыт использования этого метода клеточной терапии у двух пациентов с вторичнопрогрессирующим течением PC. Показано, что введенные под кожу в область спины аутогенные IL-10-модифицированные ДК в дозе Зх10Б не вызывают каких-либо побочных отрицательных реакций. У одного из пациентов получен достаточно определенный и значимый положительный клинический эффект, сопровождаемый нейровизуализационными и иммунологическими признаками снижения активности воспалительного процесса. Установлено, что ответ иммунной системы больных с PC на введение аутогенных IL-10-модифицированных ДК, в отличие от клинического эффекта, имеет место всегда, и, несмотря на разноплановый характер, закономерно проявляется абсолютным и относительным увеличением содержания в периферической крови Т-регуляторных клеток. Полученные данные позволяют считать целесообразным проведение дальнейших клинических испытаний для уточнения показаний к применению этого вида клеточной терапии больных с PC.

Рассеянный склероз (PC) — хроническое прогрессирующее демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы, характеризующееся преимущественным поражением лиц молодого трудоспособного возраста.

По распространенности среди всех форм неврологической патологии PC занимает четвертое место после церебральных инсультов, эпилепсии и паркинсонизма, а среди лиц молодого возраста — второе после эпилепсии. В настоящее время в мире насчитывается более 2 млн больных PC, в России их более 220 тыс.

В основе патогенеза PC лежит аутоиммунная агрессия на антигенные структуры центральной нервной системы (ЦНС), прежде всего, на основные белки и гликоликопротеиды миелина. Результатом этой агрессии, сопровождающейся изменениями клеточного и гуморального звеньев иммунитета, в том числе, активацией Т-клеточного ответа, изменением продукции интерферонов, дисбалансом в системе интерлейкинов, становится формирование в ЦНС очагов демиелини-зации (бляшек). Данные изменения являются морфологическим субстратом очаговых неврологических расстройств, характерных для PC. Необходимо отметить, что запущенные патологические процессы крайне редко самостоятельно подвергаются обратному развитию, приводя к нарастающей инвалидизации больных, страдающих PC.

Проблема PC усугубляется недостаточной эффективностью всех известных на сегодняшний день методов его лечения, что обусловливает необходимость поиска новых более эффективных методов терапии, одним из которых может стать использование для лечения PC дендритных клеток.

Дендритные клетки (ДК) — профессиональные мигрирующие антигенпредставляющие клетки, влияющие на созревание Т-лимфоцитов и, соответственно, играющие активную роль в формировании иммунного ответа. Эти свойства ДК сделали их объектом широкого круга исследований, основной целью которых является создание клеточных вакцин, способных корректировать иммунный статус как у больных со злокачественными опухолями, так и с аутоиммунными заболеваниями[1, 2].

Данные исследования создали предпосылки для инициации нами в Санкт-Петербурге первых в мире клинических исследований[3], направленных на оценку возможностей и эффективности применения ДК в терапии PC — органоспецифического аутоиммунного заболевания. Определение общей их стратегии, а также детальную разработку протокола введения ДК больным с PC, выполняли на основе опыта работы научной группы X. Линка из департамента Neurotec Каролинского института (г. Стокгольм, Швеция)[1, 4] и отделения биотерапии и трансплантации костного мозга НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова (В.М. Моисе-енко, И.А. Балдуева)[5—7]. Иммунотерапию PC было решено проводить аутогенными IL-1(^модифицированными незрелыми ДК[8—10], обладающими иммуносупрессорной активностью, проявляющейся в ингибиции экспрессии костимулирующих молекул, снижении синтеза IFN-y, уменьшение продукции антител посредством стимуляции пролиферации клонов Т-хелперов как Th2 (IL-10), так и Th3 (TGF-p), а также Т-регуляторных клеток (CD4+CD25+CD127~)[11—14].

Первый опыт лечения больного с PC IL-10-моди-фицированными ДК представлен в 2008 г.[3]. В настоящей статье приводится обобщение результатов терапии данным методом двух пациентов с PC.

Материал и методы

Пациент № 1 — мужчина, 46 лет, болен PC с 1998 г., EDSS (расширенная шкала инвалидизации Дж. Куртцке) в начале лечения — 6,0.

Течение заболевания: 1998—2000 гг. — рецидиви-рующе-ремиттирующее; с 2000 г. — вторично-прогрессирующее с редкими обострениями (последнее верифицированное обострение в 2005 г.). Пациент № 2 — женщина, 52 лет, больна PC с 2000 г., EDSS в начале лечения — 5,0.

Течение заболевания: 2000—2001 гг. — рецидиви-рующе-ремиттирующее; с 2001 г. — вторично-прогрессирующее с обострениями каждые 6—12 мес.

Оба пациента получали нейропротективную и иммуномодулирующую терапию. При этом отчетливого клинического эффекта получено не было.

Получение незрелых ДК. ДК получали из моноцитов периферической крови больного при 37°С, 5% С02 и 98% влажности в обогащенной бессывороточной среде для выращивания ДК (CellGro DC) («Cell Genix», Германия) в присутствии стабильного содержания гра-нулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и интерлейкина-4 (IL-4) («Cell Genix», Германия) в течение 5 сут. и интерлейкина-10 (IL-10) с 5 по 7 сут. (Link Н., 2004). Моноциты получали из адгезивной фракции мононуклеаров, выделенных в градиенте плотности фиколла-верографина «Lympholyte» («Cedarlane Lab. Ltd», Канада) (удельная плотность 1,077 г/см3) по методу A. Boyum (1968).

Мононуклеары (3—4х108/мл) помещали в культуральную среду «CellGro DC» с GM-CSF (800 U/ml), IL-4 (500 U/ml) и плоскодонные культуральные флаконы 65 см3 («Sarstedt», Германия). С целью предотвращения контаминации клеточных культур использовали пенициллин (50 ЕД/мл) и стрептомицин (50 мкг/мл). Наблюдение проводили за клетками, прикрепившимися в течение первых 2 ч культивирования. Неприкре-пившиеся клетки удаляли. На 5 сут. добавляли IL-10 (конечная концентрация 10 нг/мл) и культивировали еще 2 сут. для получения IL-10-модифицированных ДК (рис. 1).

Данная методика позволяла получать из 60 мл пери DR+/CD1 a+/CD837CD80-). Иммуноцитохимическая характеристика ДК. Для иммуноцитохимической оценки полученных ДК проводили цитологическую и иммунологическую верификацию ДК, изучали тип роста клеток. Для этого ДК: 1) выращивали на стеклах; 2) фиксировали с помощью абсолютного метанола; 3) окрашивали моноклональными антителами к линейным антигенам миелоидных клеток, моноцитов, Т- и В-лимфоцитов, NK-клеток, незрелых, зрелых и активированных ДК (CD11 с, CD14, CD3, CD19, CD20, CD16, CD56, HLA DR, CD1a, CD83, CD80 («DAKO» Дания, «Novocastra», Великобритания) с помощью непрямого иммуноцитохимического метода и системы визуализации «In vision» и «Novostain detection kit NCL-RTU-D» («DAKO» Дания, «Novocastra», Великобритания).

Оценка стерильности полученной культуры ДК. Контроль стерильности проводили после приготовления вакцины по методике, изложенной в Сборнике инструкций, утвержденных приказом Минздрава СССР от 13.01.83 г. № 31.

Культуры ДК всегда были стерильны.

Введение больным аутогенных ДК. Аутогенные IL-10-модифицированные ДК вводились больным на основании решения этического комитета Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова.

1-му больному аутогенные ДК вводились вначале однократно (06.12.07), затем через 4 мес., после оценки индивидуальной реакции больного, была выполнена серия из 3-х введений с интервалом через 1 мес. (31.03.08, 29.04.08, 26.05.08).

2-му больному выполнено 6 инъекций аутогенных ДК: первые три проведены с месячным интервалом (27.10.08, 28.11.08, 29.12.08), четвертая инъекция с двухмесячным интервалом (24.02.09), пятая и шестая с трехмесячным (25.05.09, 26.08.09).

Перед введением больным ДК в количестве 2,5^ 4x108 их отмывали центрифугированием (1000 об./ мин, 10 мин) в 0,9% растворе NaCI и вводили ех tempore по 0,3 мл паравертебрально в межлопаточную область в 3 точки на расстоянии 3 см с образованием «лимонной корочки». В четвертую точку (контрольную) вводили изотонический раствор NaCI с 10% раствором альбумина человека.

Оценка токсичности полученной культуры ДК. Контроль токсичности проводили в соответствии с критериями, рекомендованными ВОЗ. Основные жизненные параметры (общее состояние, пульс, артериальное давление) измеряли через 10, 30 и 60 мин. после каждого введения культуры ДК. Особое внимание уделялось местным кожным реакциям, лихорадке, гастроинтестинальной и гематологической токсичности, а также функции печени, почек и нервной системы. Введенные ДК оказались безвредными и нетоксичными для больных.

Иммунологический мониторинг. Контроль за состоянием иммунной системы больных выполняли посредством динамического определения иммунологических показателей. Пациентам проводился анализ спонтанной и индуцированной продукции цитокинов, а также содержания их в сыворотке крови с использованием отечественных тест-систем, основанных на «сандвич»-методе твердофазного иммуноферментного анализа с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Применялись тест-системы для определения интерлейкина 8 (IL-8), рецепторного антагониста интерлейкина 1 (IL-1 га) и интерферона у (IFNy), производства ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург), тест-системы для определения интерлейкинов 1 (IL-1), 2 (IL-2), 4 (IL-4), 6 (IL-6), 10 (IL-10), фактора некроза опухоли — (TNF—) и интерферона — (IFN—) производства ООО «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург). В качестве индукторов при этом использовали РНА-Р вирус болезни Ньюкастла с инфекционным титром.

Содержание иммуноглобулинов А, М, G в сыворотке крови анализировалось методом турбодиметрии.

С помощью иммуноферментного анализа определяли содержание в сыворотке крови фактора роста нервов (BDNF6) (Chemicon Int.) и аутоантител к основному белку миелина (ОБМ) (ТОО «Навина», Москва).

Пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови исследовали в реакции бласттрансфор-мации в цельной крови с помощью ДНК-цитометрии с учетом результатов на проточном цитометре EPICS XL (Beckman-Coulter). В качестве митогенов применяли РНА-Р в концентрации 15 мкг/мл (преимущественно Т-клеточный митоген) и митоген лаконоса в концентрации 5 мкг/мл (преимущественно В-клеточный митоген), в качестве специфического антигена — основной белок миелина (Sigma, США).

Цитотоксическую активность натуральных киллер-ных клеток анализировали на выделенных мононуклеа-рах с помощью ДНК-цитометрии с учетом результатов на проточном цитометре EPICS XL (Beckman-Coulter, США), в качестве клеток мишеней были использованы клетки перевиваемой клеточной линии К-562.

Субпопуляционный состав лимфоцитов исследовали методом проточной цитометрии (Cytomics FC500, Beckman-Coulter) в цельной крови с использованием следующих моноклональных антител в многоцветном анализе: CD45, CD3/CD4/CD8, CD3/CD(16 + 56 + ), CD19/CD5, HLA DR, CD4/CD25/CD127, CD16/CD95 (Beckman-Coulter, США).

Магнитно-резонансная томография головного мозга. У 2-го больного в динамике (до начала лечения[октябрь 2008], после 7 мес. лечения[май 2009], через 6 мес. после окончания курса терапии[февраль 2010]) проведена магнитно-резонансная томография (МРТ) головного мозга с введением внутривенно водорастворимого контраста и магнитно-резонансная спектроскопия (МРС).

МРТ головного мозга выполнялась на аппарате Magneton Vision (Siemens) с напряженностью магнитного поля 1,5 Т и использованием катушки для головы типа «Шлем». Матрица исследования составляла 1x1024, время накопления сигнала от метаболитов головного мозга — 6^9 мин. Параметры исследования при МРС: TR = 5000, ТЕ=10 мс. Водорастворимый контрастный препарат магневист вводили внутривенно из расчета 0,4 ммоль/кг веса пациента. Начало введения контрастного препарата принималось за точку отсчета. Изображения взвешенные по Т1 получали через 2^6 мин после введения. Для определения накопления препарата в «старых» очагах демиелиниза-ции использовалась методика субстракции (вычитания изображений).

Оценка клинического статуса больных с PC, получавших терапию аутогенными ДК, модифицированными IL-10. После введения аутогенных ДК, модифицированных IL-10, системных побочных эффектов не установлено, выявлены локальные местные кожные реакции в течение 3 сут. после каждой инъекции.

Неврологический статус в динамике: 1-й пациент — без улучшения; 2-й пациент — постепенное в течение 2 мес. улучшение с уменьшением EDSS с 5,0 до 4,0 баллов (рис. 2), с последующей стабилизацией в течение всего периода наблюдения (1 год). Данный период сама пациентка характеризует фразой: «Лучшее состояние за последние два года».

Необходимо отметить, что для 2-го пациента в начале терапии был выбран месячный интервал введения ДК, однако, после получения очевидного положительного клинического эффекта интервал был увеличен сначала до 2, а затем и 3 мес.

При MPT-исследовании головного мозга 2-го больного на Т1 -взвешенных изображениях (аксиальные срезы] до начала лечения в 2008 г. отмечалось накопление контраста в единичных очагах демиелиниза-ции; после 7 мес. лечения в 2009 г. воспалительные изменения в головном мозге стали более выраженными, контраст накопился в нескольких очагах; через 6 мес. после окончания курса терапии воспалительные изменения полностью отсутствовали.

На Т2-взвешенных изображениях (аксиальные срезы): после 7 мес. лечения в 2009 г. отмечено появление нескольких новых очагов демиелинизации (рис. ЗА, Б); через 6 мес. после окончания курса терапии часть очагов уменьшилась в размерах, часть исчезла (рис. ЗВ).

Оценка результатов исследования иммунного статуса больных с PC, получавших терапию аутогенными дендритными клетками, модифицированными IL-10. Динамика изменений иммунологического статуса больных представлена в таблице 2.

При анализе иммунологического статуса пациентов с клиническим улучшением и без него необходимо отметить, что у 1 -го пациента (без клинического улучшения) на начало терапии имели место абсолютная лимфопения, снижение абсолютного количества зрелых Т-лимфоцитов, сочетавшиеся с повышенным относительным содержанием Т-хелперов, значимым снижением относительного и абсолютного количества специфических цитотоксических Т-лимфоцитов. При нормальном содержании В-лимфоцитов у больного в сыворотке наблюдался увеличенный уровень иммуноглобулинов классов А и G, антител к ОБМ класса М, был повышен уровень спонтанной продукции IL-lp, спонтанной продукции и содержания в сыворотке IL-4, снижена индуцированная продукция INF-—, IL-1 Ra и IL-6. Резервы продукции IL-10 значимо превышали границы референтного интервала.

У 2-го пациента (с клинического улучшением) начало терапии ДК совпало с клинической ремиссией после 1,5 мес. назад закончившимся обострением PC, что нашло отражение в его иммунологическом статусе. У больного наблюдалось увеличенное относительное количество Т-хелперов, выраженное снижение абсолютного и относительного количества специфических цитотоксических Т-лимфоцитов. При нормальном количестве В-лимфоцитов было увеличено относительное и абсолютное количество аутореактивных В-лимфоци-тов (CD19+/CD5+). При этом содержание в сыворотке, как иммуноглобулинов всех классов, так и антител к ОБМ, было в пределах нормы. Пролиферативный ответ на основной белок миелина значимо превышал верхнюю границу нормы. Ввиду того, что не были выявлены аутореактивные клоны Т-лимфоцитов (CD4+/CD8+), а количество аутореактивных В-лимфоцитов было повышено почти в 2 раза, можно предположить, что высокий пролиферативный ответ на основной белок миелина был обусловлен пролиферацией В-лимфоцитов, экспрессирующих рецептор к этому антигену. У пациента наблюдались высокие уровни интерлейкинов, продуцируемых, как Т-хелперами 2 типа — IL-6, IL-10 (спонтанная продукция), так и Т-хелперами 1 типа — IL-2 (спонтанная продукция) и IL-1 р (содержание в сывои INF-—. Значимо высокое содержание в сыворотке фактора роста нервов также косвенно подтверждало активность иммунного ответа.

Клиническое улучшение у 2-го больного в процессе терапии IL-10-модифицированными ДК сочеталось с увеличением относительного количества зрелых Т-лимфоцитов, при этом за счет снижения количества лимфоцитов наблюдалось уменьшение абсолютного количества Т-хелперов, нормализация спонтанной продукванная продукция IL-6 на фоне терапии увеличилась почти в два раза. Наблюдалась супрессия индуцированной продукции TNF-—, IL-1 р и IL-1 Ra. В результате терапии также отмечалось снижение индуцированной шением его содержания в сыворотке. К концу наблюдения индуцированная продукция хемокина IL-8 возросла, при этом содержание в сыворотке этого цитокина в несколько раз превысило верхнюю границу нормы, что является признаком активности локального воспалелось с высоким уровнем спонтанной продукции IL-10 — фактора, обладающего плейотропным супрессивным действием. В результате терапии увеличилось как абсолютное, так и относительное количество Т-регуля-торных лимфоцитов, снизилось как абсолютное, так и относительное количество NK-клеток, активированных NK-клеток и TNK-клеток, дубль-позитивных Т-лимфоцитов, значимо снизился уровень BDNF-— в сыворотке крови. К концу терапии произошла нормализация абсолютного числа аутореактивных В-лимфоцитов, ответа на ОБМ (15 мг/мл) в культуре лимфоцитов.

Общим в изменении иммунологического статуса обоих пациентов с PC в процессе терапии аутогенными IL-10-модифицированными ДК стало увеличение абсолютного и относительного числа Т-регуляторных TNF-—, INF-y, IL-Ю, подъем с последующим снижением спонтанной продукции TNF-—, IL-8, INF-y, спонтанной и индуцированной продукции, содержания в сыворотке крови IL-4.

Таким образом, проведенное исследование позволяет сделать ряд выводов.

1. Введение под кожу в область спины аутогенных вызывает каких-либо побочных отрицательных реакций у больных с вторично-прогрессирующим течением PC.

2. Терапия IL-10-модифицированными ДК у части пациентов с PC дает достаточно определенный и значимый клинический эффект, сравнимый по выраженности с воздействием кортикостероидной терапии.

3. В процессе терапии IL-10-модифицированными ДК позитивные изменения в неврологическом статусе у пациентов с PC могут сопровождаться МРТ- и иммунологическими признаками временной активации воспалительных процессов в головном мозге.

4. Ответ иммунной системы больных с PC на введение аутогенных IL-10-модифицированных ДК, в отличие от клинического эффекта, имеется всегда; при этом он достаточно разноплановый, характеризующийся абсолютным и относительным увеличением содержания в периферической крови Т-регуляторных клеток.

5. Необходимо проведение дальнейших клинических испытаний для уточнения показаний к данному виду терапии больных с PC.

Подняться вверх сайта