Поиск Кабинет

Анализ миофибробластов крысы, полученных из структур портальных трактов печени методом эксплантации

Гены & Клетки: Том VIII, №3, 2013 год, стр: 119-124

 

Авторы

Миянович О., Катина М.Н., Ризванов А.А., Киясов А.П.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

На сегодняшний день не существует эффективных способов лечения фиброза печени и единственным выхо дом является пересадка донорского органа. Исследование молекулярно-клеточных механизмов развития фиброза в печени может способствовать выявлению новых способов замедления, а, возможно, и обращения вспять процессов фиброгенеза в печени. Длительное время клетки Ито не заслуженно считались основными виновницами развития фиброза печени, так как рассматривались как главные предшественницы миофибробластов, которые осуществля ют синтез соединительнотканного внеклеточного матрикса. В данной работе методом эксплантации была выделена культура мезенхимальных клеток, окружающих желчные протоки. Показано, что полученные клетки являются пор тальными фибробластами, и, как и клетки Ито, в условиях повреждения печени способны in vitro дифференцироваться в миофибробласты, экспрессирующие α-гладкомышечный актин. При длительном культивировании показана возмож ность «перехода» портальных миофибробластов в фибро бласты и наоборот на поздних пассажах. Таким образом, можно сделать вывод о потенциальной возможности об ращения вспять процессов фиброгенеза в печени.

Фиброз печени – это образование локальных или диффузных очагов соединительной ткани в печени. Фиброз развивается в исходе таких широко рас пространенных хронических заболеваний печени, как вирусные гепатиты, алкогольная болезнь пече ни, портальная гипертензия различной этиологии, врожденные и аутоиммунные заболевания печени. Расположение фиброзных септ во многом зависит от вида повреждения печени: они могут быть пор то-портальными в случае хронического билиарного повреждения, порто-центральными при хроническом вирусном гепатите. При некоторых других патологи ческих состояниях образуются и центро-центральные септы [1].

На сегодняшний день единственным эффектив ным способом лечения фиброза и цирроза печени является пересадка донорского органа. Исследова ние молекулярно-клеточных механизмов развития фиброза в печени и происхождение профиброгенных клеток может способствовать выявлению новых па тогенетически обоснованных способов замедления, а, возможно, и обращения вспять процессов фиброгенеза в печени.

Источником внеклеточного матрикса и соеди нительной ткани в печени являются миофибробласты, экспрессирующие α-гладкомышечный актин (α-SMA). Миофибробласты являются быстро про лиферирующими клетками, способными к сокра щению и усиливающими процессы фиброгенеза за счет своего многогранного фенотипического ответа на травму [2]. На настоящий момент до конца не вы яснены источники происхождения этих клеток. На протяжении последних 20 лет считалось, что клет ки Ито являются источником большинства из них. Однако сейчас стало ясным, что миофибробласты способны образовываться и из других типов клеток печени [3]. Предполагаемые источники миофибро бластов печени представлены резидентами печени (клетки Ито и портальные фибробласты), мультипо тентными мезенхимными стромальными клетками костного мозга и клетками, образующимися в ре зультате эпителиально-мезенхимального перехода (АФП+прогениторные клетки, из которых происхо дят гепатоциты и холангиоциты) [4].

Согласно литературным источникам, миофи бробласты преимущественно происходят из клеток Ито и портальных фибробластов путем активации и трансдифференцировки [5, 6]. В последние годы особое внимание уделяется портальным фибробла стам – клеткам, окружающим структуры портального тракта (портальная вена и артерия с их стенками, содержащими гладкомышечные клетки, и желчный проток с его базальной мембраной) и находящимся в непосредственном контакте с первым слоем гепа тоцитов и непаренхимных клеток [7].

Другими потенциально фиброгенными клетками могут быть клетки второго слоя, расположенные во круг центральных вен, а также гладкомышечные клет ки сосудов (печеночной артерии и портальной вены) и клетки костномозгового происхождения [8–10].

Были выдвинуты две основные гипотезы. Первая из них говорит о том, что, возможно, портальные фи бробласты, так же как и гладкомышечные клетки, про исходят из дуктальной пластинки в процессе эмбрио генеза. По другой версии, клетки Ито и портальные фибробласты могут происходить из некоего общего источника в процессе раннего эмбриогенеза. Суще ствует мнение, что во время роста эмбриональной печени мезотелий, состоящий из мезотелиоцитов и субмезотелиальных клеток, мигрирует с поверхности печени внутрь органа и дает начало клеткам Ито и пе риваскулярным мезенхимальным клеткам, включая портальные фибробласты, гладкомышечные клет ки, окружающие портальную вену и фибробласты, расположенные вокруг центральной вены.

Портальные фибробласты как отдельный тип клеток были впервые описаны еще в 1961 г., когда Carruthers с соавт. исследовали с помощью свето вой и электронной микроскопии портальные тракты крыс после перевязки желчного протока. Исследо ватели обнаружили пролиферацию фибробластов вокруг вновь сформированных желчных протоков, и сообщили, что фибробласты пораженных порталь ных трактов имели длинные отростки и часто были окружены фибриллами, в том числе и эластически ми волокнами.

Портальные фибробласты гетерогенны и им да вали разные названия, что затрудняло их иссле дование. Портальные фибробласты были много кратно идентифицированы и отдифференцированы от клеток Ито на основании экспрессии различных маркеров, но эти исследования не согласованы и не единообразны для разных исследовательских групп. Миофибробластам также давали различные назва ния по отношению их к портальным трактам. При ис следовании цирроза печени у людей и в моделях на крысах D. Cassiman с соавт. (2002) выделяли три популяции миофибробластов: миофибробласты, од нозначно происходящие из клеток Ито, портальные/ септальные миофибробласты, предположительно происходящие из портальных фибробластов, и по граничные миофибробласты, с промежуточным фе нотипом и неясным происхождением [10].

Миофибробласты желчных протоков способны замещать определенную субпопуляцию мезенхим ных клеток портальных трактов, так же как и глад комышечные клетки стенок ветвей портальных вены и артерий. Было сделано предположение, что ми офибробласты желчных протоков способны проли ферировать и трансдифференцироваться в ответ на перевязку желчного протока, вызывающую перидук тальный и перипортальный (так называемый, «били арный»), фиброз. Предполагалось, что при шисто сомозе гладкомышечные клетки стенок портальных вен пролиферируют и трансдифференцируются в матрикс-продуцирующие миофибробласты, вызывая портальный фиброз. Активируемые, в основном, повреждением печени, портальные фибробласты начи нают пролиферировать (хотя и гораздо медленнее, чем клетки Ито) и продуцировать коллаген I типа во круг портальных трактов [11].

Что касается антигенных свойств клеток, способ ных трансдифференцироваться в миофибробласты, то резидентные мезенхимальные клетки печени, представленные клетками Ито, характеризуются экспрессией десмина и GFAP (глиофибриллярный кислый белок), а также отсутствием гемопоэтиче ских маркеров (CD45, CD34) и Thy-1 (гликофосфа тидилинозитол-связанный гликопротеин на наруж ной мембране клеток, который ранее был обнаружен в фибробластах некоторых органов, CD90). Главным маркером образующихся миофибробластов явля ется наличие в их цитоплазме α-SMA. Миофибро бласты, получаемые в результате эпителиально мезенхимальной трансформации, характеризуются отсутствием экспрессии CD45 и продукцией мар керов гепатоцитов (альбумин, Alb) и холангиоцитов (цитокератин, CK19). Клетки, образующиеся из цир кулирующих клеток костного мозга, представлены CD45+/Coll1+-фиброцитами [12]. Портальные фи бробласты отличаются от клеток Ито тем, что они могут экспрессировать эластин и Thy-1, не накапли вают ретиноиды, не экспрессируют десмин, CD146 и нейральные маркеры (GFAP) [13].

Большинство существующих исследований, посвя щенных фиброзу печени, проводились на клетках Ито и именно они длительное время незаслуженно счи тались основными «виновницами фиброза» печени. Наше исследование было нацелено на иденти фикацию других видов клеток печени, способных дифференцироваться в фибробластическом направ лении и, следовательно, вовлеченных в процессы фиброза.

Материал и методы

Жёлчные протоки выделяли из печени здоро вых четырёхдневных новорожденных крыс (Rattus norvegicus, линия Wistar, Питомник лабораторных животных «Пущино»). Содержание и использование лабораторных животных соответствовало правилам, принятым в КФУ, рекомендациям Локального этиче ского комитета и национальным законам [14]. Экс перимент был проведен на 187 крысах. Животные были умерщвлены декапитацией. Под бинокуляр ным микроскопом Stemi DV4 Carl Zeiss (Германия) создавали операционный доступ (срединный и по перечные разрезы передней брюшной стенки) и да лее, не извлекая печень, выделяли желчный проток. Выделенный жёлчный проток механически очища ли от паренхимы печени под микроскопом с помо щью стерильных инструментов. Выделенный желч ный проток помещали целиком в отдельную лунку 6-луночного планшета в питательную среду DMEM с добавлением 10% FBS, 200 mM L-глутамина и антибиотика. В других экспериментах желчные про токи, измельченные на фрагменты размером около 3 мм3, помещали в 24-луночные планшеты. При до бавлении питательной среды следили за тем, чтобы образец желчного протока был наполовину погружен в питательную среду, а на другую половину оставал ся на поверхности для улучшения адгезии фрагмента ткани к культуральному пластику за счет сил поверх ностного натяжения, а также для того, чтобы дать возможность всем клеткам, обладающим свойствами адгезии, мигрировать (эксплантироваться) из фраг мента на культуральный пластик и начать активное деление [15]. В 6- и 24-луночных планшетах на 3 сут. убирали фрагменты тканей и заливали их по стандартной методике в парафин или среду для заморозки тканей NEG 50 (ThermoScientific). По мещенные в NEG 50 образцы сразу замораживали при -800C и использовали для изготовления тонких срезов (5 мкм) на микротоме-криостате НМ560 Cryo-Star (Carl Zeiss, Германия). В оставшихся чаш ках меняли среду на свежую. Последующие замены питательной среды проводили каждый второй день.

В 24-луночных планшетах проводили иммуноцито химические реакции культур клеток с антителами, указанными в таблице, на 3, 5, 7, 12 сут. Для визуа лизации результатов использовали систему Novolink (Novocastra, Великобритания) с колориметриче ским субстратом аминоэтилкарбазол (АЭК). Ядра окрашивали гематоксилином по стандартной мето дике. Анализ препаратов проводили на микроскопе AxioOberver.Z1 (Carl Zeiss, Германия). В 6-луночных планшетах на 3, 5, 7 и 12 сут. клетки лизировали для получения образцов общего белка для после дующего анализа экспрессии белков с помощью вестерн блоттинга. Визуализацию иммунного преци питата проводили с помощью набора для хемилюминесцентной детекции белка Amersham™ ECL™ Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Детекцию люминесценции прово дили на приборе ChemiDoc™ XRS+ System (Bio-Rad, Сингапур). Часть клеток в 6-луночных планшетах по сле удаления фрагмента ткани (3 сут.) продолжали культивировать (пассаж 0) и на 7 сут. клетки пасси ровали и рассевали в 25 cm2 чашки на стандартную питательную среду. Каждый второй день проводили замену питательной среды на свежую. При достиже нии 80% конфлуентности монослоя клетки пассиро вали. Клетки каждого пассажа рассевали в 24-лучно ные планшеты и проводили иммуноцитохимические реакции с антителами, указанными в таблице, на 3, 5, 7 и 12 сут. Клетки нулевого пассажа (первичную культуру) на 7 сут. также собирали для изучения ме тодом проточной цитофлуориметрии. Для выявления внутриклеточных антигенов клетки фиксировали в коммерческом реактиве CellFix (Becton Dickenson) на основе формальдегида 30 мин при 4°С, пермоби лизировали мембрану 0,1% раствором Tween-20 в PBS в течение 10 мин. Для окрашивания мембран ных антигенов пермобилизацию мембраны не прово дили, а фиксация клеток осуществлялась после всей процедуры окраски (постфиксация). Результаты ана лизировали на проточном цитофлуориметре Guava easyCyte 8HT (Millipore).

Результаты и обсуждение

Наше исследование было посвящено миофи бробластам портальных трактов, образующимся из портальных фибробластов при альтерации печени. В здоровой печени портальные фибробласты с точки зрения морфологии и антигенной структуры иден тичны другим фибробластам. Это веретеновидные клетки мезенхимального происхождения, присут ствующие в портальных трактах. В нормальных ус ловиях они участвуют в физиологическом обмене компонентов внеклеточного матрикса и не экспрес сируют α-SMA [13]. Происхождение портальных фибробластов, как и клеток Ито, по-прежнему до конца не определено и вызывает много дискуссий. Считается, что портальные фибробласты, точно так же, как это было показано для клеток Ито, в усло виях хронического повреждения печени способны дифференцироваться в миофибробласты, экспрес сирующие α-SMA, и это может быть воспроизведено in vitro при культивировании портальных фибробла стов на культуральном пластике или стекле [5].

В данной работе описано получение портальных миофибробластов из портальных фибробластов, которые, в свою очередь, были получены методом эксплантации из структур жёлчных протоков. Другие авторы описывают иные методы получения культу ры портальных миофибробластов, основанные пре имущественно на ферментативной очистке структур желчного протока от фрагментов паренхимы печени [16]. Объектом большинства исследователей тради ционно является гепатоцит, однако сейчас становит ся ясно, что другие клетки негепатоцитарного ряда играют огромную роль в функции печени в норме и при патологии. В последние годы возрос интерес к пониманию эмбрионального происхождения этих клеток и механизмов их развития [17]. Именно поэтому для данного исследования использовались молодые животные (крысы в возрасте 4 сут.), что связано с тем, что эмбриональное развитие печени у этих животных длится до 2 нед. после рождения. Мы показали, что in vitro при повреждении (в дан ном конкретном случае – при механическом повреж дении в процессе выделения протока) активируются портальные фибробласты и другие фибробласты, полученные нами в культуре, образовавшиеся из различных предшественников, которые также мог ли сохраняться в фрагменте ткани вокруг желчного протока. Активированные фибробласты способны к образованию миофибробластов до 3 сут. культиви рования. Методом проточной цитометрии было по казано, что в популяции клеток, выделенных нами из желчных протоков, встречалось лишь немного дес мин-позитивных клеток (7%), что свидетельствует о том, что желчный проток был тщательно очищен от паренхимы печени и миофибробласты, образующи еся из клеток Ито (МФ-Ито), не попали в культуру (рис. 1Б). Об этом же свидетельствует и иммуноци тохимическое исследование на десмин культур кле ток нулевого, первого и второго пассажей, где только единичные клетки являлись МФ-Ито (рис. 2).

После окрашивания на Thy-1 клеток, получае мых из эксплантов желчного протока, получали две морфологически различные популяции клеток – ку бовидные и веретеновидные клетки (рис. 2Д) [18]. Методом проточной цитометрии было показано, что около 40% клеток первичной культуры, полученной методом эксплантации из фрагмента желчного про тока, были Thy-1-позитивными. В ряде исследова ний Thy-1 описывается как маркер клеток желчных протоков и печеночных прогениторных клеток, в то время как другие исследователи считают, что попу ляция Thy-1 позитивных клеток гетерогенна. Также имелись сообщения об экспрессии маркеров ме зенхимальных клеток, таких как α-SMA и десмин, в группе Thy-1-позитивных клеток. Исследование популяции клеток, выделенных из тканей жёлчных протоков, подтвердило, что портальные миофибро бласты являются Thy-1-позитивными клетками, в то время как гепатоциты, клетки Ито и печеночные ма крофаги не экспрессировали этот маркер на своей поверхности. Таким образом, Thy-1 можно назвать основным поверхностным маркером для идентифи кации портальных миофибробластов in vivo и in vitro [19]. На 7 сут. культивирования первичные культуры клеток, полученные методом эксплантации, окраши вали методом иммуноцитохимии и проводили про точную цитометрию на α-SMA. Было показано, что к этому времени уже 67% клеток экспрессировали маркер миофибробластов – α-SMA (рис. 1А). При дальнейшем культивировании (первый, второй пас саж) α-SMA не экспрессировался, что говорит о том, что все клетки превратились в фибробласты (рис. 2Ж). Интересные результаты были получены при длительном культивировании клеток желчных про токов. Так, было показано, что на четвертом пассаже все клетки в культуре по морфологическим и анти генным свойствам являлись фибробластами. В то же время, при более длительном культивировании клет ки начинали экспрессировать α-SMA, что говорит о процессе их дифференцировки в миофибробласты. Полученные данные подтверждают ранее выдвину тую теорию о возможности дифференцировки фи бробластов в миофибробласты (рис. 3А, Б). Экс прессии цитокератина 18 и 19 не было выявлено, что позволяет утверждать, что полученные клетки были неэпителиального происхождения (рис. 2З, И). Отсутствие экспрессии альбумина и α-фетопротеина было показателем того, что полученные клетки не были зрелыми гепатоцитами [20].

Исходя из полученных данных, можно сделать вы вод о том, что использованным методом можно полу чить портальные миофибробласты и исследовать их. При культивировании фрагмента желчного протока происходит экскреция из него различных биологиче ски активных веществ, синтезируемых различными типами клеток, паракринным и аутокринным путями способствующих активации клеток желчного про тока, их эксплантации на культуральный пластик и дифференцировке портальных фибробластов в мио фибробласты [21]. Непонятно, существуют ли раз личные стадии дифференцировки/активации одной и той же клеточной популяции или же существуют клеточные типы с частично перекрывающимся фе нотипом [22]. По литературным данным, в культуре портальных миофибробластов, так же как миофи бробластов из клеток Ито, клетки способны воз вращаться в исходное состояние, однако остается неизвестным, происходит ли это в сколько-нибудь значимых масштабах in vivo (например, при регрессе фиброза печени) [23–25]. Во-первых, необходимо исследовать гетерогенность популяции портальных мезенхимных клеток; во-вторых, необходимо лучше разобраться в различиях между клетками Ито и портальными фибробластами, чтобы определить вклад каждого типа клеток в развитие фиброза печени, что позволит разрабатывать методы лечения фиброза на основе влияния на клеточно-молекулярные механизмы его развития [23].

Подняться вверх сайта