Поиск Кабинет

Алгоритм работы Московского банка- регистра стволовых клеток

Гены & Клетки: Том VIII, №2, 2013 год, стр.: 69-74

 

Авторы

Кобзева И.В., Астрелина Т.А., Яковлева М.В., Карпова Е.Э., Круглова Я.А., Лебедева Л.Л., Пухликова Т.В., Чумак А.А., Ставцев Д.С., Гомзяков А.Е., Боякова Е.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Прогресс в области трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) пуповинной крови неразрывно был связан с развитием банков пуповинной крови, созданных для обеспечения систематического сбора, тестирования, обработки, хранения, организации подбора и выдачи образцов пуповинной крови для трансплантации. Целью исследования была разработка алгоритма работы Московского банка-регистра безвозмездных неродственных доноров ГСК пуповинной крови. В статье охарактеризованы биологические характеристики всех образцов пуповинной крови, внесенные в регистр безвозмездных доноров Московского банка стволовых клеток (на 1 криоконсервированный образец пуповинной крови). Показано, что небольшое количество безвозмездных неродственных доноров ГСК пуповинной крови в базе данных регистра позволяет подобрать совместимую (6/6) пару донор-реципиент с частотой вероятности 1:151. Предложенный алгоритм работы Московского банка-регистра рекомендуется использовать при создании, усовершенствовании и работе других банков-регистров безвозмездных неродственных доноров ГСК пуповинной крови.

На сегодняшний день во многих странах мира пуповинная кровь (ПК) стала одним их наиболее востребованных альтернативных источников гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) благодаря ее уникальным свойствам, относительной простоте и безопасности заготовки, развитию глобальной сети банков ПК и улучшению качества подборов неродственных доноров ГСК[1–4]. Ежегодно в мире проводится более 2–3 тыс. трансплантаций аллогенных ГСК ПК пациентам с различными заболеваниями, а в 2009 г. впервые число трансплантаций ПК превысило количество трансплантаций костного мозга[5, 6].

Прогресс в области трансплантации аллогенных ГСК ПК неразрывно связан с развитием банков ПК, созданных для обеспечения систематического сбора, тестирования, обработки, хранения, организации подбора и выдачи образцов ПК для трансплантации. На сегодняшний день все банки ПК разделены на государственные банки-регистры, работающие по принципу безвозмездного донорства и создающие накопительный материал для неродственных трансплантаций ГСК, и коммерческие, осуществляющие именное хранение криоконсервированной ПК для внутрисемейного использования. В настоящее вре- мя в мире насчитывается от 100 до 130 банков-ре- гистров неродственных доноров ГСК[7–11], где на криохранение заложено более 600 тыс. полностью тестированных образцов ПК[12, 13]. 46 банков из 30 различных стран мира, в которых криоконсерви- ровано более 500 тыс. единиц ПК, объединены все- мирной организацией доноров костного мозга (Bone Marrow Donors Worldwide – BMDW[11]). Также в Европе существует 18 банков, которые получили аккредитацию в NETCORD-FACT и еще 40 находятся на стадии регистрации[14, 15].

Современная система банков-регистров неродственных доноров ГСК ПК способна в короткие сроки накопить большое количество полностью тестированных и HLA-типированных образцов, что позволяет в короткие сроки создать регистр с набором уникальных гаплотипов[16–18, 10] и подобрать подходящего неродственного донора практически для всех пациентов, нуждающихся в трансплантации аллогенных ГСК.

Цель исследования – разработать алгоритм работы Московского банка-регистра безвозмездных неродственных доноров ГСК ПК.

Материал и методы

В исследование были включены 4683 криоконсервированных образцов ПК, заложенных на криохранение в автоматизированной системе «BioArchive®» (ThermoGenesis, США), прошедших HLA-типирование, тестирование на вирусную и микробную контаминацию и внесенных в регистр неродственных доноров г. Москвы за период с 2004 по 2011 гг. Получение ПК осуществляли у доношенных новорожденных 37–41 нед. гестации при самопроизвольных или оперативных родах при условии подписания матерями в дородовом периоде информированного согласия и отсутствии стандартных общемировых абсолютных противопоказаний. Сбор ПК осуществляли по принятой в роддоме методике в готовую закрытую систему для сбора крови (GreenCross, Южная Корея) объемом 250 мл со стандартным количеством гемоконсерванта CPDA (цитрат + фосфат натрия + декстроза + аденин). Поступившие образцы ПК проходили обязательную регистрацию. Обработка ПК проводилась в асептических условиях с целью уменьшения объема и удаления эритроцитов двумя методами: двойного центрифугирования (МДЦ) с использованием центрифуги «Cryofuge 5500i» и плазмоэкстрактора «AutoVolumeExpressor» и автоматического выделения клеток (МАВК) с помощью клеточного сепаратора «Sepax S1000» (Biosafe, Switzerland). После выделения ядросодержащих клеток непосредственно перед процессом криоконсервации в каждый образец ПК вводили криоконсервирующий раствор ДМСО в сочетании с декстраном-40 в стандартном количестве 5 мл до конечной концентрации 10%. Все обработанные образцы ПК подвергали немедленной криоконсервации в автомотизированном крио- комплексе «BioArchive®».

Проводили тестирование ПК:

1. Оценивали биологические характеристики ПК до криохранения:

а) клеточный состав ПК: количество ядросодержащих (гранулоциты, нормобласты, лимфоциты, моноциты (TNC)) и мононуклеарных клеток (лимфо- циты, моноциты (MNC)) определяли при помощи:

– автоматического гематологического анализатора ABX Pentra 60 C Plus (HORIBA ABX DiagnosticsInc., FRANCE) в режиме автоматической аспирации с определением 26 параметров.

– морфологической оценки мазков, окрашенных по методу Паппенгейма – Крюкова (комбинированная окраска фиксатором-красителем Мая – Грюн- вальда и краской Романовского).

б) количество ГСК ПК оценивали по экспрессии мембранных маркеров в реакции прямой иммунофлюоресценции с моноклональными антителами к CD34 и CD45 при помощи проточной цитометрии в аппарате FACS Calibur («BectonDickinson», США). Количество CD34+-клеток в криоконсервированной ПК оценивалось как 2 параметра: процент от общего количества лейкоцитов и абсолютное количество CD34+-клеток в 1 мл ПК и одном образце.

в) жизнеспособность полученных ядросодержащих клеток ПК оценивали с помощью проникающего в клетку красителя 7-ADD, связывающегося с ДНК, с определением количества CD45+ 7-ADD-негативных клеток на проточном цитофлуометре FACS Calibur.

г) колониеобразующую активность клеток ПК определяли при культивировании клеточной суспензии ПК в метилцеллюлозе в течение 14 сут. при температуре 37°С в СО2-инкубаторе. Производили подсчет количества колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1×105 эксплантированных клеток: КОЕ-mix – смешанные КОЕ, КОЕ-ГМ – гранулоцитарные и макрофагальные КОЕ, КОЕ-Г – гранулоцитарные КОЕ, КОЕ-М – макрофагальные КОЕ, КОЕ-Эр – эритроцитарные КОЕ. Для определения абсолютного количества гемопоэтических предшественников в 1 мл ПК полученные величины КОЕ умножали на число моно- нуклеарных клеток в 1 мл крови.

2. Определяли HLA-генотип образцов ПК. Выделяли ДНК из клеток ПК с использованием автоматизированной системы KingFisher. Проводили молекулярные методы типирования с применением ПЦР обратным дот-блоттингом методом SSO (Sequence Specific Oligonucleotides) и методом с помощью аллель-специфических праймеров (SSP – Sequence Specific Primer).

3. В процессе обработки ПК определяли групповую принадлежность и проводили инфекционный контроль.

Статистическая обработка результатов проводилась для вариационных рядов с параметрическим распределением с помощью однофакторного дисперсионного анализа и оценкой по критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони и тесту Ньюмена – Кейлса; для вариационных рядов с непараметрическим распределением с помощью критериев КрускаллаУоллеса и Манна – Уитни. Для оценки равенства долей использовали Z-тест. Полученные результаты обработаны методами вариационной статистики в программах Microsoft Excel, Microsoft Access, Statisticav 6.0, Biostat с двупольной таблицы при помощи программы «OpenEpi» 2.3 (Open Source Epidemiologic Statistics for Public Health). Различия между сравниваемыми параметрами считали стати- стически значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Ключевым моментом проведения трансплантации аллогенных ГСК ПК является наличие гистосовместимого донора ГСК и скорости его подбора в регистрах неродственных доноров.

За период с 2004 г. по 2011 гг. в Московский банк стволовых клеток поступило 8999 образцов ПК. В процессе тестирования 2182 (24,5%) образца ПК были отбракованы по различным причинам, из них 384 образца оказались инфицированы (101 образец (4,6%) – наличие маркеров вирусов гепатита В и С; 35 образцов (1,6%) – сифилиса; 248 образцов (11,36%) – бактериальная контаминация). 5251 образец ПК (58,4%) был заложен на криохранение. В регистр неродственных доноров ГСК было внесено 4683 образца ПК (52%), прошедших полный инфекционный контроль и типированных по пяти HLA-локусам: HLA-A, -B, -Cw, -DRB, -DQB1, что позволяет оперативно и эффективно осуществлять поиск необходимых образцов ПК.

На каждый образец криоконсервированной ПК был заведен паспорт образца для неперсонифицированного хранения, в котором были показаны биологические характеристики криоконсервирован- ной ПК.

Средний объем образца криоконсервированной ПК составил 20,2±1,2 мл. Клеточный состав, жиз- неспособность ядросодержащих клеток, количество CD34+-клеток и колониеобразующая активность ГСК в криоконсервированных образцах ПК, внесенных в регистр неродственных доноров ГСК, представлены в таблице 1.

При анализе количественного распределения ядросодержащих клеток в криоконсервированных образцах ПК, внесенных в регистр неродственных доноров ГСК, были получены следующие данные: 702 (15%) образца ПК содержали от 36,3 до 99,9×107 ядросодержащих клеток, что позволяет их использовать для трансплантации у пациентов с весом до 30 кг; 2810 (60%) образцов ПК содержало от 100,0 до 199,9×107 ядросодержащих клеток, что дает возможность их трансплантации пациентам весом от 30 до 60 кг; 1171 (25%) образец содержал от 200,0 до 462,8×107 ядросодержащих клеток, что позволяет их использовать для пациентов с весом более 60 кг (рис. 1).

Технология поиска неродственных доноров ПК в Московском банке стволовых клеток основана на подборе пар донор-реципиент, совместимых по 3 генам HLA-системы, и состоит из ряда последовательных этапов, необходимых для получения положительного результата.

Этапы подбора доноров ГСК ПК:

1. «Первичный запрос на поиск ПК» из клинического центра.

2. Подбор всех предварительно совместимых и частично совместимых образцов ПК по 3 генам HLA- системы: A, B и DRB1.

3. Выдача результатов поиска ПК с информацией о биологических характеристиках в клинические центры или другие запрашивающие организации.

4. Запрос из клинического центра, другой запрашивающей организации с просьбой выполнить в подобранных образцах ПК HLA-типирование по локусу HLA-DRB1 по высокому разрешению.

5. Заявка из клинического центра, запрашивающей организации на резервирование или изъятие данных образцов ПК для последующего клинического применение.

6. Повторное подтверждающее HLA-типирование резервированных образцов ПК согласно международным стандартам.

За период с 2006 по 2011 гг. в Московский банк стволовых клеток поступило 454 первичных запроса на поиск ПК из разных клинических поисковых центров. В 403 случаях (88,8%) по первичным запросам были выявлены предварительно совместимые и частично совместимые по 3 генам HLA-системы (A, B и DRB1) образцы ПК. Из них в 241 случае по первичному запросу в базе данных регистра неродственных доноров для реципиентов ГСК были вы- явлены частично совместимые образцы ПК с двумя мисматчами по генам HLA-А или В (4/6), в 122 случаях – с 1 или 2 мисматчами (5/6 и 4/6), в 19 случаях были обнаружены частично совместимые образцы ПК с 1 мисматчем по HLA-A или В (5/6). В 51 случае (11,2%) не удалось обнаружить под- ходящие образцы ПК (рис. 2).

Предварительно совместимые образцы ПК по трем HLA-генам (6/6) были выявлены в 21 случае, из них в 4 случаях дополнительно были обнаружены образцы ПК с 2 мисматчами по генам HLA-A или В (4/6), в 8 – с 1 и 2 мисматчами (4/6 и 5/6), в 7 – с 1 мисматчем по генам HLA-A или В (5/6). Таким образом, в 21 случае (4,6%) с частотой вероятности 1:151удалось подобрать предварительно совместимые образцы ПК, в 156 случаях (34,4%) были обнаружены образцы ПК со степенью совместимости 5/6, в 375 случаях (82,6%) – со степенью совместимости 4/6 (табл. 2). Более частое совпадение результатов HLA типирования неродственного донора ПК и пациента в Московском банке стволовых клеток можно объяснить тем, что криоконсервированная ПК здорового населения Московского региона объединяет единую популяцию жителей Центрального региона РФ (восточнославянских европеоидов) и она востребована в трансплантационных центрах г. Москвы и г. Санкт-Петербурга.

По запросу трансплантационных центров у предварительно совместимых образцов ПК с реципиентом ГСК было выполнено подтверждающее HLA- типирование по высокому разрешению по локусу HLA-DRB1 (highresolution). По международным дан- ным вероятность подбора совместимых доноров ГСК после типирования с высоким разрешением составляет 1:5000[6, 19, 20], в РФ по данным Карельского регистра – 1:700[21]. При анализе HLA-подборов ГСК ПК с учетом гаплотипов в 4 на- циональных банках ПК – Японии, Швеции, Бельгии и Финляндии – показано, что пациенты из этих стран могут подобрать в своем национальном банке ПК 80% HLA-совместимого донора со степенью совме- стимости 5/6, а при перекрестном подборе – 26%[22]. Частота и распределение HLA-гаплотипов в каждом национальном банке ПК значительно раз- личались, что говорило об их уникальном наборе га- плотипов в группах расовых и этнических популяций[22].

Срок подбора ГСК ПК с момента обращения в Московский банк-регистр безвозмездных неродственных доноров ГСК ПК составлял максимум 2 сут., включая типирование с низким и высоким разрешением по локусам HLA-DRB1 у отобранных образцов ПК.

Полученные данные работы Московского банка-регистра неродственных доноров ГСК ПК свидетельствуют об объективной трудности подбора совместимого донора ГСК, обусловленной высоким генетическим разнообразием человеческой популяции, а также рядом других параметров донора, влияющих в конечном итоге на его отбор для реципиента.

Был разработан алгоритм безвозмездного донорства ГСК ПК для работы банков-регистров ПК (рис. 3). После отбора потенциальных доноров ПК и получения информированного согласия в дородовом периоде осуществляли сбор ПК без вмешательства в процесс родов (только после рождения ребенка) и доставляли ее в регистратуру. В регистратуре Московского банка стволовых клеток осуществлялась регистрация поступившей ПК в базе данных. Проводилась первичная отбраковка образцов ПК («чистый» вес меньше 60 грамм, нарушение герметичности мешка, неправильное заполнение документации, наличие тромбов и гемолиза, нарушение температурного режима в процессе хранения и транспортировки являлись критериями первичного исключения). В дальнейшем проводили обработку ПК двумя методами с помощью МДЦ и МАВК. После выделения ядросодержащих клеток все обработанные образцы ПК подвергали немедленной криоконсервации в автоматизированном системе «BioArchive®». Все криоконсервированные образцы ПК подвергались тестированию с определением групповой принадлежности, биологических характеристик, инфекционному контролю, а также проводилось HLA-типирование по 5 генам. В последующем осуществлялась вторичная отбраковка образцов ПК по итогам инфекционного контроля. После паспортизации ПК данные о криоконсервированном образце ПК вносились в регистр безвозмездных доноров ГСК ПК. При получении из клинических центров первичного запроса на поиск неродственного донора ГСК ПК в информационной базе Московского банка стволовых клеток осуществлялся подбор всех предварительно совместимых и частично совместимых образцов ПК по трем генам HLA-системы – A, B и DRB1. В случае совместимости криоконсервированной ПК с реципиентом по 4–6 локусам HLAгенов по запросу лечебных учреждений выполнялось HLA-типирование с высоким разрешением по локусам HLA-DRB1 у отобранных образцов ПК. При полной или частичной совместимости отобранных образцов ПК с реципиентом ГСК осуществлялось их резервирование для запрашиваемого клинического центра, проводилось повторное подтверждающее HLA-типирование резервированных образцов ПК и передача их в клинический центр.

Таким образом, был разработан алгоритм работы Московского банка-регистра безвозмездных неродственных доноров ГСК ПК. Охарактеризованы биологические характеристики всех образцов ПК, внесенных в регистр безвозмездных доноров ГСК ПК Московского банка стволовых клеток (на 1 криоконсервированный образец ПК). Показано, что небольшое количество безвозмездных неродственных доноров ГСК ПК в базе данных регистра позволяет подобрать совместимую (6/6) пару донор-реципиент с частотой вероятности 1:151. Предложенный алгоритм работы Московского банка-регистра безвозмездных неродственных доноров ГСК ПК рекомендуется использовать при создании, усовершенствовании и работе других банков-регистров безвозмездных неродственных доноров ГСК ПК.

Подняться вверх сайта