Поиск Кабинет

Активация С-kit-позитивных прогениторных клеток в поджелудочной железе крысы после частичной гепатэктомии

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 77-79

 

Авторы

Калигин М.С., Плюшкина А.С., Газизов И.М., Шарипова Э.И., Гумерова А.А., Киясов А.П.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Одним из распространенных маркёров стволовых клеток поджелудочной железы является рецептор фактора стволовых клеток C-kit. Установлено, что этот маркёр присутствует в островковых клетках нормальной поджелудочной железы крысы. Однако неизвестно, какие изменения происходят с данной клеточной популяцией при нарушениях углеводного обмена, развивающихся при заболеваниях печени. Поэтому целью нашего исследования стало изучение экспрессии C-kit в клетках поджелудочной железы после частичной гепатэктомии у крыс. Работа выполнена на 27 белых беспородных крысах самцах, которым была проведена частичная гепатэктомия по методике Хиггенса и Андерсона. В ткани поджелудочной железы была изучена экспрессия С-kit, инсулина и глюкагона. В результате эксперимента была установлена экспрессия C-kit в клетках островков и интерстициальных клетках с 3 суток эксперимента, которые, как показали результаты двойного иммуногистохимического окрашивания, экспрессировали также и глюкагон. Таким образом, после частичной гепатэктомии в поджелудочной железе происходит активация С-kit+- прогениторных клеток и начинается их дифференцировка в α-клетки островков Лангерганса.

На сегодняшний день сахарный диабет занимает третье место в структуре заболеваемости и является ведущей причиной инвалидности и смертности в результате развития сосудистых осложнений. Пациенты с диабетом I типа по-прежнему нуждаются в ежедневных инъекциях инсулина. При этом редко удается установить полный контроль над уровнем глюкозы в крови, что ведет к высокому риску развития острых и хронических осложнений сахарного диабета [1]. В качестве альтернативы разрабатываются методы трансплантации целой поджелудочной железы (ПЖ), островков и зрелых β-клеток [2]. Однако трансплантация таких дифференцированных клеток малоперспективна, поскольку через некоторое время после трансплантации они погибают. Выходом из этой ситуации может стать использование клеток-предшественниц эндокриноцитов, которые могли бы поддерживать собственную популяцию и дифференцироваться в зрелые β-клетки.

Одним из претендентов на роль клеток-предшественниц инсулоцитов являются C-kit+ клетки ПЖ [3]. C-kit – трансмембранный рецептор тирозинкиназы (receptor protein tyrosine kinase – RPTK). Взаимодействие С-kit со своим лигандом, фактором стволовых клеток, запускает цепь внутриклеточных реакций, которая приводит к началу транскрипции определенных генов, росту и дифференцировке клеток-предшественниц [4]. Распределение и динамика экспрессии C-kit+-клеток как возможных источников клеток островков ПЖ, в том числе и β-клеток, изучается на различных экспериментальных моделях [5]. Выбор модели частичной гепатэктомии обусловлен ключевой ролью печени в углеводном обмене, нарушения которого, связанные с дефицитом массы органа после 70% гепатэктомии [6], могут вызывать морфофункциональные изменения клеток островков ПЖ, которые остаются неизученными. Кроме того, участившиеся случаи резекции печени в связи с опухолевыми заболеваниями также требу- ют исследования изменений, развивающихся в поджелудочной железе в результате подобных операций. Поэтому целью нашего исследования стало изучение экспрессии C-kit в клетках ПЖ после частичной гепатэктомии у крыс.

Материал и методы

Работа выполнена на 27 белых беспородных крысах самцах, которым провели операцию частичной гепатэктомии по методике Хиггенса и Андерсона. Эксплантацию органов производили через 1, 2, 3, 5 и 7 сут. после операции, материал помещали в 10% нейтральный формалин на 0,2 М фосфатном буфере (рН = 7,4) на 24 ч для фиксации и заливали в парафин по стандартной методике. Срезы ПЖ окрашивали иммуногистохимически с коммерческими антителами к С-kit – маркёру клеток-предшественниц (1:200; клон Т595, Novocastra, Великобритания), инсулину – маркёру дифференцированных β-клеток (1:40; клон 2D11-Н5, Novocastra, Великобритания) и глюкагону – маркёру дифференцированных α-клеток (1:50; кроличьи поликлональные антитела, Novocastra, Великобритания). Иммуногистохимическое окрашивание было проведено непрямым иммунопероксидазным и стрептавидин-биотиновым методами, методом меченых иммунных комплексов, методом амплификации с тирамид-биотином (CSA). Также было проведено двойное иммуногистохимическое окрашивание для выявления экспрессии С-kit и инсулина, глюкагона и инсулина, С-kit и глюкагона.

Морфометрический анализ размеров C-kit+, инсулин+ и глюкагон+ частей островков поджелудочной железы крыс для оценки динамики изменения числа C-kit+-, инсулин+- и глюкагон+-клеток в островках при частичной гепатэктомии проведен с помощью морфометрической окулярной сетки на микроскопе Leica DM 1000 (Германия) при увеличении ×400. Полученные данные подвергали статистической обработке с помощью статистического графического пакета Microsoft Excel.

Результаты и обсуждение 

Результаты исследования показали отсутствие в норме экспрессии C-kit в клетках поджелудочной железы. С 3 сут. эксперимента мы наблюдали слабую экспрессию C-kit в островках Лангерганса (рис. А), а также одиночные C-kit+-клетки в интерстиции (рис. Б). При окрашивании с антителами к инсулину видимых изменений его экспрессии в клетках островков Лангерганса ПЖ крыс выявлено не было.

При изучении экспрессии глюкагона визуально было отмечено увеличение числа α-клеток островков ПЖ. Однако морфометрическое исследование не выявило статистически значимых различий в количестве глюкагон+-клеток в норме и после частичной гепатэктомии. Однако на всех сроках эксперимента мы наблюдали появление множества одиночных глюкагон+-клеток в интерстиции ПЖ. Клетки имели небольшие размеры, округлую или треугольную форму и располагались, главным образом, вблизи протоков и сосудов (рис. В). Можно предположить, что они появлялись компенсаторно в ответ на снижение уровня глюкозы в крови после частичной гепатэктомии [7].

Окрашивание серийных срезов с антителами к С-kit и глюкагону показало, что позитивные по данным антигенам клетки имеют сходные морфологию и локализацию, что позволило предположить, что это могут быть одни и те же клетки. Наша гипотеза была подтверждена результатами двойного окрашивания, когда мы обнаружили в интерстиции С-kit+-клетки, синтезирующие глюкагон (рис. Г). Такие же клетки, экспрессирующие одновременно оба антигена, были обнаружены и в островках на всех сроках эксперимента (рис. Д).

Таким образом, мы установили, что при нарушениях углеводного обмена, вызванных частичной гепатэктомией, в ПЖ появляются клетки, экспрессирующие на своей мембране C-kit, что указывает на активацию стволового компартмента островков поджелудочной железы. С-kit+-клетки появляются в островках Лангерганса и клетках интерстиция. Исходя из этого, можно предположить, что в ПЖ существует две популяции C-kit+-клеток – интерстициальные и островковые – или, что более вероятно, в островках C-kit+-клетки появляются в результате миграции туда интерстициальных C-kit+-клеток. Появление секреции глюкагона в выявленных нами C-kit+-клетках как в интерстиции, так и в островках, позволяет сделать вывод о начале дифференцировки данных C-kit+-прогениторных клеток в α-эндокриноциты, что, как уже было сказано, по-видимому необходимо для компенсации гипогликемии, развивающейся у крыс после частичной гепатэктомии.

Ранее было показано, что в процессе дифференцировки C-kit+-клеток-предшественниц инсулоцитов они сначала начинают синтезировать глюкагон, а затем – инсулин [8]. Однако нам не удалось установить секреции инсулина в данных клетках. Вполне вероятно, что такой уровень дифференцировки достигается C-kit+-клетками на более поздних сроках, уже после нормализации углеводного обмена.

Подводя итог, можно сделать вывод, что С-kit является удобным маркером, позволяющим выявлять активацию прогениторных клеток-предшественниц эндокриноцитов ПЖ на различных моделях. Использование данного маркера так же перспективно для выделения и культивирования прогениторных клеток из ПЖ для разработки методов клеточной терапии заболеваний этого органа.

Подняться вверх сайта